本发明属于胃蛋白酶技术领域，具体为一种胃蛋白酶内毒素的去除方法。
背景技术：
胃蛋白酶是自猪胃粘膜中提取而得，是一种消化性蛋白酶，由胃部中的胃粘膜主细胞所分泌，功能是将食物中的蛋白质分解为小的肽片段，目前，药用胃蛋白酶一般是从猪胃粘膜中提取而得，用于消化不良。胃膜素是猪胃粘膜消化提取制得的粘蛋白，有抗胃蛋白酶分解和弱抗酸作用，能在胃内形成膜，覆盖溃疡面，减少胃酸的刺激，有利于溃疡面的愈合。
随着客户对胃蛋白酶产品的质量要求越来越高以及产品的应用越来越广泛，传统工艺生产的胃蛋白酶质量已不能满足客户的需求，传统工艺制备的产品含有大量的内毒素，内毒素会引起人体发热反应、白细胞减少以及内毒素休克，由于药品用途不断扩展及剂型的不断改进，客户对内毒素限量有了新的要求。常用内毒素去除的方法有活性炭吸附法、高温烘烤法、碱消毒法、柱层析法，但这些方法都存在一定缺陷，活性炭吸附法在吸附内毒素的同时会吸附大量的产品导致产品收率损失大；高温烘烤法只适合耐高温的产品，胃蛋白酶在高温下几乎完全失活；碱消毒法适合耐碱的产品，而胃蛋白酶在ph＞5时就会失活，不适合碱液处理；柱层析法能有效分离去除内毒素，但由于胃蛋白酶等电点为ph1.0，内毒素的等电点也偏酸性，大多在ph2-4，ph太接近，不适合用柱层析分离。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种胃蛋白酶内毒素的去除方法，通过本发明方法可以去除胃蛋白酶中的内毒素，提高胃蛋白酶的安全性及产品收率，扩展其应用领域。
本发明目的通过以下技术方案来实现:
一种胃蛋白酶内毒素的去除方法，包括以下步骤：
1)溶解：取内毒素含量不合格的胃蛋白酶成品，溶于注射用水中，加入氯化钠，搅拌溶解后过滤澄清；
内毒素含量大于2500eu/g为内毒素含量不合格的胃蛋白酶产品。溶于注射用水中不是其它如纯化水或自来水是因为注射用水几乎不含内毒素，若用其它类型的水会引入外源内毒素；加氯化钠的作用是为了后端超滤透析终点的控制，建立透析终点控制方法。
2)超滤：过滤澄清得到的清液用超滤膜浓缩，再加入注射用水重复透析，直至无氯离子；
超滤膜浓缩的作用是减小料液体积，从而减少后续加注射用水的量，提升透析的效率，缩短透析时间，避免操作时间过长，酶活损失。透析1次不能完全将胃蛋白酶从膜中洗涤流穿出来，还有大量产品残留在膜中，需重复透析才能将胃蛋白酶产品完全洗涤出来，从而提升产品的回收率。无氯离子的判断标准采用硝酸银检测氯离子残留，硝酸银与氯化钠反应生成白色的氯化银沉淀，当加入硝酸银溶液变浑浊，说明氯离子还有残留。
3)除菌：采用滤膜除菌过滤；
4)产品冷冻干燥后得到去除内毒素的胃蛋白酶产品。
进一步，步骤1)中，所述注射用水的温度为3-8℃，用量为胃蛋白酶质量的5～20倍。
进一步，步骤1)中，所述氯化钠的浓度为1％～10％，搅拌溶解时间为2-4h。
进一步，步骤1)中，所述过滤澄清采用0.8um及0.45um的滤膜过滤澄清。
进一步，步骤2)中，所述超滤膜的膜孔径为50～500kd；所述注射用水用盐酸调节ph至3-5。胃蛋白酶在此ph条件下很稳定，当ph＞5时，胃蛋白酶会不可逆失活，胃蛋白酶溶解液ph在3-5，如采用纯化水或注射用水透析，随着透析时间的延长，料液ph会逐渐上升，当ph＞5，胃蛋白酶就开始失活，本发明采用ph为3-5的注射用水透析，确保料液ph稳定在3-5，避免了胃蛋白酶因ph变化造成酶活损失，回收率得到保障。
进一步，步骤3)中，所述滤膜为0.1～0.22um。
进一步，所述冷冻干燥为在-40℃以下冷冻2-4h，再升温至40-50℃保温干燥4-8h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种脂多糖和微量蛋白的结合体，是一种相对高分子质量的复合物，由于内毒素具有化学异源性，不同来源的内毒素相对分子质量变化范围可从几千到几万，且由于内毒素的两亲性使得它在水中能够形成缔合物，其缔合物相对分子质量可达400-1000kd，而胃蛋白酶分子量35kd，基于内毒素及胃蛋白酶分子量的显著差异，本发明选用合适分子量的超滤膜处理胃蛋白酶料液，胃蛋白酶因分子量小于超滤孔径而流穿，内毒素因分子量大于膜孔径而被截留，从而达到产品与内毒素分离的目的。
针对胃蛋白酶产品，与常见的内毒素去除方法相比，本发明采用的膜分离法能有效保护酶活，去内毒素效果更显著，可以使胃蛋白酶产品中内毒素含量达到行业标准。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本实施例胃蛋白酶内毒素的去除过程如下：
1、溶解：取胃蛋白酶成品(内毒素含量为20000eu/g)，溶于10倍注射用水(冷却至3-8℃备用)中，加入2％氯化钠，搅拌溶解2h，依次采用0.8um及0.45um滤膜过滤澄清，0.8um先除去大颗粒，再用0.45um除小颗粒。
2、超滤：过滤澄清得到的清液用膜孔径为50kd的超滤膜浓缩，再加入ph为4.0的注射用水(用0.1m盐酸调节ph)重复透析，至硝酸银试剂检测出溶液中无氯离子；
3)除菌：采用0.22um滤膜除菌过滤
4)产品在-40冷冻2h，再升温至40℃保温干燥6h得去内毒素胃蛋白酶。
本实施例制得胃蛋白酶产品内毒素含量为100eu/g，胃蛋白酶产品含量回收率为34％。
实施例2
本实施例胃蛋白酶内毒素的去除过程如下：
1、溶解：取胃蛋白酶成品(内毒素含量为20000eu/g)，溶于10倍注射用水(冷却至3-8℃备用)中，加入2％氯化钠，搅拌溶解4h，依次采用0.8um及0.45um滤膜过滤澄清。
2、超滤：过滤澄清得到的清液用膜孔径为100kd的超滤膜浓缩，再加入ph为4.0的注射用水(用0.1m盐酸调节ph)重复透析，至硝酸银试剂检测出溶液中无氯离子；
3)除菌：采用0.22um滤膜除菌过滤
4)产品在-40冷冻2h，再升温至40℃保温干燥6h得去内毒素胃蛋白酶。
本实施例制得胃蛋白酶产品内毒素含量为500eu/g，胃蛋白酶产品含量回收率为95.5％。
实施例3
本实施例胃蛋白酶内毒素的去除过程如下：
1、溶解：取胃蛋白酶成品(内毒素含量为20000eu/g)，溶于10倍注射用水(冷却至3-8℃备用)中，加入2％氯化钠，搅拌溶解4h，依次采用0.8um及0.45um滤膜过滤澄清。
2、超滤：过滤澄清得到的清液用膜孔径为200kd的超滤膜浓缩，再加入ph为4.0的注射用水(用0.1m盐酸调节ph)重复透析，至硝酸银试剂检测出溶液中无氯离子；
3)除菌：采用0.22um滤膜除菌过滤
4)产品在-40冷冻2h，再升温至40℃保温干燥6h得去内毒素胃蛋白酶。
本实施例制得胃蛋白酶产品内毒素含量为2800eu/g，胃蛋白酶产品含量回收率为95.7％。
实施例4
本实施例胃蛋白酶内毒素的去除过程如下：
1、溶解：取胃蛋白酶成品(内毒素含量为20000eu/g)，溶于10倍注射用水(冷却至3-8℃备用)中，加入2％氯化钠，搅拌溶解4h，依次采用0.8um及0.45um滤膜过滤澄清。
2、超滤：过滤澄清得到的清液用膜孔径为100kd的超滤膜浓缩，再加入ph为6.0的注射用水(用0.1m盐酸调节ph)重复透析，至硝酸银试剂检测出溶液中无氯离子；
3)除菌：采用0.22um滤膜除菌过滤
4)产品在-40冷冻2h，再升温至40℃保温干燥6h得去内毒素胃蛋白酶。
本实施例制得胃蛋白酶产品内毒素含量为550eu/g，胃蛋白酶产品含量回收率为23.8％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。