一种微生物普适固定化发酵装置

1.本实用新型属于发酵设备技术领域，具体涉及一种发酵装置，用于膜及表面功能化膜材料固定化微生物发酵。


背景技术：

2.现代的固定化细胞技术是在固定化酶技术的推动下而发展起来的。karel等将它定义为把游离细胞通过化学或物理手段固定在限域空间内，减少环境对生物的影响，并使其尽可能的保持相关活性，进而能被重复和连续使用的一种新兴生物技术。细胞固定化技术有着小型高效、反应操作简便、能长时间保持细胞活力，可以反复利用、稳定性好、耐受性强等特点。其在生物化工、食品工程、环境工程、生物医学等领域有着重要的应用。其中，固定化细胞膜生物反应器在缓解底物和产物抑制方面及产物高效分离方面具有明显的优势，因此受到国内外研究人员的格外关注。然而，现有的传统搅拌式发酵罐直接将膜投入发酵罐中容易缠绕搅拌轴，将膜装置外接发酵罐又损失大量能耗，不适合用于固定化细胞发酵。


技术实现要素：

3.本实用新型提供一种新的普适化发酵装置，用于膜及改性膜固定化微生物发酵，通过外接固定化装置实现一种微生物普适固定化发酵装置，进而促进其在细胞固定化膜生物反应器上应用。
4.为了实现上述目的，本实用新型设计了一种用于微生物普适固定化发酵的装置，所述发酵装置设计为可拆卸的金属框架
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搅拌组合体用于固定化发酵，进而促进其在细胞固定化膜生物反应器上广泛应用，可以将大肠杆菌e.coli、琥珀酸放线菌actinobacillus succinogenes 130z、季也蒙毕赤氏酵母meyerozyma guilliermondii等不同微生物固定在膜上并放置在设计好的固定化的发酵装置进行发酵试验。（琥珀酸放线菌actinobacillus succinogenes 130z 来源于美国模式培养物集存库american type culture collection）
5.本实用新型采取如下技术方案：
6.（1）微生物普适固定化发酵装置的设计
7.微生物普适固定化发酵装置，所述发酵装置包括发酵罐本体，还包括金属框架、消泡器、搅拌装置；所述发酵罐本体与金属框架可拆卸连接，金属框架和搅拌装置二者结合在一起，金属框架由搅拌装置两端固定，采用膜或表面功能化膜作为固定化材料，所述固定化材料装入到金属框架内。金属框架为不锈钢材质，装置为圆柱型，上方镂空，中间可放置所需用来作为固定化发酵的材料，四周为网络状结构，可以满足材料充分接触培养基，底部钻孔，底部钻孔的大小与发酵罐搅拌轴的直径大小相当，上下端分别由搅拌轴和消泡器固定；无需整体设计发酵罐，可外加搭建，体积小，结合更紧密，提高发酵效率，且价格低，方便维修，方便清洗。
8.可拆卸的金属框架
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搅拌组合体：搅拌装置由搅拌轴、电机和搅拌桨组成，金属框架底部穿孔与搅拌轴相连。
9.发酵罐本体上端设置有取样口和ph检测口。
10.（2）微生物普适固定化发酵装置在微生物固定化发酵中的应用
11.a.材料的选择
12.固定化材料大类可分为无机（陶瓷、二氧化硅、氧化铝等）和有机高分子（聚丙烯、聚乙烯、聚醚砜、聚偏氟乙烯等）平板膜、中空纤维膜、无纺布膜、纳米纤维膜材料，后者拥有抗微生物分解性能好，机械强度高，化学性能稳定等特点。将固定化材料装入到金属框架内，进行固定化发酵，本装置适用范围广。这里我们选择聚偏氟乙烯中空纤维膜为发酵应用的特例进行阐述介绍。相对于传统材料，聚偏氟乙烯中空纤维膜作为载体材料进行细胞固定化存在许多优点。1、提供了高的表面积和孔隙率，为底物扩散提供了高的传质速率；2、固定化无需共价交联或离子键，根据生物反应器的主要条件，简单得在膜壁内外扩散；3、固定化前制备膜，在不损害细胞活力和生产力的前提下，可灵活改变支架结构。
13.b.细菌负载量测试
14.分别将未改性/改性聚偏氟乙烯中空纤维膜进行摇瓶发酵，发酵前后先用纯水清洗再用冷冻干燥机烘干6h,测其重量。
15.c.发酵罐发酵
16.分别游离菌株发酵、细菌固定在改性聚偏氟乙烯但不用此发酵装置进行厌氧发酵和细菌固定在改性偏氟乙烯中空纤维膜用此发酵装置进行厌氧发酵。
17.在5l发酵罐发酵实验中，改性中空纤维膜固定化细菌发酵产琥珀酸的产率和产率分别为67.4g/l、0.82 g/g，与游离菌发酵相比分别提高了17%和9%。糖的相对自由消耗量增加了16克，副产物也相对减少。
18.有益效果：
19.（1）本实用新型设计用于材料固定化细胞发酵用的发酵罐装置，无需整体设计，只通过设计制备可拆卸金属框架，外加搭建，灵活地将可拆卸金属框架与搅拌棒结合在一起。
20.（2）具有很好的普适性，适用于绝大多数基材，只需要将基材放进金属框架，即可实现固定化细胞发酵。
21.（3）装置体积小，固定化细胞与发酵液结合更紧密，提高发酵效率，且价格低，方便维修，方便清洗。
附图说明
22.图1发酵罐装置图；
23.图2 载入材料发酵罐装置图；
24.图3细菌负载量干重变化图；
25.图4 琥珀酸放线菌actinobacillus succinogenes 130z发酵对照图：(a)(d)游离菌株发酵；(b) (e) 细菌固定在改性聚偏氟乙烯但不用此发酵装置进行厌氧发酵；(c) (f)和细菌固定在改性偏氟乙烯中空纤维膜用此发酵装置进行厌氧发酵；
26.图5 重复性发酵实验。
27.其中：1
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取样口，2
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电动机，3
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ph检测口，4
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消泡器，5
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金属框架，6
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搅拌装置，7
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中空纤维膜材料放大图。
具体实施方式
28.实施例1微生物普适固定化发酵装置
29.如图1所示，发酵装置包括发酵罐本体，还包括取样口1，电动机2、ph检测口3，消泡器4，金属框架5，搅拌装置6，其金属框架和搅拌装置二者结合在一起，金属框架为不锈钢材质，装置为圆柱型，上方镂空，中间可放置所需用来作为固定化发酵的材料，四周为网络状结构，可以满足材料充分接触培养基，底部钻孔大小为发酵罐搅拌轴的直径，金属框架上下端分别由搅拌轴和消泡器固定。
30.实施例2
31.发酵罐由发酵罐本体与金属框架可拆卸连接，其金属框架和搅拌装置二者结合在一起。使用时可将所需要的固定化细胞的基材放入金属框架内，材料装入量适中，以不超过金属框架为最佳。
32.所述固定化材料可以为无机材料，也可以为有机高分子材料，无机材料包括但不限于陶瓷、二氧化硅、氧化铝；有机高分子材料包括但不限于聚丙烯、聚乙烯、聚醚砜、聚偏氟乙烯等）平板膜、中空纤维膜、无纺布膜、纳米纤维膜材料；有机高分子材料具有抗微生物分解性能好，机械强度高，化学性能稳定等特点，以下实施例，选择聚偏氟乙烯中空纤维膜为发酵应用的特例进行阐述介绍。
33.实施例3 以聚偏氟乙烯中空纤维膜为固定化材料的发酵
34.分别将未改性/改性聚偏氟乙烯中空纤维膜装入金属框架，进行摇瓶发酵，发酵前后先用纯水清洗再用冷冻干燥机烘干6h,测其重量。结果显示，改性聚偏氟乙烯中空纤维膜干重比拜变化是未改性的8.5倍，表明改性聚偏氟乙烯中空纤维膜有利于细菌的吸附。
35.改性聚偏氟乙烯中空纤维膜的改性方法见专利cn 109847603 a，采用了生物表面活性剂介导的表面涂覆改性技术，单因素实验确定了最佳改性条件：在温度为25℃，转速为200 rpm条件下，鼠李糖脂的浓度为0.5 g/l，时间为4h。
36.实施例4
37.分别为游离菌株发酵、细菌固定在改性聚偏氟乙烯但不用此发酵装置进行厌氧发酵和细菌固定在改性偏氟乙烯中空纤维膜用此发酵装置进行厌氧发酵。发酵温度37℃，初糖浓度为50g/l过程中通入无菌co2气体并用30%碳酸钠溶液控制ph在6.86，转速150r/min。每隔6h取5ml发酵液测od
600
，离心取上清液检测残糖浓度，通过液相色谱分析测产物，对比130z固定化前后发酵生长情况。
38.从图4 (a), (d)可以看出，游离菌发酵的前24小时，50g/l的葡萄糖被消耗殆尽。当碳源耗尽后，再次加入葡萄糖。发酵66h后，葡萄糖浓度保持7g/l，菌体不再消耗底物，发酵完成。6 h时od600最大达7.07，琥珀酸产量和产率分别为57.6 g/l、 0.75 g/g。图4 (b), (e)为未用此发酵装置固定化发酵结果，与游离菌发酵相似，补糖后当葡萄糖浓度为7g/l时发酵完成，不再增加产物有机酸产量。原因可能是聚偏氟乙烯中空纤维膜在固定化过程中表面细菌收到搅拌的影响容易脱落。图4 (c), (f)为用此发酵装置进行的中空纤维膜表面固定化细胞发酵，在发酵过程中，一部分细菌在游离发酵液中，大部分附着在中空纤维膜表面和致密孔隙中。因此，od值是一个缓慢上升的过程，在48h时最大od值达到7.02。改性中空纤维膜菌固定化发酵时间为66h。琥珀酸产率和产率分别为67.4g/l、0.82 g/g，与游离菌发酵相比分别提高了17%和9%。糖的相对自由消耗量增加了16克，副产物也相对减少。
39.改性聚偏氟乙烯中空纤维膜的改性方法见专利cn 109847603 a，采用了生物表面活性剂介导的表面涂覆改性技术，单因素实验确定了最佳改性条件：在温度为25℃，转速为200 rpm条件下，鼠李糖脂的浓度为0.5 g/l，时间为4h。
40.实施例5
41.为了研究膜固定化生产高浓度丁二酸的稳定性和可持续性，我们在75g/l的高浓度葡萄糖下连续进行了7次分批发酵。生物反应器的性能和任何操作上的挑战都被密切监控。该图为7次试验300h内葡萄糖和琥珀酸的时间浓度分布、od增长曲线。
42.7次重复性发酵实验，在前3批发酵中，发酵效果较好，琥珀酸的产率提高了6%。在后续的发酵过程中，琥珀酸的产率趋于稳定，发酵连续稳定运行。
43.本发明的发酵罐所起作用是作为载体材料的支撑架，将固定化细胞材料固定在发酵罐中，使被固定的细胞在发酵过程中与发酵液充分接触，完成高效发酵。不使用该发酵装置，固定化发酵无法完成，所固定的细胞容易脱落，实验结果与游离菌发酵类似。