抑制或激活γδT细胞的方法与流程

抑制或激活
γδ
t细胞的方法
1.相关申请数据
2.本技术要求2019年6月28日提交的题为“抑制或激活γδt细胞的方法”的澳大利亚专利申请no.2019902308、2019年12月17日提交的题为“抑制或激活γδt细胞的方法”的澳大利亚专利申请no.2019904771和2019年12月17日提交的题为“抑制或激活γδt细胞的方法”的澳大利亚专利申请no.2019904773的优先权。每个申请的全部内容通过引用并入本文。
3.序列表
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技术领域
5.本发明涉及用于抑制或激活γδt细胞的试剂和方法。
6.引言
7.αβt细胞通过由tcr-α和tcr-β基因座编码的t细胞受体(tcr)识别抗原(ag)，tcr结合至由ag呈递分子展示的ag。这一基本原理适用于识别由mhc分子呈递的肽ag的αβt细胞、识别由cd1d呈递的脂质ag的nkt细胞和识别由mr1呈递的维生素b代谢物的黏膜相关恒定t(mait)细胞(j.rossjohn等人(2015))。γδt细胞是一种独特的谱系，其表达来源于单独的可变区(v)、多变区(d)、连接区(j)和恒定区(c)tcr-γ和tcr-δ基因座的tcr。大多数循环的人γδt细胞表达vγ9
+
tcr，并且这些中的大多数与不同类别的ag反应，称为磷酸抗原(pag)(p.constant等人(1994)；y.tanaka等人(1995))。
8.pag是存在于几乎所有细胞生物体中的类异戊二烯生物合成中的中间体。当脊椎动物通过甲羟戊酸途径产生类异戊二烯时，微生物利用了产生化学上不同的pag中间体的非甲羟戊酸途径(l.zhao等人(2013))。vγ9
+
t细胞感知通过任一途径产生的pag，包括来自甲羟戊酸途径的焦磷酸异戊烯酯(ipp)和来自非甲羟戊酸途径的焦磷酸4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基酯(hmbpp)，但对微生物hmbpp的敏感性比对脊椎动物ipppag的高约1000倍(a.sandstrom等人(2014))。因此，它们可以应答来源于微生物感染的hmbpp，但也可以在异常细胞如癌细胞中积累ipp。在细菌和寄生虫感染期间，pag驱动vγ9
+
t细胞产生细胞因子并扩增至占外周血单个核细胞的～10％-50％(y.l.wu等人(2014)；j.zheng等人(2013))。vγ9
+
t细胞在抗细菌免疫中发挥的重要作用通过将人pbmc转移至免疫缺陷小鼠中而得到证实，这导致了vγ9t细胞依赖性的抗细菌感染的保护作用(l.wang等人(2001))。它们还可以在体外以pag依赖性方式杀伤多种肿瘤细胞系，且许多临床试验已经检验了它们的抗癌潜力，并取得了一些令人鼓舞的结果(d.i.godfrey等人(2018))。因此，vγ9
+
γδt细胞代表人类免疫系统的一个关键且非冗余的臂。
9.尽管γδt细胞在保护性免疫中感知pag很重要，但控制pag识别的分子机制尚不清楚。
10.根据前述内容，技术人员将清楚，需要更好地理解控制pag识别的机制以提供可在例如癌症患者或患有慢性感染的患者中诱导或抑制γδt细胞应答的新型免疫疗法和药剂。


技术实现要素：

11.在实现本发明时，本发明人鉴定了表面蛋白嗜乳脂蛋白(butyrophilin)亚家族2成员a1(btn2a1)作为pag反应性γδtcr的新配体。本发明人证明btn2a1表达对于γδt细胞的有效pag应答是必不可少的。本发明人还显示btn2a1与抗原呈递细胞(apc)表面上的btn3a1紧密结合，并且该复合物是必需的并且足以赋予小鼠和仓鼠apc以pag呈递能力。
12.本发明人的这些发现提供了结合btn2a1并增强γδt激活的试剂的基础，以及它们在治疗例如癌症或感染中的用途。
13.本发明人的这些发现还提供了结合btn2a1并破坏γδt激活的试剂的基础，以及它们在治疗例如自身免疫性疾病、移植排斥或移植物抗宿主疾病中的用途。
14.因此，本发明提供了一种抑制受试者中表达vγ9
+
tcr的γδt细胞激活的方法，该方法包括向受试者施用btn2a1拮抗剂，其中btn2a1拮抗剂：
15.i)抑制细胞表面上btn2a1/btn3复合物(例如btn2a1/btn3a1复合物)的形成；
16.ii)抑制btn2a1与vγ9的结合；
17.iii)抑制btn2a1/btn3(例如btn2a1/btn3a1复合物)与vγ9
+
tcr的结合；和/或
18.iv)降低表达btn2a1的细胞的活性和/或存活率(survial)。
19.在一个实施方案中，该方法抑制一种或多种vγ9
+
t细胞亚群激活。例如，该方法抑制vγ9vδ2
+
、vγ9vδ1
+
、vγ9vδ3
+
、vγ9vδ4
+
或vγ9vδ5
+
γδt细胞激活中的一种或多种。在另一个实例中，该方法抑制vγ9vδ2-t细胞激活。例如，该方法抑制vγ9vδ2
+
、vγ9vδ1
+
、vγ9vδ3
+
、vγ9vδ4
+
或vγ9vδ5
+
γδ或vγ9vδ2-t细胞激活中的一种或多种。例如，该方法抑制一种或多种vγ9
+
t细胞亚群的表面上的cd25上调和/或抑制由其产生ifn-γ。在一个实施方案中，该方法抑制vγ9vδ2
+
γδt细胞激活。在另一个实施方案中，该方法抑制vγ9vδ2-γδt细胞激活。在又一个实施方案中，该方法抑制vγ9vδ2
+
γδt细胞和/或vvγ9vδ2-γδt细胞激活。
20.在一个实施方案中，btn2a1/btn3是btn2a1/btn3a1复合物。复合物可以是异聚复合物或多聚复合物。
21.在一个实施方案中，btn2a1和btn3在同一细胞上表达。
22.在又一个实施方案中，btn2a1/btn3a1复合物包含一种或多种另外的分子，例如btn3a2和/或btn3a3。一种或多种另外的分子可以增强γδt细胞激活。
23.在一个实施方案中，该方法抑制γδt细胞的细胞溶解功能、一种或多种细胞因子的产生或增殖中的一种或多种。
24.在一个实施方案中，btn2a1拮抗剂抑制磷酸抗原介导的γδt细胞激活。
25.在一个实施方案或又一个实施方案中，btn2a1拮抗剂抑制btn2a1与btn3a1的缔合，例如，btn2a1拮抗剂抑制btn2a1与btn3a1的直接缔合。
26.在一个实施方案或又一个实施方案中，btn2a1拮抗剂抑制btn2a1与种系编码的vγ9区和/或tcrδ链远端的结合。在一个实施方案中，btn2a1拮抗剂阻止btn2a1与vγ9的构架区和/或包含arg20、glu70和his85中的至少一个的区域结合。btn2a1拮抗剂可阻止与vγ9的abed反平行β-折叠的b、d和e链的外表面上的区域结合。在一个实施方案中，btn2a1拮抗剂结合至比cdr环更靠近cγ结构域的区域。
27.在一个实施方案中，btn2a1拮抗剂抑制btn2a1/btn3复合物与种系编码的vδ2区
(例如tcrδ链的cdr2环和/或tcrγ链的cdr3环)的结合。例如，btn2a1拮抗剂阻止btn2a1与vγ9-jγp编码的cdr3环的vδ2的arg51和lys108附近的区域结合。
28.在一个实施方案中，btn2a1拮抗剂修饰btn2a1分子的一个或多个胞外结构域(igv和/或igc)以将btn2a1分子从刺激性btn2a1转换为非刺激性btn2a1。
29.在一个实施方案或又一个实施方案中，btn2a1拮抗剂修饰btn2a1分子的一个或多个胞外结构域(igv和/或igc)并抑制磷酸抗原激活。例如，btn2a1拮抗剂抑制磷酸抗原与btn2a1和/或btn3分子的胞质结构域(cytoplasmic domain)的结合。
30.在一个实施方案中，btn2a1拮抗剂对btn2a1和btn3分子(例如btn3a1)是双特异性的。在另一个实施方案中，btn2a1拮抗剂与btn3分子(例如btn3a1)交叉反应。在另一个实施方案中，btn2a1拮抗剂是可溶性vγ9
+
tcr。
31.本发明还提供了一种抑制(suppressing或inhibiting)受试者中vγ9
+
γδt细胞应答的方法，其中该方法包括向受试者施用btn2a1拮抗剂，其中btn2a1拮抗剂：
32.i)抑制细胞表面上btn2a1/btn3复合物(例如btn2a1/btn3a1复合物)的形成；
33.ii)抑制btn2a1与vγ9
+
tcr的结合；
34.iii)抑制btn2a1/btn3复合物(例如btn2a1/btn3a1复合物)与vγ9
+
tcr的结合；和/或
35.iv)降低表达btn2a1的细胞的活性和/或存活率(survial)。
36.在一个实施方案中，该方法抑制vγ9vδ2
+
、vγ9vδ1
+
、vγ9vδ3
+
、vγ9vδ4
+
或vγ9vδ5
+
γδt细胞应答中的一种或多种。在一个实施方案中，该方法抑制vγ9vδ2
+
、vγ9vδ2
–
、vγ9vδ1
+
、vγ9vδ3
+
、vγ9vδ4
+
或vγ9vδ5
+
γδt细胞应答中的一种或多种。在一个实施方案中，该方法抑制vγ9vδ2
+
γδt细胞应答。在另一个实施方案中，该方法抑制vγ9vδ2-γδt细胞应答。在又一个实施方案中，该方法抑制vγ9vδ2
+
γδt细胞应答和/或vγ9vδ2-γδt细胞应答。
37.在一个实施方案中，btn2a1/btn3是btn2a1/btn3a1复合物。复合物可以是异聚复合物或多聚复合物。
38.在又一个实施方案中，btn2a1/btn3a1复合物包含一种或多种另外的分子，例如btn3a2和/或btn3a3。一种或多种另外的分子可以增强γδt细胞激活。
39.在一个实施方案中，该方法抑制γδt细胞的细胞溶解功能、一种或多种细胞因子的产生或增殖中的一种或多种。
40.在一个实施方案中，btn2a1拮抗剂抑制磷酸抗原介导的γδt细胞激活。
41.在一个实施方案或又一个实施方案中，btn2a1拮抗剂抑制btn2a1与btn3a1的缔合，例如，btn2a1拮抗剂抑制btn2a1与btn3a1的直接缔合。
42.在一个实施方案或又一个实施方案中，btn2a1拮抗剂抑制btn2a1与种系编码的vγ9区和/或tcrδ链远端的结合。在一个实施方案中，btn2a1拮抗剂阻止btn2a1与vγ9的构架区和/或包含arg20、glu70和his85中的至少一个的区域结合。btn2a1拮抗剂可阻止与vγ9的abed反平行β-折叠的b、d和e链的外表面上的区域结合。在一个实施方案中，btn2a1拮抗剂结合至比cdr环更靠近cγ结构域的区域。
43.在一个实施方案中，btn2a1拮抗剂抑制btn2a1/btn3复合物与种系编码的vδ2区(例如tcrγ链的cdr2环和/或cdr3环)的结合。例如，btn2a1拮抗剂阻止btn2a1与vγ9-jγp编码的cdr3环的arg51和lys108中的至少一个附近的区域结合。
44.在一个实施方案中，btn2a1拮抗剂修饰btn2a1分子的一个或多个胞外结构域(igv和/或igc)以将btn2a1分子从刺激性btn2a1转换为非刺激性btn2a1。
45.在一个实施方案或又一个实施方案中，btn2a1拮抗剂修饰btn2a1分子的一个或多个胞外结构域(igv和/或igc)并抑制磷酸抗原激活。例如，btn2a1拮抗剂抑制磷酸抗原与btn2a1和/或btn3分子的胞质结构域的结合。
46.在一个实施方案中，btn2a1拮抗剂对btn2a1和btn3分子(例如btn3a1)是双特异性的。在另一个实施方案中，btn2a1拮抗剂与btn3分子(例如btn3a1)交叉反应。在另一个实施方案中，btn2a1拮抗剂是可溶性vγ9
+
tcr。
47.本发明还提供了一种抑制体外或离体表达vγ9
+
tcr的γδt细胞激活的方法，该方法包括在btn2a1拮抗剂的存在下培养γδt细胞和表达btn2a1的细胞，其中btn2a1拮抗剂：
48.i)抑制细胞表面上btn2a1/btn3a1异聚复合物的形成；
49.ii)抑制btn2a1与vγ9的结合；
50.iii)抑制btn2a1/btn3a1异聚复合物与vγ9
+
tcr的结合；和/或
51.iv)降低表达btn2a1的细胞的活性和/或存活率。
52.在一个实施方案中，该方法还包括向有需要的受试者施用γδt细胞的步骤。例如，γδt细胞包含工程化受体，例如基因工程化或转基因的t细胞受体。例如，γδt细胞不包含工程化受体，例如基因工程化或转基因的t细胞受体。在又一个实施方案中，γδt细胞是工程化的γδt细胞。这种方法可用于用组织移植物或同种异体血细胞移植物治疗患者。
53.本发明还提供了一种预防、治疗自身免疫性疾病、移植排斥、移植物抗宿主病或移植物抗肿瘤效应、延迟其进展、预防其复发或减轻其症状的方法，该方法包括向有需要的受试者施用btn2a1拮抗剂，施用的量足以预防、治疗受试者自身免疫性疾病、移植排斥、移植物抗宿主病或移植物抗肿瘤效应、延迟其进展、预防其复发或减轻其症状。
54.本发明还提供了一种预防、治疗癌症或感染、延缓其进展、预防其复发或减轻其症状的方法，该方法包括向有需要的受试者施用btn2a1拮抗剂，施用的量足以预防、治疗受试者的癌症或感染、延缓其进展、预防其复发或减轻其症状。
55.本发明还提供了一种激活受试者中表达vγ9
+
tcr的γδt细胞的方法，该方法包括向受试者施用btn2a1激动剂，其中btn2a1激动剂：
56.i)促进细胞表面上btn2a1/btn3(例如btn2a1/btn3a1复合物)的形成；
57.ii)诱导γδt细胞上vγ9
+
tcr的连接；和/或
58.iii)增加表达btn2a1的细胞的活性和/或存活率。
59.在一个实施方案中，该方法激活一种或多种vγ9
+
t细胞亚群。例如，γ9vδ2
+
、vγ9vδ1
+
、vγ9vδ3
+
、vγ9vδ4
+
或vγ9vδ5
+
γδt细胞中的一种或多种。例如，vγ9vδ2
+
、vγ9vδ2
–
、vγ9vδ1
+
、vγ9vδ3
+
、vγ9vδ4
+
或vγ9vδ5
+
γδt细胞中的一种或多种。在一个实施方案中，该方法激活vγ9vδ2
+
γδt细胞。在另一个实施方案中，该方法激活vγ9vδ2-γδt细胞。在又一个实施方案中，该方法激活vγ9vδ2
+
γδ细胞和vγ9vδ2-γδt细胞。
60.在一个实施方案中，btn2a1/btn3是btn2a1/btn3a1复合物。复合物可以是异聚复合物或多聚复合物。
61.在又一个实施方案中，btn2a1/btn3a1复合物包含一种或多种另外的分子，例如btn3a2和/或btn3a3。一种或多种另外的分子可以增强γδt细胞激活。
62.在一个实施方案中，该方法激活γδt细胞的细胞溶解功能、一种或多种细胞因子的产生或增殖中的一种或多种。
63.在一个实施方案或又一个实施方案中，激活的γδt细胞表达cd25、cd40配体(cd40-l)、cd69和cd107a中的一种或多种。
64.在一个实施方案中，btn2a1激动剂不依赖于磷酸抗原结合而激活γδt细胞。
65.在一个实施方案或又一个实施方案中，btn2a1激动剂促进btn2a1与btn3a1的缔合，例如，btn2a1激动剂促进btn2a1与btn3a1的直接缔合。例如，btn2a1激动剂交联btn2a1和btn3a1。
66.在一个实施方案中，btn2a1激动剂对btn2a1和btn3分子(例如btn3a1)是双特异性的。在另一实施方案中，btn2a1激动剂与btn3分子(例如btn3a1)交叉反应。
67.在一个实施方案中，btn2a1激动剂修饰btn2a1分子的一个或多个胞外结构域(igv和/或igc)以将btn2a1从非刺激性btn2a1转换为刺激性btn2a1。
68.本发明还提供了一种诱导或增强受试者中vγ9
+
γδt细胞应答的方法，其中该方法包括向受试者施用btn2a1激动剂，其中btn2a1激动剂：
69.i)促进细胞表面上btn2a1/btn3(例如btn2a1/btn3a1复合物)的形成；
70.ii)诱导γδt细胞上vγ9
+
tcr的连接；和/或
71.iii)增加表达btn2a1的细胞的活性和/或存活率。
72.在一个实施方案中，该方法诱导一种或多种vγ9
+
t细胞亚群。例如，γ9vδ2
+
、vγ9vδ1
+
、vγ9vδ3
+
、vγ9vδ4
+
或vγ9vδ5
+
γδt细胞中的一种或多种。例如，vγ9vδ2
+
、vγ9vδ2-γδ、vγ9vδ1
+
、vγ9vδ3
+
、vγ9vδ4
+
或vγ9vδ5
+
γδt细胞中的一种或多种。在一个实施方案中，该方法诱导vγ9vδ2
+
γδt细胞应答。在另一个实施方案中，该方法诱导vγ9vδ2-γδt细胞应答。在又一个实施方案中，该方法诱导vγ9vδ2
+
γδt细胞和vγ9vδ2-γδt细胞应答。
73.在一个实施方案中，btn2a1/btn3是btn2a1/btn3a1复合物。复合物可以是异聚复合物或多聚复合物。
74.在另一个实施方案中，btn2a1/btn3a1复合物包含一种或多种另外的分子，例如btn3a2和/或btn3a3。一种或多种另外的分子可以增强γδt细胞激活。
75.在一个实施方案中，该方法激活γδt细胞的细胞溶解功能、一种或多种细胞因子的产生或增殖中的一种或多种。
76.在一个实施方案或又一个实施方案中，激活的γδt细胞表达一种或多种激活相关标志物，例如cd25、cd69、cd40配体(cd40-l)和cd107a。
77.在一个实施方案中，btn2a1激动剂不依赖于磷酸抗原结合而激活γδt细胞。
78.在一个实施方案或另一个实施方案中，btn2a1激动剂促进btn2a1与btn3a1的缔合，例如，btn2a1激动剂促进btn2a1与btn3a1的直接缔合。例如，btn2a1激动剂交联btn2a1和btn3a1。
79.在一个实施方案中，btn2a1激动剂对btn2a1和btn3分子(例如btn3a1)是双特异性的。在另一实施方案中，btn2a1激动剂与btn3分子(例如btn3a1)交叉反应。
80.在一个实施方案中，btn2a1激动剂修饰btn2a1分子的一个或多个胞外结构域(igv和/或igc)以将btn2a1从非刺激性btn2a1转换为刺激性btn2a1。
81.本发明还提供了一种激活体外或离体表达vγ9
+
tcr的γδt细胞的方法，该方法包
括在btn2a1激动剂存在下培养γδt细胞和表达btn2a1的细胞，其中btn2a1激动剂：
82.i)促进抗原呈递细胞表面上btn2a1/btn3a1异聚复合物的形成；
83.ii)诱导γδt细胞上vγ9
+
tcr的连接；和/或
84.iii)增加表达btn2a1的细胞的活性和/或存活率。
85.在一个实施方案中，该方法还包括向有需要的受试者施用激活的γδt细胞的步骤。在又一个实施方案中，该方法还包括向有需要的受试者施用工程化γδt细胞的步骤。
86.本发明还提供了一种预防、治疗自身免疫性疾病、移植排斥、移植物抗宿主病或移植物抗肿瘤效应、延迟其进展、预防其复发或减轻其症状的方法，该方法包括向有需要的受试者施用btn2a1激动剂，施用的量足以预防、治疗受试者自身免疫性疾病、移植排斥、移植物抗宿主病或移植物抗肿瘤效应、延迟其进展、预防其复发或减轻其症状。
87.本发明还提供了一种预防、治疗癌症或感染、延缓其进展、预防其复发或减轻其症状的方法，该方法包括向有需要的受试者施用btn2a1激动剂，施用的量足以预防、治疗受试者的癌症或感染、延缓其进展、预防其复发或减轻其症状。
88.本发明还提供了一种btn2a1拮抗剂，其中该btn2a1拮抗剂特异性结合btn2a1并且抑制：
89.i)细胞表面上btn2a1/btn3复合物(例如btn2a1/btn3a1复合物)的形成；
90.ii)btn2a1与vγ9的结合；
91.iii)btn2a1/btn3a1复合物与vγ9
+
tcr的结合；和/或
92.iv)降低表达btn2a1的细胞的活性和/或存活率。
93.本发明还提供了一种btn2a1激动剂，其特异性结合btn2a1并且：
94.i)促进细胞表面上btn2a1/btn3复合物(例如btn2a1/btn3a1复合物)的形成；
95.ii)诱导γδt细胞上vγ9
+
tcr的连接；和/或
96.iii)增加表达btn2a1的细胞的活性和/或存活率。
97.在一个实施方案中，btn2a1拮抗剂或激动剂是包含抗原结合结构域的蛋白质。
98.在一个实施方案中，该蛋白质为：
99.(i)单链fv片段(scfv)；
100.(ii)二聚体scfv；
101.(iii)fv片段；
102.(iv)单域抗体(sdab)(例如，纳米抗体)；
103.(v)二聚抗体、三聚抗体、四聚抗体或更高阶多聚体；
104.(vi)fab片段；
105.(vii)fab'片段；
106.(viii)f(ab')片段；
107.(ix)f(ab')2片段；
108.(x)与抗体的fc区连接的(i)-(ix)中任一项；
109.(xi)与结合免疫效应细胞的抗体或其抗原结合片段融合的(i)-(ix)中任一项；或
110.(xii)抗体。
111.在一个实施方案中，该蛋白质为：
112.(i)单链fv片段(scfv)；
113.(ii)二聚体scfv；
114.(iii)fv片段；
115.(iv)单域抗体(sdab)；
116.(v)纳米抗体；
117.(vi)二聚抗体、三聚抗体、四聚抗体或更高阶多聚体；
118.(vii)fab片段；
119.(viii)fab'片段；
120.(ix)f(ab')片段；
121.(x)f(ab')2片段；
122.(xi)与抗体的fc区连接的(i)-(x)中任一项；
123.(xii)与结合免疫效应细胞的抗体或其抗原结合片段融合的(i)-(x)中任一项；或
124.(xiii)抗体。
125.在一个实例中，本发明的蛋白质是亲和力成熟的、嵌合的、cdr移植的或人源化的抗体或其抗原结合片段。
126.在一个实例中，btn2a1拮抗剂是包含重链可变区(vh)和轻链可变区(v
l
)的抗体，其中重链可变区包含seq id no:100中所示的序列，且轻链可变区包含seq id no:101中所示的序列。
127.在另一个实例中，btn2a1拮抗剂是包含重链可变区(vh)和轻链可变区(v
l
)的抗体，其中重链可变区包含seq id no:108中所示的序列，且轻链可变区包含seq id no:109中所示的序列。
128.在另一个实例中，btn2a1拮抗剂是包含重链可变区(vh)和轻链可变区(v
l
)的抗体，其中重链可变区包含seq id no:116中所示的序列，且轻链可变区包含seq id no:117中所示的序列。
129.在另一个实例中，btn2a1拮抗剂是包含重链可变区(vh)和轻链可变区(v
l
)的抗体，其中重链可变区包含seq id no:124中所示的序列，且轻链可变区包含seq id no:125中所示的序列。
130.在另一个实例中，btn2a1拮抗剂是包含重链可变区(vh)和轻链可变区(v
l
)的抗体，其中重链可变区包含seq id no:132中所示的序列，且轻链可变区包含seq id no:133中所示的序列。
131.在一个实例中，btn2a1拮抗剂是一种包含vh和v
l
的抗体，其中vh包含含有seq id no:100中所示氨基酸序列的vh的互补决定区(cdr)，且v
l
包含含有seq id no:101中所示氨基酸序列的v
l
的cdr。
132.例如，拮抗剂是抗体，其包含：
133.(i)vh，其包含：
134.(a)cdr1，其包含seq id no:100的氨基酸26-33中所示的序列；
135.(b)cdr2，其包含seq id no:100的氨基酸51-58中所示的序列；以及
136.(c)cdr3，其包含seq id no:100的氨基酸97-105中所示的序列；和/或
137.(ii)v
l
，其包含：
138.(a)cdr1，其包含seq id no:101的氨基酸27-32中所示的序列；
139.(b)cdr2，其包含seq id no:101的氨基酸50-52中所示的序列；以及
140.(c)cdr3，其包含seq id no:101的氨基酸89-97中所示的序列。
141.在一个实例中，拮抗剂是抗体，其包含：
142.(i)vh，其包含：
143.(a)cdr1，其包含seq id no:102中所示的序列；
144.(b)cdr2，其包含seq id no:103中所示的序列；以及
145.(c)cdr3，其包含seq id no:104中所示的序列；和/或
146.(ii)v
l
，其包含：
147.(a)cdr1，其包含seq id no:105中所示的序列；
148.(b)cdr2，其包含seq id no:106中所示的序列；以及
149.(c)cdr3，其包含seq id no:107中所示的序列。
150.在另一个实例中，拮抗剂是抗体，其包含：
151.(i)vh，其包含：
152.(a)cdr1，其包含seq id no:108的氨基酸26-33中所示的序列；
153.(b)cdr2，其包含seq id no:108的氨基酸51-58中所示的序列；以及
154.(c)cdr3，其包含seq id no:108的氨基酸97-105中所示的序列；和/或
155.(ii)v
l
，其包含：
156.(a)cdr1，其包含seq id no:109的氨基酸27-33中所示的序列；
157.(b)cdr2，其包含seq id no:109的氨基酸51-53中所示的序列；以及
158.(c)cdr3，其包含seq id no:109的氨基酸90-98中所示的序列。
159.在一个实例中，拮抗剂是抗体，其包含：
160.(i)vh，其包含：
161.(a)cdr1，其包含seq id no:110中所示的序列；
162.(b)cdr2，其包含seq id no:111中所示的序列；以及
163.(c)cdr3，其包含seq id no:112中所示的序列；和/或
164.(ii)v
l
，其包含：
165.(a)cdr1，其包含seq id no:113中所示的序列；
166.(b)cdr2，其包含seq id no:114中所示的序列；以及
167.(c)cdr3，其包含seq id no:115中所示的序列。
168.在另一个实例中，拮抗剂是抗体，其包含：
169.(i)vh，其包含：
170.(a)cdr1，其包含seq id no:116的氨基酸26-33中所示的序列；
171.(b)cdr2，其包含seq id no:116的氨基酸51-58中所示的序列；以及
172.(c)cdr3，其包含seq id no:116的氨基酸97-104中所示的序列；和/或
173.(ii)v
l
，其包含：
174.(a)cdr1，其包含seq id no:117的氨基酸27-32中所示的序列；
175.(b)cdr2，其包含seq id no:117的氨基酸24-26中所示的序列；以及
176.(c)cdr3，其包含seq id no:117的氨基酸89-97中所示的序列。
177.在一个实例中，拮抗剂是抗体，其包含：
178.(i)vh，其包含：
179.(a)cdr1，其包含seq id no:118中所示的序列；
180.(b)cdr2，其包含seq id no:119中所示的序列；以及
181.(c)cdr3，其包含seq id no:120中所示的序列；和/或
182.(ii)v
l
，其包含：
183.(a)cdr1，其包含seq id no:121中所示的序列；
184.(b)cdr2，其包含seq id no:122中所示的序列；以及
185.(c)cdr3，其包含seq id no:123中所示的序列。
186.在另一个实例中，拮抗剂是抗体，其包含：
187.(i)vh，其包含：
188.(a)cdr1，其包含seq id no:124的氨基酸26-33中所示的序列；
189.(b)cdr2，其包含seq id no:124的氨基酸51-58中所示的序列；以及
190.(c)cdr3，其包含seq id no:124的氨基酸97-105中所示的序列；和/或
191.(ii)v
l
，其包含：
192.(a)cdr1，其包含seq id no:125的氨基酸26-33中所示的序列；
193.(b)cdr2，其包含seq id no:125的氨基酸51-53中所示的序列；以及
194.(c)cdr3，其包含seq id no:125的氨基酸90-101中所示的序列。
195.在一个实例中，拮抗剂是抗体，其包含：
196.(i)vh，其包含：
197.(a)cdr1，其包含seq id no:126中所示的序列；
198.(b)cdr2，其包含seq id no:127中所示的序列；以及
199.(c)cdr3，其包含seq id no:128中所示的序列；和/或
200.(ii)v
l
，其包含：
201.(a)cdr1，其包含seq id no:129中所示的序列；
202.(b)cdr2，其包含seq id no:130中所示的序列；以及
203.(c)cdr3，其包含seq id no:131中所示的序列。
204.在另一个实例中，拮抗剂是抗体，其包含：
205.(i)vh，其包含：
206.(a)cdr1，其包含seq id no:132的氨基酸26-33中所示的序列；
207.(b)cdr2，其包含seq id no:132的氨基酸51-58中所示的序列；以及
208.(c)cdr3，其包含seq id no:132的氨基酸97-106中所示的序列；和/或
209.(ii)v
l
，其包含：
210.(a)cdr1，其包含seq id no:133的氨基酸26-33中所示的序列；
211.(b)cdr2，其包含seq id no:133的氨基酸51-53中所示的序列；以及
212.(c)cdr3，其包含seq id no:133的氨基酸92-100中所示的序列。
213.在一个实例中，拮抗剂是抗体，其包含：
214.(i)vh，其包含：
215.(a)cdr1，其包含seq id no:134中所示的序列；
216.(b)cdr2，其包含seq id no:135中所示的序列；以及
217.(c)cdr3，其包含seq id no:136中所示的序列；和/或
218.(ii)v
l
，其包含：
219.(a)cdr1，其包含seq id no:137中所示的序列；
220.(b)cdr2，其包含seq id no:138中所示的序列；以及
221.(c)cdr3，其包含seq id no:139中所示的序列。
222.在一个实例中，本发明的蛋白质是亲和力成熟的、嵌合的、cdr移植的或人源化的抗体或其抗原结合片段。
223.在一个实例中，蛋白质、抗体或其抗原结合片段是由编码任何前述蛋白质、抗体或功能片段的核酸编码的蛋白质、抗体或其功能片段的任何形式。
224.在一个实例中，拮抗剂是蛋白质，例如包含竞争性抑制本文公开的抗体的结合的可变区的抗体。
225.在另一个实施方案中，btn2a1拮抗剂是可溶性vγ9
+
tcr。可溶性vγ9
+
tcr可包含任何tcr等位基因。
226.在一个实施方案中，可溶性vγ9
+
tcr是单体。
227.在一实施方案中，可溶性vγ9
+
tcr是多聚体。
228.在一个实施方案中，可溶性vγ9
+
tcr包含γ链和/或δ链，其中γ链包含seq id no:85-89中任一项所示的序列，且δ链包含seq id no:70-74中任一项所示的序列。在一个实施方案中，γ链和δ链例如在凝血酶蛋白酶切割位点(例如lvprgs)被切割。
229.在一个实施方案中，可溶性vγ9
+
tcr包含γ链和/或δ链，其中γ链包含含有seq id no:90-94中任一项所示序列的可变区，且δ链包含含有seq id no:75-79中任一项所示序列的可变区。
230.在一个实施方案中，可溶性vγ9
+
tcr包含γ链可变区的互补决定区3(cdr3)和/或δ链可变区的互补决定区3(cdr3)，其中γ链可变区包含seq id no:95-99中任一项所示的序列，且δ链可变区包含seq id no:80-84中任一项所示的序列。
231.在一个实施方案中，可溶性vγ9
+
tcr包含γ链可变区和/或δ链可变区，其中γ链可变区包含seq id no:95-99中任一项所示的cdr3，且δ链可变区包含seq id no:80-84中任一项所示的cdr。
232.在一个实施方案中，可溶性vγ9
+
tcr包含γ链可变区和δ链可变区，其中γ链可变区包含seq id no:95中所示的cdr3，且δ链可变区包含seq id no:80中所示的cdr3。
233.在一个实施方案中，可溶性vγ9
+
tcr包含γ链可变区和δ链可变区，其中γ链可变区包含seq id no:96中所示的cdr3，且δ链可变区包含seq id no:81中所示的cdr3。
234.在一个实施方案中，可溶性vγ9
+
tcr包含γ链可变区和δ链可变区，其中γ链可变区包含seq id no:97中所示的cdr3，且δ链可变区包含seq id no:82中所示的cdr3。
235.在一个实施方案中，可溶性vγ9
+
tcr包含γ链可变区和δ链可变区，其中γ链可变区包含seq id no:98中所示的cdr3，且δ链可变区包含seq id no:83中所示的cdr3。
236.在一个实施方案中，可溶性vγ9
+
tcr包含γ链可变区和δ链可变区，其中γ链可变区包含seq id no:99中所示的cdr3，且δ链可变区包含seq id no:84中所示的cdr3。
237.本发明另外提供btn2a1激动剂，其中btn2a1激动剂特异性结合btn2a1并导致γδt细胞激活。
238.本发明另外提供btn2a1激动剂，其中btn2a1激动剂特异性结合btn2a1并诱导与γδt细胞激活相关的细胞表面标志物的表达。
239.本发明另外提供btn2a1激动剂，其中btn2a1激动剂特异性结合btn2a1并诱导γδt细胞分泌一种或多种细胞因子。
240.本发明另外提供btn2a1激动剂，其中btn2a1激动剂特异性结合btn2a1并诱导γδt细胞杀伤癌细胞和/或抑制癌细胞的生长和/或杀伤感染例如病毒、细菌或寄生虫的细胞和/或抑制感染例如病毒、细菌或寄生虫的细胞的生长。
241.本发明另外提供btn2a1激动剂，其中btn2a1激动剂特异性结合btn2a1并且：
242.(i)激活γδt细胞和/或增加细胞群体中激活的γδt细胞的数目；和/或
243.(i)增加表达t细胞激活标志物的γδt细胞的百分比；和/或
244.(ii)增加γδt细胞分泌细胞因子(例如干扰素γ)；和/或
245.(iii)诱导γδt细胞杀伤癌细胞和/或抑制癌细胞的生长和/或杀伤感染的细胞和/或抑制感染的细胞的生长；和/或
246.(iv)增加γδt细胞的细胞表面上表达的t细胞激活标志物的量。
247.本发明另外提供btn2a1激动剂，其中btn2a1激动剂特异性结合btn2a1并且：
248.(i)增加细胞表面上表达cd25的γδt细胞的百分比；和/或
249.(ii)增加γδt细胞分泌干扰素γ；和/或
250.(iii)诱导γδt细胞杀伤癌细胞和/或抑制癌细胞的生长；和/或
251.(iv)增加γδt细胞的细胞表面上表达的cd25的量。
252.在一个实例中，如在包括使γδt细胞群在体外与btn2a1激动剂接触至少6小时或8小时或10小时或12小时的时间段并用流式细胞术测量表达cd25的群中γδt细胞的百分比的测定中所测量的，btn2a1激动剂增加细胞表面上表达cd25的γδt细胞的数目。此类测定还可用于评估cd25和/或γδt细胞上表达的其他分子的水平。
253.在一个实例中，细胞表面上表达cd25的γδt细胞的百分比的增加是相对于：
254.(i)未与btn2a1激动剂接触的γδt细胞群中细胞表面上表达cd25的γδt细胞的百分比；和/或
255.(ii)已与特异性结合btn2a1(非btn2a1激动剂或btn2a1拮抗剂)的抗体接触的γδt细胞群体中细胞表面上表达cd25的γδt细胞的百分比。
256.在一个实例中，激动剂增加了γδt细胞的百分比，该γδt细胞表达γδt细胞激活的一种或多种另外的标记物(除cd25之外)；和/或增加了γδt细胞的细胞表面上表达的激活cd25的一种或多种另外的标志物(除cd25之外)的量。
257.在一个实例中，btn2a1激动剂将细胞表面上表达cd25的γδt细胞的百分比增加至γδt细胞群体中细胞的至少10％。在一个实例中，btn2a1激动剂将细胞表面上表达cd25的γδt细胞的百分比增加至γδt细胞群体中细胞的至少15％。在一个实例中，btn2a1激动剂将细胞表面上表达cd25的γδt细胞的百分比增加至γδt细胞群体中细胞的至少20％。在一个实例中，btn2a1激动剂将细胞表面上表达cd25的γδt细胞的百分比增加至γδt细胞群体中细胞的至少30％。在一个实例中，btn2a1激动剂将细胞表面上表达cd25的γδt细胞的百分比增加至γδt细胞群体中细胞的至少40％。
258.在另一个实例中，如在包括在体外细胞培养物中用btn2a1激动剂培养γδt细胞群
体至少6小时或8小时或10小时或12小时的时间段和测量每毫升细胞培养液的干扰素γ的量的测定中所测量的，btn2a1激动剂增加γδt细胞的干扰素γ分泌。
259.在一个实例中，btn2a1激动剂将γδt细胞培养液中的干扰素γ的分泌增加到10pg/ml。在一个实例中，btn2a1激动剂将γδt细胞培养液中的干扰素γ的分泌增加到20pg/ml。在一个实例中，btn2a1激动剂将γδt细胞培养液中的干扰素γ的分泌增加到30pg/ml。在一个实例中，btn2a1激动剂将γδt细胞培养液中的干扰素γ的分泌增加到40pg/ml。
260.在一个实例中，激动剂增加一种或多种(除干扰素γ之外或替代干扰素γ的)其他或替代细胞因子的分泌。
261.在另一个实例中，诱导γδt细胞杀伤细胞和/或抑制细胞(例如癌细胞或感染的细胞)的生长，如在测定法中所测量的，该测定法包括在γδt细胞和btn2a1激动剂以及被活细胞还原为可检测试剂(例如甲瓒)的试剂(例如3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物[mtt])的试剂存在下培养细胞(例如黑色素瘤细胞或黑色素瘤细胞系)并检测可检测试剂，其中与不存在btn2a1激动剂的情况下相比，存在btn2a1激动剂的情况下可检测试剂的水平降低表明细胞已被杀伤或细胞的生长已被抑制。
[0262]
在一个实例中，btn2a1拮抗剂或激动剂是一种包含抗原结合结构域的蛋白质。
[0263]
在一个实施方案中，该蛋白质为：
[0264]
(i)单链fv片段(scfv)；
[0265]
(ii)二聚体scfv；
[0266]
(iii)fv片段；
[0267]
(iv)单域抗体(sdab)
[0268]
(v)二聚抗体、三聚抗体、四聚抗体或更高阶多聚体；
[0269]
(vi)fab片段；
[0270]
(vii)fab'片段；
[0271]
(viii)f(ab')片段；
[0272]
(ix)f(ab')2片段；
[0273]
(x)与抗体的fc区连接的(i)-(ix)中任一项；
[0274]
(xi)与结合免疫效应细胞的抗体或其抗原结合片段融合的(i)-(ix)中任一项；或
[0275]
(xii)抗体。
[0276]
在一个实例中，btn2a1激动剂是包含轻链可变区(v
l
)和重链可变区(vh)的抗体，其中轻链可变区包含seq id no:140中所示的序列，且重链可变区包含seq id no:144中所示的序列。
[0277]
在一个实例中，btn2a1激动剂是包含v
l
和vh的抗体，其中v
l
包含seq id no:148中所示的序列，且vh包含seq id no:152中所示的序列。
[0278]
在一个实例中，btn2a1激动剂是包含v
l
和vh的抗体，其中v
l
包含seq id no:156中所示的序列，且vh包含seq id no:160中所示的序列。
[0279]
在一个实例中，btn2a1激动剂是包含v
l
和vh的抗体，该v
l
和vh包含任何前述抗体的cdr。例如，cdr如kabat编号系统所定义(kabat免疫学相关蛋白质序列(美国马里兰州贝塞斯达，美国国立卫生研究院，1987和1991)。
[0280]
例如，btn2a1激动剂是抗体，其包含：
[0281]
(i)v
l
，其包含：
[0282]
(a)cdr1，其包含seq id no:140的氨基酸26-33中所示的序列；
[0283]
(b)cdr2，其包含seq id no:140的氨基酸51-53中所示的序列；以及
[0284]
(c)cdr3，其包含seq id no:140的氨基酸90-98中所示的序列；和/或
[0285]
(ii)vh，其包含：
[0286]
(a)cdr1，其包含seq id no:144的氨基酸26-33中所示的序列；
[0287]
(b)cdr2，其包含seq id no:144的氨基酸51-58中所示的序列；以及
[0288]
(c)cdr3，其包含seq id no:144的氨基酸97-109中所示的序列。
[0289]
例如，btn2a1激动剂是抗体，其包含：
[0290]
(i)v
l
，其包含：
[0291]
(a)cdr1，其包含seq id no:148的氨基酸26-33中所示的序列；
[0292]
(b)cdr2，其包含seq id no:148的氨基酸51-53中所示的序列；以及
[0293]
(c)cdr3，其包含seq id no:148的氨基酸90-100中所示的序列；和/或
[0294]
(ii)vh，其包含：
[0295]
(a)cdr1，其包含seq id no:152的氨基酸26-33中所示的序列；
[0296]
(b)cdr2，其包含seq id no:152的氨基酸51-58中所示的序列；以及
[0297]
(c)cdr3，其包含seq id no:152的氨基酸97-116中所示的序列。
[0298]
例如，btn2a1激动剂是抗体，其包含：
[0299]
(i)v
l
，其包含：
[0300]
(a)cdr1，其包含seq id no:156的氨基酸26-33中所示的序列；
[0301]
(b)cdr2，其包含seq id no:156的氨基酸51-53中所示的序列；以及
[0302]
(c)cdr3，其包含seq id no:156的氨基酸90-100中所示的序列；和/或
[0303]
(ii)vh，其包含：
[0304]
(a)cdr1，其包含seq id no:160的氨基酸26-33中所示的序列；
[0305]
(b)cdr2，其包含seq id no:160的氨基酸51-58中所示的序列；以及
[0306]
(c)cdr3，其包含seq id no:160的氨基酸97-109中所示的序列。
[0307]
在一个实例中，btn2a1激动剂是抗体，其包含：
[0308]
(i)v
l
，其包含：
[0309]
(a)cdr1，其包含seq id no:141中所示的序列；
[0310]
(b)cdr2，其包含seq id no:142中所示的序列；以及
[0311]
(c)cdr3，其包含seq id no:143中所示的序列；和/或
[0312]
(ii)vh，其包含：
[0313]
(a)cdr1，其包含seq id no:145中所示的序列；
[0314]
(b)cdr2，其包含seq id no:146中所示的序列；以及
[0315]
(c)cdr3，其包含seq id no:147中所示的序列。
[0316]
在一个实例中，btn2a1激动剂是抗体，其包含：
[0317]
(i)v
l
，其包含：
[0318]
(a)cdr1，其包含seq id no:149中所示的序列；
[0319]
(b)cdr2，其包含seq id no:150中所示的序列；以及
[0320]
(c)cdr3，其包含seq id no:151中所示的序列；和/或
[0321]
(ii)vh，其包含：
[0322]
(a)cdr1，其包含seq id no:153中所示的序列；
[0323]
(b)cdr2，其包含seq id no:154中所示的序列；以及
[0324]
(c)cdr3，其包含seq id no:155中所示的序列。
[0325]
在一个实例中，btn2a1激动剂是抗体，其包含：
[0326]
(i)v
l
，其包含：
[0327]
(a)cdr1，其包含seq id no:157中所示的序列；
[0328]
(b)cdr2，其包含seq id no:158中所示的序列；以及
[0329]
(c)cdr3，其包含seq id no:159中所示的序列；和/或
[0330]
(ii)vh，其包含：
[0331]
(a)cdr1，其包含seq id no:161中所示的序列；
[0332]
(b)cdr2，其包含seq id no:162中所示的序列；以及
[0333]
(c)cdr3，其包含seq id no:163中所示的序列。
[0334]
在一个实例中，本发明的btn2a1激动剂是亲和力成熟的、嵌合的、cdr移植的或人源化的抗体或其抗原结合片段。
[0335]
在一个实例中，btn2a1激动剂是一种蛋白质，例如包含竞争性抑制本文公开的抗体的结合和/或结合与本文公开的抗体相同的表位的可变区的抗体。
[0336]
本发明还提供了一种激活受试者中表达vγ9
+
tcr的γδt细胞的方法，该方法包括向受试者施用如上所述的btn2a1激动剂。
[0337]
本发明还提供了一种诱导或增强受试者中vγ9
+
γδt细胞应答的方法，其中该方法包括向受试者施用如上所述的btn2a1激动剂。
[0338]
本发明还提供了一种激活体外或离体表达vγ9
+
tcr的γδt细胞的方法，该方法包括在如上所述的btn2a1激动剂存在下培养γδt细胞和表达btn2a1的细胞。在一个实施方案中，该方法还包括向有需要的受试者施用激活的γδt细胞的步骤。
[0339]
本发明还提供了一种预防、治疗自身免疫性疾病、移植排斥、移植物抗宿主病或移植物抗肿瘤效应、延迟其进展、预防其复发或减轻其症状的方法，该方法包括向有需要的受试者施用如上所述的btn2a1激动剂，施用的量足以预防、治疗受试者自身免疫性疾病、移植排斥、移植物抗宿主病或移植物抗肿瘤效应、延迟其进展、预防其复发或减轻其症状。
[0340]
本发明还提供了一种预防、治疗癌症或感染、延缓其进展、预防其复发或减轻其症状的方法，该方法包括向有需要的受试者施用如上所述的btn2a1激动剂，施用的量足以预防、治疗受试者的癌症或感染、延缓其进展、预防其复发或减轻其症状。
[0341]
序列表的关键字
[0342]
seq id no:1是人btn2a1亚型(isoform)1的氨基酸序列。
[0343]
seq id no:2是人btn2a1亚型2的氨基酸序列。
[0344]
seq id no:3是人btn2a1亚型3的氨基酸序列。
[0345]
seq id no:4是人btn2a1亚型4的氨基酸序列。
[0346]
seq id no:5是人膜联蛋白(annexin)a5的氨基酸序列。
[0347]
seq id no:6是人膜联蛋白a1的氨基酸序列。
[0348]
seq id no:7是乳凝集素(lactadherin)c1c2结构域的氨基酸序列。
[0349]
seq id no:8是psp1蛋白的氨基酸序列。
[0350]
seq id no:9-69是编码引物的核苷酸序列(见表2)。
[0351]
seq id no:70是δ2(克隆6)的氨基酸序列。
[0352]
seq id no:71是δ2(克隆3)的氨基酸序列。
[0353]
seq id no:72是δ2(克隆4)的氨基酸序列。
[0354]
seq id no:73是δ2(克隆5)的氨基酸序列。
[0355]
seq id no:74是δ2(克隆7)的氨基酸序列。
[0356]
seq id no:75是δ2(克隆6)可变区的氨基酸序列。
[0357]
seq id no:76是δ2(克隆3)可变区的氨基酸序列。
[0358]
seq id no:77是δ2(克隆4)可变区的氨基酸序列。
[0359]
seq id no:78是δ2(克隆5)可变区的氨基酸序列。
[0360]
seq id no:79是δ2(克隆7)可变区的氨基酸序列。
[0361]
seq id no:80是cdr3δ(克隆3)的氨基酸序列。
[0362]
seq id no:81是cdr3δ(克隆4)的氨基酸序列。
[0363]
seq id no:82是cdr3δ(克隆5)的氨基酸序列。
[0364]
seq id no:83是cdr3δ(克隆6)的氨基酸序列。
[0365]
seq id no:84是cdr3δ(克隆7)的氨基酸序列。
[0366]
seq id no:85是γ9(克隆6)的氨基酸序列。
[0367]
seq id no:86是γ9(克隆3)的氨基酸序列。
[0368]
seq id no:87是γ9(克隆4)的氨基酸序列。
[0369]
seq id no:88是γ9(克隆5)的氨基酸序列。
[0370]
seq id no:89是γ9(克隆7)的氨基酸序列。
[0371]
seq id no:90是γ9(克隆6)可变区的氨基酸序列。
[0372]
seq id no:91是γ9(克隆3)可变区的氨基酸序列。
[0373]
seq id no:92是γ9(克隆4)可变区的氨基酸序列。
[0374]
seq id no:93是γ9(克隆5)可变区的氨基酸序列。
[0375]
seq id no:94是γ9(克隆7)可变区的氨基酸序列。
[0376]
seq id no:85是cdr3γ(克隆3)的氨基酸序列。
[0377]
seq id no:86是cdr3γ(克隆4)的氨基酸序列。
[0378]
seq id no:87是cdr3γ(克隆5)的氨基酸序列。
[0379]
seq id no:88是cdr3γ(克隆6)的氨基酸序列。
[0380]
seq id no:89是cdr3γ(克隆7)的氨基酸序列。
[0381]
seq id no:100是hu34c vh的氨基酸序列。
[0382]
seq id no:101是hu34c v
l
的氨基酸序列。
[0383]
seq id no:102是hu34c v
h cdr1的氨基酸序列。
[0384]
seq id no:103是hu34c v
h cdr2的氨基酸序列。
[0385]
seq id no:104是hu34c v
h cdr3的氨基酸序列。
[0386]
seq id no:105是hu34c v
l cdr1的氨基酸序列。
[0387]
seq id no:106是hu34c v
l cdr2的氨基酸序列。
[0388]
seq id no:107是hu34c v
l cdr3的氨基酸序列。
[0389]
seq id no:108是克隆227vh的氨基酸序列。
[0390]
seq id no:109是克隆227v
l
的氨基酸序列。
[0391]
seq id no:110是克隆227v
h cdr1的氨基酸序列。
[0392]
seq id no:111是克隆227v
h cdr2的氨基酸序列。
[0393]
seq id no:112是克隆227v
h cdr3的氨基酸序列。
[0394]
seq id no:113是克隆227v
l cdr1的氨基酸序列。
[0395]
seq id no:114是克隆227v
l cdr2的氨基酸序列。
[0396]
seq id no:115是克隆227v
l cdr3的氨基酸序列。
[0397]
seq id no:116是克隆236vh的氨基酸序列。
[0398]
seq id no:117是克隆236v
l
的氨基酸序列。
[0399]
seq id no:118是克隆236v
h cdr1的氨基酸序列。
[0400]
seq id no:119是克隆236v
h cdr2的氨基酸序列。
[0401]
seq id no:120是克隆236v
h cdr3的氨基酸序列。
[0402]
seq id no:121是克隆236v
l cdr1的氨基酸序列。
[0403]
seq id no:122是克隆236v
l cdr2的氨基酸序列。
[0404]
seq id no:123是克隆236v
l cdr3的氨基酸序列。
[0405]
seq id no:124是克隆266vh的氨基酸序列。
[0406]
seq id no:125是克隆266v
l
的氨基酸序列。
[0407]
seq id no:126是克隆266v
h cdr1的氨基酸序列。
[0408]
seq id no:127是克隆266v
h cdr2的氨基酸序列。
[0409]
seq id no:128是克隆266v
h cdr3的氨基酸序列。
[0410]
seq id no:129是克隆266v
l cdr1的氨基酸序列。
[0411]
seq id no:130是克隆266v
l cdr2的氨基酸序列。
[0412]
seq id no:131是克隆266v
l cdr3的氨基酸序列。
[0413]
seq id no:132是克隆267vh的氨基酸序列。
[0414]
seq id no:133是克隆267v
l
的氨基酸序列。
[0415]
seq id no:134是克隆267v
h cdr1的氨基酸序列。
[0416]
seq id no:135是克隆267v
h cdr2的氨基酸序列。
[0417]
seq id no:136是克隆267v
h cdr3的氨基酸序列。
[0418]
seq id no:137是克隆267v
l cdr1的氨基酸序列。
[0419]
seq id no:138是克隆267v
l cdr2的氨基酸序列。
[0420]
seq id no:139是克隆267v
l cdr3的氨基酸序列。
[0421]
seq id no:140是抗体244的v
l
的氨基酸序列。
[0422]
seq id no:141是抗体244的v
l cdr1的氨基酸序列。
[0423]
seq id no:142是抗体244的v
l cdr2的氨基酸序列。
[0424]
seq id no:143是抗体244的v
l cdr3的氨基酸序列。
[0425]
seq id no:144是抗体244的vh的氨基酸序列。
[0426]
seq id no:145是抗体244的v
h cdr1的氨基酸序列。
[0427]
seq id no:146是抗体244的v
h cdr2的氨基酸序列。
[0428]
seq id no:147是抗体244的v
h cdr3的氨基酸序列。
[0429]
seq id no:148是抗体253的v
l
的氨基酸序列。
[0430]
seq id no:149是抗体253的v
l cdr1的氨基酸序列。
[0431]
seq id no:150是抗体253的v
l cdr2的氨基酸序列。
[0432]
seq id no:151是抗体253的v
l cdr3的氨基酸序列。
[0433]
seq id no:152是抗体253的vh的氨基酸序列。
[0434]
seq id no:153是抗体253的v
h cdr1的氨基酸序列。
[0435]
seq id no:154是抗体253的v
h cdr2的氨基酸序列。
[0436]
seq id no:155是抗体253的v
h cdr3的氨基酸序列。
[0437]
seq id no:156是抗体259的v
l
的氨基酸序列。
[0438]
seq id no:157是抗体259的v
l cdr1的氨基酸序列。
[0439]
seq id no:158是抗体259的v
l cdr2的氨基酸序列。
[0440]
seq id no:159是抗体259的v
l cdr3的氨基酸序列。
[0441]
seq id no:160是抗体259的vh的氨基酸序列。
[0442]
seq id no:161是抗体259的v
h cdr1的氨基酸序列。
[0443]
seq id no:162是抗体259的v
h cdr2的氨基酸序列。
[0444]
seq id no:163是抗体259的v
h cdr3的氨基酸序列。
附图说明
[0445]
图1.vγ9vδ2
+
γδt细胞受体四聚体染色依赖于btn2a1。(a)各种细胞系的vγ9vδ2
+
γδtcr四聚体染色。直方图描绘了γδtcr四聚体#3-#7；不相关的对照(小鼠cd1d-α-galcer)四聚体；链霉亲和素(sav)-pe对照。(b)火山图描绘了未分选的和vγ9vδ2γδtcr四聚体
lo lm-mel-62细胞之间每种grna的log2(倍数变化)对-log
10
(p值)，其中深灰色描绘了显著差异(错误发现率《0.05)。(c)与亲本细胞相比，lm-mel-62btn2a1
空
和lm-mel-75btn2a1
空
细胞的vγ9vδ2
+
γδtcr四聚体染色。(d)在用btn2a1或btn3a1转染的亲本细胞和lm-mel-62细胞上进行抗btn2a1 mab(克隆231)、抗btn3a1/3a2/3a3 mab(克隆103.2)和vγ9vδ2
+
γδtcr四聚体(#6)染色。
*
wt细胞的γδtcr四聚体染色被描绘了两次。(e)与同型(isotype)对照(白色)相比，在与一组抗btn2a1 mab预孵育后的lm-mel-62、lm-mel-75和hek-293t细胞的vγ9vδ2
+
γδtcr四聚体#6染色。下方的直方图描述了用不相关的小鼠cd1d-α-galcer四聚体进行的对照染色。tet，四聚体。(a)、(c)、(d)、(e)中的数据代表两个独立的实验。
[0446]
图2.btn2a1结合vγ9
+
γδt细胞受体。(a)在三个代表性人pbmc样品上btn2a1四聚体-pe(第一列)或链霉亲和素-pe对照(第二列)对cd3ε染色。直方图描述了门控γδt细胞(cd3
+
γδtcr
+
)、αβt细胞(cd3
+
γδtcr-)、b细胞(cd3-cd19
+
)、单核细胞(cd3-cd19-cd14
+
)或其他(cd3-cd19-cd14-)亚群上的btn2a1四聚体-pe染色(白色)或链霉亲和素-pe对照(灰色)。框图和须状图(右)描绘了来自不同供体的血液样品中结合btn2a1四聚体的每种细胞系的
百分比。(b)btn2a1四聚体(白色直方图)与vγ9
+
vδ2
+
、vγ9
+
vδ1
+
、vγ9-vδ1
+
γδt细胞上链霉亲和素-pe单独对照(灰色直方图)染色重叠，其中亲本门控显示在左侧。框图和须状图(右)描绘了不同供体中结合btn2a1四聚体-pe的每个γδt细胞亚群的百分比。(c)使用纯化的体外扩增的vδ2
+
t细胞在双重染色或单一染色的对照上的btn2a1四聚体-pe和cd3ε-apc之间的fret荧光(直方图重叠)。框图和须状图描绘了来自不同人类供体的γδt细胞亚群中的fret平均荧光强度(mfi)。(d)如通过表面等离振子共振所测量的，可溶性btn2a1(200-3.1μm)与固定化的vγ9
+
vδ2
+
(
‘
tcr#6’，左侧)、vγ9
+
vδ1
+
(
‘
杂合体’，中间)以及vγ5
+
vδ1
+
(
‘
9c2’，右侧)γδtcr的结合。饱和度图(下方)描述了平衡时的结合和scatchard图。kd，平衡解离常数
±
sem；sav，链霉亲和素。(a)中的数据代表汇总自两个独立实验的n＝8个供体；(b)中的数据代表汇总自两个实验的n＝8个供体；(c)中的数据代表汇总自三个独立实验的n＝7个供体；(d)中的数据代表n＝2个单独的实验，其中一个(实验2)一式两份进行并取平均值。
[0447]
图3.γδt细胞对pag的功能性应答依赖于btn2a1。(a)在培养24小时
±
4μm唑来膦酸盐和
±
10μg/ml中和性抗btn2a1 mab的pbmc中门控的vδ2
+
和对照vδ1
+
t细胞上的cd25表达和cd3ε平均荧光强度(mfi)，如图所示。通过方差分析(anova)，*，p《0.05；**，p《0.01，***，p《0.001。(b)来自(a)的培养物上清液中的ifn-γ和tnf浓度。通过friedman测试，**，p《0.01；***，p《0.001。(c)在存在(深灰色)或不存在(灰色)4μm唑来膦酸盐的情况下，在与亲本或btn2a1
空
lm-mel-62apc共培养的纯化的体外扩增的vδ2
+
t细胞上的cd3 mfi和cd25表达。每个符号代表不同的供体。条形图描绘了平均值
±
sem。(d)用1μm唑来膦酸盐攻击2天、随后在含il-2的培养基中维持非粘附pbmc另外7天后，pbmc与亲本或btn2a1
空1
lm-mel-62apc共培养中vδ2
+
γδt细胞的数目。使用曼-惠特尼检验*,p《0.05。(e)在指定时间点
±
1μm唑来膦酸盐，使用代谢染料mts(针对输入细胞数归一化)测定亲代或btn2a1
空
lm-mel-62靶细胞与体外扩增的vδ2
+
t细胞的共培养物的细胞活力(平均值
±
sem)。使用曼
–
惠特尼检验*，p《0.05。(f)在用hmbpp(0.5ng/ml)或平板结合的抗cd3加抗cd28(各10μg/ml)
±
10μg/ml中和性抗btn2a1 mab培养纯化的体外扩增的vδ2
+
t细胞后的cd25表达(左)和ifn-γ浓度(右)。(a)和(b)中的数据代表汇总自两个独立实验的n＝8个供体；(c)中的数据代表汇总自三个独立实验的n＝3个供体，每个用由不同符号指示的n＝4个技术重复进行；(d)中的数据代表n＝4个供体，每个供体取五个独立实验的1-5个技术重复的平均值；(e)中的数据代表汇总自两个独立实验的n＝8个供体；(f)中的数据代表n＝4个供体，每个供体取六个独立实验的2-6个技术重复的平均值。zol，唑来膦酸盐。
[0448]
图4.btn2a1和btn3a1均为pag呈递所必需的。(a)在40μm唑来膦酸盐的存在(深灰色)或不存在(灰色)下，与指示的apc共培养过夜后，g115 vγ9vδ2
+
γδtcr(顶行)、9c2 vγ5vδ1
+
γδtcr(中间)和亲本(tcr-)j.rt3-t3.5(底行)jurkat细胞上的cd69表达。数字表示中位数的荧光强度。(b)在存在(深灰色)或不存在(灰色)4μm唑来膦酸盐的情况下，在用(b)btnl3、btnl8、btn2a1、btn3a1和btn3a2或(c)btn2a1δb30、btn3a1和btn3a2的指示组合转染的cho-k1(仓鼠来源)或nih-3t3(小鼠来源)apc共培养24小时的纯化体外扩增的γδt细胞上cd25表达的变化(对于每个样品，对未刺激对照进行归一化)。(d)如(a)中共培养的γδt细胞，不同之处在于存在两种apc群体的1∶1混合物，每种分别用btn2a1、btn3a1和btn3a2的组合转染。每个符号和连接线代表不同的供体。*，p《0.05；使用wilcoxon配对检验，**，p《
mel-62细胞相比，在γδtcr四聚体#6
lo
群体中前四十个向导rna基因靶标。
[0454]
图10.btn2a1和btn3a1敲除细胞系的产生。
[0455]
通过用编码cas9和特异性向导rna的载体瞬时转染靶细胞，随后进行大量细胞分选，产生btn2a1
空
和btn3a1
空
lm-mel-62或lm-mel-75细胞。(a)各细胞系的抗btn2a1(克隆231)和抗btn3a1/3a2/3a3(克隆103.2)染色与同型对照重叠。(b)各细胞系(深灰色)的vγ9vδ2
+
γδtcr四聚体#6染色与不相关四聚体对照(小鼠cd1d-α-galcer，灰色)重叠。数据代表两个类似的实验。
[0456]
图11.抗btn2a1 mab的产生。(a)btn2a1、btn2a2、btn3a1、btn3a2胞外结构域的比对。(b)通过elisa显示的抗btn2a1 mab克隆与平板结合的btn2a1、btn2a2或btn3a3胞外结构域的结合，其中热图描绘了吸光度。(c)抗btn2a1 mab对用全长人btn2a1、btn2a2或btn3a1转染的小鼠nih-3t3细胞或未转染细胞的反应性，如图所示。数据取n＝2个单独实验的平均值。(d)使用bv421缀合的第二多克隆ab，选择的抗btn2a1克隆或同型对照(小鼠igg2aκ，克隆bm4)对m-mel-62亲本(“wt”)、btn2a1
空1
和btn2a1
空2
细胞的反应性。相同的同型对照在每一行重叠。(e)使用pe缀合的第二多克隆ab，选择的抗btn2a1克隆对lm-mel-62亲本(“wt”)、btn2a1
空
和btn3a1
空
细胞的反应性。a450，450nm处的吸光度。
[0457]
图12.btn2a1四聚体的产生。(a)构建体设计包括融合到c-末端接头(氨基酸序列：gtgsgsgg)的btn2a1胞外结构域(igv和igc结构域；gln29到ser245)，随后是avi(生物素连接酶)-和his
6-标签(氨基酸序列：lndifeaqkiewhehhhhh)。(b)293t细胞中产生的生物素化btn2a1(和对照btn3a1)胞外结构域的sds-page分析。右侧泳道是与未变性链霉亲和素(sav.)复合的变性btn2a1-生物素。(c)与同型对照(克隆bm4)相比，平板结合的btn2a1胞外结构域对抗btn2a1克隆hu34c和231的反应性的elisa。图(c)中的数据代表一个实验。mw，分子量标记。
[0458]
图13.btn2a1被vγ9vδ2
+
γδtcr四聚体特异性识别。
[0459]
用人btn2a1、btn2a2、btnl3加btnl8或btn3a1加btn3a2转染后，在门控gfp
+
小鼠3t3细胞上单独染色的vγ9vδ2
+
γδtcr四聚体#6、不相关对照四聚体(小鼠cd1d-α-galc)或对照链霉亲和素(sav.)(亲本门控描绘于密度图的顶行)。数据代表两个类似的实验。
[0460]
图14.拮抗剂抗btn2a1 mab特异性阻断pag介导的vδ2
+
γδt细胞激活，但不阻断肽介导的cd8
+
αβt细胞激活。
[0461]
(a)在单独用pag hmbpp(0.5ng/ml)或唑来膦酸盐(4μm)或与含有来源于巨细胞病毒、eb病毒和流感的免疫原性肽(1μg/ml)
±
10μg/ml中和性抗btn2a1 mab(克隆hu34c、236、259、267)、抗btn3a分子(克隆103.2)或同型对照(小鼠igg2a，κ，克隆bm4)的cef肽混合物组合体外攻击后，细胞内ifn-γ在pbmc中门控vδ2
+
cd3
+
t细胞(左)或cd8
+
cd3
+
t细胞(右)上表达。(b)代表性门控(顶部行)和门控vδ2
+
cd3
+
t细胞(中间行)或cd8
+
cd3
+
t细胞(底行)上的ifn-γ染色图。数据代表来自两个独立实验的七个供体。
[0462]
图15.jurkat g115 vγ9vδ2
+
γδt细胞对唑来膦酸盐、hmbpp和ipp的反应依赖于btn2a1。
[0463]
(a)与分级剂量的pag hmbpp、ipp或唑来膦酸盐
±
亲本lm-mel-75apc共培养后，jurkat g115 vγ9vδ2γδtcr
+
或对照jurkat 9c2 vγ5vδ1γδtcr
+
t细胞上的cd69诱导。(b)jurkat g115和jurkat 9c2 t细胞系与亲本lm-mel-75、btn2a1
空
或btn3a1
空
apcs
±
hmbpp
(100nm)、ipp(100μm)或唑来膦酸盐(40μm)共培养后的代表性cd69直方图和(c)表达水平。(a)中的数据来自一个实验；(b)和(c)中的数据汇总自n＝4个独立实验。
[0464]
图16.btn2a1加btn3a1使小鼠apc具有将pag呈递至γδt细胞的能力。(a)用btnl3、btnl8、btn2a1、btn3a1和btn3a2或btn2a1δb30的指示组合转染的nih-3t3细胞上的btn2a1(克隆231)与btn3a1/3a2/3a3染色(克隆103.2)或同型对照染色(小鼠igg2a克隆bm4)。(b)在存在(深灰色)或不存在(灰色)4μm唑来膦酸盐的情况下，在用btnl3、btnl8、btn2a1、btn3a1和btn3a2或btn2a1δb30的指示组合转染的cho-k1或nih-3t3apc共培养24小时的纯化体外扩增的γδt细胞上的cd25表达。右侧的三组描绘了在2个apc群体的1∶1混合物的存在下共培养的γδt细胞，每个分别用btn2a1、btn3a1和btn3a2的指示组合转染。(c)btn2a1和btn2a1δb30结构的示意图(左)和直方图描绘了用btn2a1或btn2a1δb30转染的nih-3t3细胞上的抗btn2a1(克隆259)和γδtcr四聚体(#6)，与相关对照重叠。数据代表汇总自3-5个独立实验的每组n＝7-9个供体。tm，跨膜结构域。
[0465]
图17.未检测到hmbpp与btn2a1的胞内b30.2结构域的结合。(a)在单独连续注射pag hmbpp、ipp或pbs缓冲液后，重组btn2a1(左栏)或btn3a1(右栏)b30.2结构域(100μm)的原始等温滴定量热法迹线和(b)结合等温线。数据来自两个独立实验之一。
[0466]
图18.细胞表面上btn2a1和btn3a1之间的缔合不依赖于细胞内b30.2结构域。
[0467]
等高线图(顶行)描绘了btn2a1(克隆259)与btn3a(克隆103.2)染色(深灰色)，与在用btn2a1、btn3a1、btn3a1和/或btn2a1δb30的指示组合转染的小鼠nih-3t3细胞上的同型对照染色(x轴上的小鼠igg1克隆mopc-173与y轴上的小鼠igg2a克隆bm4，灰色)重叠。直方图(第二行)描述了每种染色条件下的fret信号。数据代表2个独立实验。
[0468]
图19.cfp和yfp标记的嗜乳脂蛋白构建体的产生。
[0469]
(a)设计全长btn2a1、btn3a1、btnl3和btnl8，其具有与cfp或yfp偶联的“长”或“短”c-末端柔性接头。(b)c-末端接头和cfp/yfp结构域的氨基酸序列。(c)代表性图描绘了在用每种相应构建体瞬时转染的小鼠nih-3t3细胞上的抗btn2a1(克隆231)和抗btn3a分子(克隆103.2)mab染色(深灰色)或同型对照染色(igg1与igg2a，黑色)。(d)代表性图描绘了用wt btn分子或cfp/yfp标记的btn分子转染的小鼠nih-3t3细胞上的btn2a1(左)和btn3a1(右)表面表达。
[0470]
图20.btn2a1和btn3a1的胞内结构域是相关的，并且这不受pag的影响。
[0471]
(a)图形描绘了用嗜乳脂蛋白分子的不同组合转染的小鼠3t3细胞(顶行)或单转染的对照(第二行)上的fret与供体荧光团(cfp)。(b)cfp/yfp-标记的嗜乳脂蛋白转染的小鼠3t3细胞所示组合之间
±
用hmbpp(100ng/ml)或唑来膦酸盐(40μm)激发过夜的fret。(c)如通过抗btn2a1(克隆259)和抗btn3a1(克隆103.2)共染色所测量的，btn2a1和btn3a1胞外结构域之间
±
用hmbpp(100ng/ml)或唑来膦酸盐(40μm)激发过夜的fret。除了未转染的对照外，所有图均在转染的细胞(cfp或yfp或两者)上预设门控，视情况而定。(a)中的数据代表四个独立实验；(b)和(c)中的数据代表两个独立的实验。
[0472]
图21.btn2a1和btn3a1之间的胞内结构域缔合被抗btn2a1 mab破坏。
[0473]
在用一组未缀合的抗btn2a1 mab(10μg/ml)或同型对照(小鼠igg2a，κ，克隆bm4)孵育转染的小鼠nih-3t3细胞之后的cfp或yfp标记的btn2a1和btn3a1之间的fret
+
细胞百分比(灰色)。还显示了对照btn3a1+btnl8转染子的fret水平(深灰色)。btn2a1+btn3a1组的
数据代表两个独立的实验，每个实验用btn2a1
cfp
+btn3a1
yfp
和btn3a1
cfp
+btn2a1
yfp
转染子(图中合并在一起)进行；btn3a1
cfp
+btnl8
yfp
来自两个独立的实验。
[0474]
图22.正常的γδtcr表达和对jurkat g115γδtcr突变体的抗cd3刺激的反应性。(a)在转染的hek-293t细胞上，cd3ε/gfp与各jurkat g115γδtcr突变体共表达。gates描绘了用于测定btn2a1四聚体染色强度的细胞。(b)(a)中门控的每个群体的代表性btn2a1四聚体染色(深灰色)和单独的链霉亲和素对照(灰色)。(c)在存在(深灰色)或不存在(灰色)4μm唑来膦酸盐的情况下，在含有lm-mel-75wt apc的共培养物中jurkat g115突变体上的代表性cd69诱导(d)在平板结合的抗cd3/抗cd28(各10μg/ml，深灰色)或单独(灰色)过夜培养后，jurkat g115γδtcr突变体上的cd69诱导。(d)中的数据描绘了n＝2个独立实验的平均值
±
sem。nd：未测试。
[0475]
图23.btn2a1与vγ9vδ2
+
γδtcr结合不需要复杂的n-聚糖。在哺乳动物expi293f中产生具有复杂聚糖的btn2a1胞外结构域，在gnti缺陷的hek-293s细胞中产生具有简单聚糖的btn2a1胞外结构域。后者按照制造商的说明书(neb)在室温下在glycobuffer 3中用内切糖苷酶h处理过夜，得到去糖基化的btn2a1。(a)不同生物素化btn2a1胞外结构域的sds-page。(b)使用由各批次的生物素化btn2a1胞外结构域产生的藻红蛋白缀合的四聚体或单独的对照链霉亲和素(sav.)将亲本(tcr-)j.rt3-t3.5(顶行)、j.rt3-t3.5.9c2 vγ5vδ1
+
γδtcr(中行)和jurkat j.rt3-t3.5.g115 vγ9vδ2
+
γδtcr(底行)和细胞系与抗cd3ε-别藻蓝蛋白一起共染色。在每个样品中还测量了btn2a1四聚体和抗cd3ε之间的fret(较低的直方图)。(c)在pbmc供体(左)或纯化和体外扩增的vδ2
+
γδt细胞的n＝3个样品上的糖基化(复杂或简单)btn2a1四聚体的染色(右侧图)。
[0476]
图24在循环单核细胞上表达btn2a1。与同型对照(igg2a,)或二次单独(白色)染色相比，不与btn2a2交叉反应的抗btn2a1克隆259和克隆229对来自两个健康pbmc供体的门控白细胞亚群的染色。直方图描述了以下细胞的染色：b细胞(cd19
+
cd3-)、cd4
+
t细胞(cd3
+
cd4
+
cd8-)、cd8
+
t细胞(cd3
+
cd4-cd8
+
)、γδt细胞(cd3
+
γδtcr
+
)、mait细胞(cd3
+
mr1-5-op-ru四聚体
+
)、nk细胞(cd3-cd56
+
)和单核细胞(cd14
+
)。相同的实验中包括亲本lm-mel-62和btn2a1
空
(较低的直方图)。(b)与(a)相同，除了图表描述了n＝4-5个供体的平均荧光强度(mfi)染色。(c)与亲本lm-mel-62和细胞相比，来自5个独立供体的体外扩增的vδ2
+
γδt细胞的btn2a1和对照gapdh的western免疫印迹分析。
[0477]
图25.btn2a1对于由γδt细胞产生磷酸抗原诱导的细胞因子非常重要。将指定的lm-mel-62细胞(wt或btn2a1-ko)与分离的γδt细胞(效应细胞与靶标的比率为2∶1)共培养，并用唑来膦酸盐处理。收集1天和3天后培养物上清液并(使用luminex试剂盒)进行细胞因子分析。数据点是来自独立培养和处理的单个孔。
[0478]
图26.显示了抗btn2a1抗体244、253和259对人vγ9vδ2
+
γδt细胞表现出刺激活性。(a)如图所示，过夜培养
±
10μg/ml的抗btn2a1抗体或同型对照(igg2a克隆bm4)后的体外预扩增的vγ9vδ2
+
γδt细胞上的cd25表达。(b)通过细胞计数珠阵列检测来自相同培养物的干扰素-γ的产生。数据代表汇总自两个独立实验的n＝8个供体。
[0479]
图27.显示了抗btn2a1抗体253和259可诱导肿瘤细胞裂解。(a)在lm-mel-75(浅灰色条和圆圈符号)或lm-mel-62(深灰色条和正方形符号)和抗体253、259、bm4(同型对照)、唑来膦酸盐(阳性对照)或hmbpp(阳性对照)存在下培养的vγ9vδ2
+
γδt细胞裂解肿瘤细
胞。(b)在与图19a相同的vγ9vδ2
+
γδt细胞上的cd25表达。
[0480]
图28(a)显示了抗btn2a1抗体-253和259通过cd25上调而不依赖于磷酸抗原激活vγ9vδ2。抗体259具有较高的激活潜力。不需要添加apc或磷酸抗原来使抗体发挥其激活潜力。(b)lm-mel-62细胞与vγ9vδ2细胞以1∶1的比率和不同量的抗体253或259共培养后的活力。在1和10μg/ml之间的两种抗体似乎都达到了最大杀伤力，其中抗体259是比抗体253更有效的细胞杀伤诱导剂。(c)lm-mel-62细胞与vγ9vδ2细胞以不同的效应细胞与靶细胞(e∶t)的比率共培养后的活力，其中vγ9vδ2为效应细胞，lm-mel-62细胞为靶点。vγ9vδ2来源于黑色素瘤患者(患者1)或健康供体，并且用抗体259或唑来膦酸盐处理以激活vγ9vδ2细胞。在治疗组和供体中，靶细胞活力随着效应细胞数量增加而降低表明细胞死亡对vγ9vδ2细胞的依赖性。
[0481]
图29从黑色素瘤患者(a和b)或健康供体(c和d)扩增的vγ9vδ2细胞的细胞因子/趋化因子分布散点图显示了2个独立复制品的平均值。将0处的值设定为0.1以允许在对数标度上出现。未检测到未显示的细胞因子/趋化因子。
[0482]
图30(a和b).示出了与bm4(同型处理)相比，在不同处理下指示的细胞因子/趋化因子表达的百分比变化。条形图显示了2个值的平均值的变化百分比，除了259，其中仅使用一个孔。未检测到未显示的细胞因子/趋化因子。
[0483]
图31.btn2a1增强了vγ9vδ1
+
t细胞系对其同源tcr配体的激活。(a)在与用cd1c、cd1d、btn2a1或对照btnl3的指示组合转染的小鼠3t3细胞apc共培养24h后，表达与人cd1c反应的vγ9vδ1
+
tcr或与人cd1d反应的vγ9vδ1
+
tcr或与人cd1d反应的vγ5vδ1
+
tcr(9c2)的t细胞系上的代表性cd69直方图和(b)cd69中位数的荧光强度。数据汇总自n＝4个独立实验。
具体实施方式
[0484]
综述
[0485]
在整个说明书中，除非另有特别说明或上下文另有要求，提及单个步骤、物质组成、步骤组或物质组成组应被认为包括一个和多个(即一个或多个)那些步骤、物质组成、步骤组或物质组成组。
[0486]
本领域技术人员将理解，除了具体描述的那些之外，本发明易于变化和修改。应当理解，本发明包括所有这些变化和修改。本发明还包括本说明书中单独或共同提及或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何两个或多个的任何和所有组合。
[0487]
本发明不限于本文描述的具体实施例的范围，这些实施例仅用于示例性目的。功能等同的产品、组合物和方法显然在本发明的范围内。
[0488]
除非另有明确说明，否则本文中的任何示例应被视为比照适用于本发明的任何其他示例。换言之，本发明的任何特定示例可以与本发明的任何其他特定示例组合(除非相互排斥)。
[0489]
将采用公开特定特征或一组特征或方法或方法步骤的本发明的任何示例，以提供对放弃该特定特征或一组特征或方法或方法步骤的明确支持。
[0490]
除非另有明确定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均应被视为具有与本领
域(例如在细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学领域)普通技术人员通常理解的相同含义。
[0491]
除非另有说明，本发明中使用的重组蛋白、细胞培养和免疫技术都是标准程序，为本领域技术人员熟知。这些技术在以下来源的文献中都有描述和解释，例如，约翰
·
威利父子出版公司出版的《分子克隆实用指南》(j.perbal，a practical guide to molecular cloning，john wiley and sons(1984))；冷泉港实验室出版社出版的j.sambrook等人的《分子克隆实验指南》(j.sambrook et al.,molecular cloning:a laboratory manual，cold spring harbor laboratory press(1989))；irl出版社出版的t.a.brown(编者)的《基本分子生物学：实用方法》第1卷和第2卷(t.a.brown(editor),essential molecular biology:a practical approach,volumes 1and 2,irl press(1991)；irl出版社出版的d.m.glover和b.d.hames(编者)的《dna克隆：一种实用的方法》第1-4卷(d.m.glover and b.d.hames(editors),dna cloning:a practical approach,volumes 1-4,irl press(1995和1996)；格林出版联合公司与约翰威立父子出版公司出版的f.m.ausubel等人(编者)的《最新分子生物学实验方法汇编》(f.m.ausubel et al.(editors),current protocols in molecular biology，greene pub.associates and wiley-interscience)(1988，包括到目前为止的所有更新)；冷泉港实验室的ed harlow和david lane(编者)的《抗体技术实验指南》(ed harlow and david lane(editors),antibodies:a laboratory manual，cold spring harbor laboratory，(1988))；以及约翰
·
威利父子出版公司出版的j.e.coligan等人(编者)的《免疫学实验指南》(current protocols in immunology,john wiley&sons)(包括目前为止的所有更新)。
[0492]
本文中可变区及其部分、抗体及其片段的描述和定义可参见下列讨论来进一步阐明：kabat免疫学相关蛋白质序列(美国马里兰州贝塞斯达，美国国立卫生研究院，1987和1991)(kabat sequences of proteins of immunological interest,national institutes of health,bethesda,md.,1987and 1991)；bork等人j mol.biol.242,309-320,1994；chothia和lesk j.mol biol.196:901-917,1987；chothia等人nature 342,877-883,1989和/或al-lazikani等人j mol biol 273,927-948,1997。
[0493]
术语“和/或”，例如“x和/或y”应理解为“x和y”或“x或y”，并应被视为对两种含义或其中一种含义提供明确支持。
[0494]
在整个说明书中，词语“包括(comprise)”或诸如“包括(comprises或comprising)”的变化形式将被理解为意指包括所陈述的要素、整体或步骤，或要素、整体或步骤的组，但不排除任何其他要素、整体或步骤，或要素、整体或步骤的组。
[0495]
如本文所用，术语“来源于(derived from)”应当用于表示指定的整体可以从特定的源获得，尽管不必直接从该源获得。
[0496]
选定的定义
[0497]
术语“嗜乳脂蛋白(btn)”和“嗜乳脂蛋白样(btnl)”分子是指属于跨膜蛋白的免疫球蛋白(ig)超家族的免疫应答调节剂。它们在结构上与共刺激分子的b7家族相关并具有相似的免疫调节功能。btn参与t细胞发育、激活和抑制，以及参与调节t细胞与抗原呈递细胞和上皮细胞的相互作用。某些btn在遗传上与自身免疫和炎性疾病相关。人嗜乳脂蛋白家族包括七个成员，其被细分为三个亚家族：btn1、btn2和btn3。btn1亚家族仅含有原型单拷贝
btn1a1基因，而btn2和btn3亚家族各自分别含有三个基因btn2a1、btn2a2和btn2a3，以及btn3a1、btn3a2和btn3a3。btnl蛋白与btn家族成员具有相当大的同源性。人类基因组含有四个btnl基因：btnl2、3、8和9。
[0498]
嗜乳脂蛋白和btnl分子含有两个免疫球蛋白样结构域：n-末端ig-v样(本文称为“igv”)和c-末端ig-c样结构域(本文称为“igc”)。
[0499]
仅出于命名而非限制的目的，btn2a1的氨基酸序列教导于ncbi refseq np_001184162.1、np_001184163.1、np_008980.1或np_001184163.1和/或seq id no:1-4中。在一个实施方案中，btn2a1为人btn2a1。
[0500]
术语“γδt细胞”是指表达γ链和δ链作为t细胞受体(tcr)复合物的一部分的细胞。γδtcr由γ链和δ链组成，各自含有可变和恒定的ig结构域。由tcrδ和γ基因座内的可变区(v)、多变区(d)(仅针对tcrδ)、连接区(j)和恒定区(c)基因的基因重组形成该结构域。每条链的可变区含有3个暴露于溶剂的环，这些环通常与配体接触，称为cdr1、cdr2和cdr3区，其中后者的组成由于v-d-j组合多样性以及v-d和d-j重组位点处的非模板核苷酸变化(添加和缺失)而高度多样化。
[0501]
在人类中，γδt细胞可进一步分化为“vδ2”和“非vδ2细胞”，后者主要由vδ1链以及极少的vδ3链或vδ5链表达细胞组成，同时还描述了vδ4、vδ6、vδ7、vδ8。γδt细胞可以介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和吞噬作用，并且可以快速地对病原体特异性抗原起反应而无需预先分化或扩增。γδt细胞直接响应蛋白质和非肽抗原，因此不受mhc限制。至少一些γδt细胞特异性抗原表现出进化保守的分子模式，见于微生物病原体和诱导的自身抗原，其通过细胞应激、感染和转化而上调。这些抗原在本文中通常称为“磷酸抗原(phosphoantigen)”或pag。vγ9
+
γδt细胞也可通过tcr和(共)受体对其他抗原和配体作出响应。
[0502]
此外，γδt细胞可如下所示进一步分类为一组多功能细胞群：产生ifn-γ的γδt细胞、产生il-17a的γδt细胞、抗原呈递γδt细胞、滤泡b辅助γδt细胞和调节性γδt细胞。γδt细胞可促进免疫应答，发挥直接细胞毒性、细胞因子产生和间接免疫应答。例如，产生ifn-γ的表型的特征在于增加的cd56表达和增强的细胞溶解应答。一些γδt细胞亚群可通过促进炎症和/或免疫抑制而促进疾病进展。例如，产生il-17a的γδt细胞广泛参与炎症应答，在感染和自身免疫疾病期间具有致病作用。
[0503]
γ和δ基因的互补决定区3(cdr3)区域在受体顶部形成相当大的凸起。由vγ9链和vδ2链组成的人tcr的特征在于c-v连接处的肘角。在vδ的cdr2环中，c
″
链与结构域内部β-折叠的c
′
链配对。
[0504]
术语“btn2a1激动剂(agonist)”是指特异性结合btn2a1并诱导或增强vγ9
+
γδtcr激活的分子。例如，激动剂结合btn2a1分子的一个或多个胞外结构域(igv和/或igc)。激动剂btn2a1可以诱导或增强vγ9
+
vδ2
+
和/或vγ9
+
vδ2-γδtcr激活。例如，激动剂btn2a1可以诱导或增强vγ9
+
γδtcr激活，包括但不限于vγ9
+
vδ2
+
和/或vγ9
+
vδ1
+
γδtcr激活。激活可以是抗原非依赖性的。例如，不受理论或动机的束缚，btn2a1激动剂与btn2a1的结合可以修饰btn2a1分子的一个或多个胞外结构域(igv和/或igc)，其方式为模拟抗原(例如pag)激活，作为从非刺激性btn2a1向刺激性btn2a1的转换。btn2a1激动剂可诱导vγ9
+
γδtcr激活，其动力学和效力与抗原结合相似。在一个实施方案中，btn2a1激动剂的结合导致btn2a1
分子在例如肿瘤细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和/或自然杀伤(nk)细胞的细胞表面上的组织的改变。例如，btn2a1激动剂可以促进在细胞表面上形成btn2a1/btn3复合物，例如btn2a1/btn3a1复合物。激动剂可与btn3a1交叉反应或可对btn2a1和btn3分子(例如btn3a1)具有双特异性。在另一个实施方案或又一个实施方案中，btn2a1激动剂的结合诱导γδt细胞上vγ9
+
tcr的连接和/或增加表达btn2a1的细胞的活性和/或存活率。btn2a1激动剂对γδt细胞具有刺激性，并且可以激活γδt细胞的细胞溶解功能、一种或多种细胞因子的产生或增殖中的一种或多种。
[0505]
术语“btn2a1拮抗剂(antagonist)”是指特异性结合btn2a1并抑制vγ9
+
γδtcr激活的分子。例如，拮抗剂结合btn2a1分子的一个或多个胞外结构域(igv和/或igc)。btn2a1拮抗剂可抑制vγ9
+
vδ2
+
和/或vγ9
+
vδ2-γδtcr激活。例如，btn2a1拮抗剂可以抑制vγ9
+
vδ2
+
和/或vγ9
+
vδ1
+
γδtcr激活。示例性btn2a1拮抗剂结合btn2a1分子的一个或多个胞外结构域(igv和/或igc)并抑制抗原(例如pag)激活、结合vγ9
+
γδtcr和/或阻止与btn3分子(例如btn3a1)的相互作用。btn2a1拮抗剂可诱导将btn2a1分子从刺激性btn2a1转换为非刺激性btn2a1的构象变化，从而例如阻止抗原激活和/或与btn3a1相互作用。btn2a1拮抗剂可结合btn2a1分子上与vγ9
+
tcr相互作用的位点或btn2a1分子上与btn3分子(例如btn3a1)相互作用的位点。例如，btn2a1拮抗剂可以是可溶性tcr。在另一个实例中，btn2a1拮抗剂可与btn3a1交叉反应或可对btn2a1和btn3分子(例如btn3a1)具有双特异性。btn2a1拮抗剂对γδt细胞具有抑制性，并且可以抑制γδt细胞的细胞溶解功能、一种或多种细胞因子的产生或增殖中的一种或多种。
[0506]
如本文所用，在γδt细胞激活的上下文中的术语“抑制(inhibit或inhibiting)”应理解为意指本发明的btn2a1拮抗剂降低或减少vγ9
+
γδtcr激活的水平。从前述内容将显而易见的是，本发明的btn2a1拮抗剂不需要完全抑制激活，而是仅需要将活性降低统计上显著的量，例如降低至少约10％、或约20％、或约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％。测定抑制vγ9
+
γδtcr激活的方法是本领域已知的和/或本文描述的。
[0507]
如本文所用，术语“btn2a1/btn3复合物”是指细胞(例如肿瘤细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、实质细胞和/或自然杀伤(nk)细胞)表面上的btn2a1和btn3分子的复合物(例如btn2a1和btn3a1复合物)。btn2a1/btn3复合物可以是异聚复合物或多聚复合物。复合物可以包含一种或多种btn3分子如btn3a1和btn3a2和/或其他蛋白质如atp结合盒转运蛋白a1(abca1)。复合物可以包含btn2a1二聚体。类似地，btn3分子可以以单体或二聚体形式存在。btn2a1和btn3分子可共同定位在细胞表面上，或可直接(例如交联)或间接(经由另一分子或蛋白质)缔合。btn2a1/btn3复合物可以直接或间接结合抗原。例如，btn2a1和/或btn3分子的胞质结构域可以直接或间接结合抗原。
[0508]
如本文所用，术语“癌症”是指具有自主生长能力的细胞，即以快速增殖的细胞生长为特征的异常状态或病症。过度增殖性和肿瘤性疾病状态可分类为病理性的，即表征或构成疾病状态；或可分类为非病理性的，即偏离正常但不与疾病状态相关。该术语意在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而不管组织病理学类型或侵袭阶段。
[0509]
如本文所用，关于btn2a1激动剂或拮抗剂的结合区与btn2a1分子的相互作用的术
语“结合”意指该相互作用取决于btn2a1分子上特定结构(例如表位)的存在。例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构而不是一般的蛋白质。如果抗体与表位“a”结合，在含有标记的“a”和蛋白质的反应中，含有表位“a”(或游离的、未标记的“a”)的分子的存在将减少与抗体结合的标记的“a”的量。
[0510]
如本文所用，术语“特异性结合(specifically binds)”应理解为意指btn2a1激动剂或拮抗剂上的结合区与btn2a1分子之间的结合相互作用取决于抗原决定簇或表位的存在。即使当存在于其他分子或生物体的混合物中时，结合区也优先结合或识别特定抗原决定簇或表位。在一个实例中，与替代抗原或细胞相比，结合区与特异性组分或表达该特异性组分的细胞的反应或缔合更频繁、更快速、持续时间更长和/或亲和力更强。通过阅读该定义还可以理解，例如，特异性结合特定组分的结合区可以特异性结合或可以不特异性结合第二抗原。因此，“特异性结合”不一定需要另一种抗原的排他性结合或不可检测的结合。术语“特异性结合(specifically bind)”在本文中可与“选择性结合(selectively bind)”互换使用。通常，本文提及的结合是指特异性结合，并且每个术语应被理解为提供对其他术语的明确支持。确定特异性结合的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。例如，使包含本发明的结合区的结合蛋白与组分或表达该组分的细胞或其突变形式或替代抗原接触。然后测定与组分或突变形式或替代抗原的结合，并认为如上所述结合的结合区与该组分特异性结合。在一个实例中，与组分或表达该组分的细胞的“特异性结合”意指结合区结合的平衡常数(kd)为10μm或更低、例如9μm或更低、8μm或更低、7μm或更低、6μm或更低、5μm或更低、4μm或更低、3μm或更低、2μm或更低、或1μm或更低、例如100nm或更低、例如50nm或更低、例如20nm或更低、例如1nm或更低、例如0.8nm或更低、1x10-8 m或更低、例如5x10-9
m或更低、例如3x10-9
m或更低、例如2.5x10-9
或更低。
[0511]
术语“重组体(recombinant)”应理解为是指人工基因重组的产物。因此，在抗体或其抗原结合片段的上下文中，该术语不包括受试者体内天然存在的抗体，该抗体是在b细胞成熟过程中发生的天然重组的产物。然而，如果这种抗体是分离的，则认为它是包含抗体可变区的分离的蛋白质。类似地，如果使用重组方法分离和表达编码蛋白质的核酸，则所得蛋白质为重组蛋白。重组蛋白还包括当其在细胞、组织或受试者(例如表达其的受试者)中时通过人工重组手段表达的蛋白。
[0512]
术语“蛋白质”应理解为包括单个多肽链，即通过肽键连接的一系列连续氨基酸或彼此共价或非共价连接的一系列多肽链(即多肽复合物)。例如，该系列多肽链可以使用合适的化学或二硫键共价连接。非共价键的实例包括氢键、离子键、范德华力和疏水相互作用。
[0513]
术语“多肽”或“多肽链”将从前述段落理解为意指通过肽键连接的一系列连续氨基酸。
[0514]
技术人员将意识到“抗体”通常被认为是包含由多个多肽链组成的可变区的蛋白质，例如包含轻链可变区(v
l
)的多肽和包含重链可变区(vh)的多肽。抗体通常还包含恒定结构域，其中一些可以排列成恒定区，在重链的情况下，恒定区包括恒定片段或可结晶片段(fc)。vh和v
l
相互作用形成包含抗原结合区的fv，该抗原结合区能够特异性结合一种或几种密切相关的抗原。通常，来自哺乳动物的轻链为κ轻链或λ轻链，来自哺乳动物的重链为α、δ、ε、γ或μ。抗体可以是任何类型(例如igg、ige、igm、igd、iga、和igy)、类别(例如igg1、igg2、
igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类。术语“抗体”还包括人源化抗体、灵长类化抗体、人抗体、合成人抗体和嵌合抗体。术语“抗体”还包括例如位于蛋白质(例如抗体)的n-末端的缺失编码的c-末端赖氨酸残基的变体、脱酰胺化的变体和/或糖基化的变体和/或包含焦谷氨酸的变体和/或缺失n-末端残基的变体(例如抗体或v区中的n-末端谷氨酰胺)和/或包含分泌信号的全部或部分的变体。编码的天冬酰胺残基的脱酰胺变体可导致产生异天冬氨酸和天冬氨酸亚型，或甚至产生涉及相邻氨基酸残基的琥珀酰胺。编码的谷氨酰胺残基的脱酰胺变体可产生谷氨酸。当提及特定的氨基酸序列时，包含这些序列和变体的异质混合物的组合物也包括在内。
[0515]
在本发明的上下文中，术语“半抗体(half antibody)”是指包含单个抗体重链和单个抗体轻链的蛋白质。术语“半抗体”还包括包含抗体轻链和抗体重链的蛋白质，其中抗体重链已被突变以防止与另一抗体重链缔合。
[0516]
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“全抗体”可互换使用，指与抗体的抗原结合片段相对的基本上完整形式的抗体。具体地，完整抗体包括具有包括fc区的重链和轻链的抗体。恒定结构域可以是野生型序列恒定结构域(例如人野生型序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。
[0517]
如本文所用，“可变区(variable region)”是指如本文所定义的抗体的轻链和/或重链的部分，该抗体特异性结合抗原且例如包括cdr的氨基酸序列；即，cdr1、cdr2和cdr3以及框架区(fr)。例如，可变区包含三个或四个fr(例如，fr1、fr2、fr3和任选地fr4)以及三个cdr。vh指重链的可变区。v
l
指轻链的可变区。
[0518]
如本文所用，术语“互补决定区”(同义词cdr；即cdr1、cdr2和cdr3是指抗体可变区的氨基酸残基，其存在是特异性抗原结合的主要贡献者。每个可变区通常具有三个cdr区，标识为cdr1、cdr2和cdr3。在一个实例中，根据kabat免疫学相关蛋白质序列(美国马里兰州贝塞斯达，美国国立卫生研究院，1987和1991)(本文也称为“kabat编号系统”)定义分配给cdr和fr的氨基酸位置。根据kabat编号系统，v
h fr和cdr定位如下：残基1-30(fr1)、31-35(cdr1)、36-49(fr2)、50-65(cdr2),66-94(fr3)、95-102(cdr3)和103-113(fr4)。根据kabat编号系统，v
l fr和cdr定位如下：残基1
–
23(frl)、24-34(cdr1)、35-49(fr2)、50-56(cdr2)、57-88(fr3)、89-97(cdr3)和98-107(fr4)。
[0519]“框架区”(下文称为fr)是除cdr残基以外的那些可变结构域残基。
[0520]
如本文所用，术语“fv”应理解为意指任何蛋白质，无论是由多个多肽组成还是由单个多肽组成，其中v
l
和vh缔合并形成具有抗原结合位点(即能够特异性结合抗原)的复合物。形成抗原结合位点的vh和v
l
可以位于单个多肽链中或不同的多肽链中。此外，本发明的fv(以及本发明的任何蛋白质)可具有多个抗原结合位点，其可结合或可不结合相同抗原。该术语应理解为包括直接来源于抗体的片段以及对应于使用重组方法产生的这种片段的蛋白质。在一些实例中，vh不与重链恒定区(ch)1连接和/或v
l
不与轻链恒定区(c
l
)连接。示例性的含有fv的多肽或蛋白质包括fab片段、fab'片段、f(ab')片段、scfv、二聚抗体、三聚抗体、四聚体或更高级复合物、或前述连接至其恒定区或结构域(例如ch2或ch3结构域)的任一种，例如微型抗体。“fab片段”由抗体的单价抗原结合片段组成，并且可以通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体来生产，以产生由完整轻链和重链部分组成的片段；或者可以使用重组方法来生产。抗体的“fab'片段”可通过用胃蛋白酶处理完整抗体、然后还原以产生由完整
轻链以及包含vh和单个恒定结构域的重链部分组成的分子而获得。每个以这种方式处理的抗体获得两个fab'片段。fab'片段也可以通过重组方法来生产。抗体的“f(ab')2片段”由通过两个二硫键连接在一起的两个fab'片段的二聚体组成，并且通过用胃蛋白酶处理整个抗体分子而不进行随后的还原而获得。“fab
2”片段是包含使用例如亮氨酸拉链或ch3结构域连接的两个fab片段的重组片段。“单链fv”或“scfv”是含有抗体可变区片段(fv)的重组分子，其中轻链可变区和重链可变区通过合适的柔性多肽接头共价连接。
[0521]
本文所用的术语“恒定区(constant region)”是指抗体的重链或轻链的一部分，而不是可变区。在重链中，恒定区通常包含多个恒定区和铰链区，例如，igg恒定区包含以下连接的组分：恒定重链(ch)1、接头、ch2和ch3。在重链中，恒定区包含fc。在轻链中，恒定区通常包含一个恒定结构域(c
l
1)。
[0522]
术语“可结晶片段”或“fc”或“fc区”或“fc部分”(其在本文中可互换使用)是指包含至少一个恒定结构域的抗体的区域，并且其通常(但不一定)是糖基化的并且其能够结合一种或多种fc受体和/或补体级联的组分。重链恒定区可以选自以下五种同型中的任一种：α、δ、ε、γ或μ。此外，各种亚类的重链(例如重链的igg亚类)负责不同的效应细胞功能，因此，通过选择所需的重链恒定区，可以产生具有所需效应细胞功能的蛋白质。示例性的重链恒定区为γ1(igg1)、γ2(igg2)和γ3(igg3)、或其杂合体。
[0523]
抗体的“抗原结合片段(antigen binding fragment)”包含完整抗体的一个或多个可变区。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；二聚抗体(diabody)；线性抗体；由抗体片段形成的单链抗体分子、半抗体和多特异性抗体。
[0524]
术语“稳定的igg4恒定区”应理解为是指已被修饰以降低fab臂交换或经历fab臂交换的倾向或形成半抗体的倾向的igg4恒定区。“fab臂交换”指人igg4的蛋白质修饰类型，其中igg4重链和连接的轻链(半分子)被交换为来自另一igg4分子的重-轻链对。因此，igg4分子可获得识别两种不同抗原的两种不同fab臂(产生双特异性分子)。fab臂交换在体内自然发生，并且可以通过纯化的血细胞或还原剂如还原型谷胱甘肽在体外诱导。
[0525]
如本文所用，术语“单特异性(monospecific)”是指包含一个或多个各自具有相同表位特异性的抗原结合位点的结合区。因此，单特异性结合区可包含单一抗原结合位点(例如fv、scfv、fab等)或可包含识别相同表位(例如彼此相同)的若干抗原结合位点，例如二聚抗体或抗体。结合区是“单特异性(monospecific)”的要求并不意味着它仅结合一种抗原，因为多种抗原可具有可被单一抗原结合位点结合的共有或高度相似的表位。仅结合一种抗原的单特异性结合区被称为“仅结合(exclusively bind)”该抗原。
[0526]
术语“多特异性(multispecific)”是指包含两个或多个抗原结合位点的结合区，每个结合位点结合不同的表位，例如每个结合不同的抗原。例如，多特异性结合区可包括识别相同蛋白质的两个或多个不同表位或可识别不同蛋白质(例如，btn2a1和btn3分子如btn3a1上)的两个或多个不同表位的抗原结合位点。在一个实例中，结合区可以是“双特异性的”，即它包括特异性结合两个不同表位的两个抗原结合位点。例如，双特异性结合区特异性结合或具有相同蛋白上的两个不同表位的特异性。在另一个实例中，双特异性结合区特异性结合两种不同蛋白质(例如btn2a1和btn3分子如btn3a1)上的两种不同表位。
[0527]
如本文所用，“可溶性t细胞受体”或“可溶性tcr”是指由全长(例如，膜结合的)受体链组成的tcr，不同的是，受体链的跨膜区被最低限度地缺失或突变使得受体在被细胞表
达时不会与膜结合。最典型地，可溶性受体将仅由野生型受体链的胞外结构域组成(即，缺乏跨膜和胞质结构域)。本发明的可溶性γδtcr由包含vγ9的γ链和δ链的异源二聚体组成(本文称为“可溶性vγ9
+
tcr”)。γ链和δ链的各种特定组合优选用于本发明的可溶性γδtcr，特别是对应于已知在体内存在的γδtcr亚群的那些，但应当理解，实际上具有包含vγ9的γ链和δ链的任何组合的可溶性tcr也预期用于本发明。优选地，可溶性γδtcr包含源自相同动物物种(例如，鼠、人)的γ和δ链。
[0528]
如本文所用，术语“疾病(disease)”、“障碍(disorder)”或“病症(condition)”是指对正常功能的破坏或干扰，并且不限于任何特定病症，并且将包括疾病或障碍。
[0529]
如本文所用，“有风险”发展疾病或病症或其复发或恶化的受试者可具有或可不具有可检测的疾病或疾病症状，并且在根据本发明的治疗之前可显示或可不显示可检测的疾病或疾病症状。“处于风险中(at risk)”表示受试者具有一种或多种风险因素，其是与疾病或病状的发展相关的可测量参数，如本领域中已知和/或本文所述。
[0530]
如本文所用，术语“治疗(treating、treat或treatment)”包括施用本文所述的蛋白质，从而减少或消除特定疾病或病症的至少一种症状或减缓疾病或病症的进展。
[0531]
如本文所用，术语“预防(preventing、prevent或prevention)”包括提供关于特定疾病或病症的发生或复发的预防。个体可能倾向于或有风险发生该疾病或疾病复发，但尚未被诊断出该疾病或复发。
[0532]“有效量”是指在必要的剂量和时间段内实现所需结果的至少有效量。例如，期望的结果可以是治疗或预防结果。有效量可以一次或多次施用。在本发明的一些实例中，术语“有效量”是指实现如本文所述的疾病或病症的治疗所需的量。在本发明的一些实例中，术语“有效量”是指实现vγ9
+
tcrγδt细胞激活或抑制vγ9
+
tcrγδt细胞激活所需的量。在本发明的一些实例中，术语“有效量”是指实现或抑制γδt细胞的细胞溶解功能、一种或多种细胞因子的产生或增殖中的一种或多种所需的量。有效量可根据待治疗的疾病或病症或待改变的因素以及根据体重、年龄、种族背景、性别、健康和/或身体状况和与待治疗的哺乳动物相关的其他因素而变化。通常，有效量将落在可由医师通过常规试验和实验确定的相对宽的范围(例如“剂量”范围)内。因此，该术语不应被解释为将本发明限于特定量，例如结合蛋白的重量或数量。有效量可以以单剂量或在治疗期间重复一次或几次的剂量施用。
[0533]“治疗有效量(therapeutically effective amount)”至少是实现特定疾病或病症的可测量改善所需的最小浓度。本文的治疗有效量可根据诸如患者的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体或其抗原结合片段在个体中所需应答的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中抗体或其抗原结合片段的任何毒性或有害作用被治疗有益作用超过的量。
[0534]
如本文所用，术语“预防有效量(prophylactically effective amount)”应理解为足以预防或抑制或延迟一种或多种疾病或病症或其并发症的可检测症状的发作的btn2a1激动剂或拮抗剂的量。
[0535]
如本文所用，术语“受试者(subject)”应理解为意指包括人在内的任何动物，例如哺乳动物。示例性受试者包括但不限于人和非人灵长类动物。例如，受试者是人。
[0536]
抗体
[0537]
在一个实例中，本发明的btn2a1激动剂或拮抗剂，即包含抗原结合结构域的蛋白质包含抗体或其抗原结合片段。
[0538]
基于免疫的方法
[0539]
产生抗体的方法是本领域已知的和/或描述于冷泉港实验室的harlow和lane(编者)的《抗体技术实验指南》(harlow and lane(editors)antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,(1988))中。通常，在此类方法中，将任选地与任何合适的或期望的载体、佐剂或药学上可接受的赋形剂一起配制的蛋白质或其免疫原性片段或表位或表达和展示其的细胞(即免疫原)施用于非人动物，例如小鼠、鸡、大鼠、兔、豚鼠、狗、马、牛、山羊或猪。免疫原可以经鼻内、肌内、皮下、静脉内、皮内、腹膜内或通过其他已知途径施用。
[0540]
多克隆抗体的产生可以通过在免疫后的各个点对免疫动物的血液取样来监测。如果需要达到所需的抗体滴度，可以进行一次或多次进一步的免疫。重复加强和滴定的过程直到达到合适的滴度。当获得所需水平的免疫原性时，将免疫动物取血并分离和储存血清，和/或将动物用于产生单克隆抗体(mab)。
[0541]
单克隆抗体是本发明考虑的抗体的一种示例性形式。术语“单克隆抗体(monoclonal antibody)”或“mab”是指能够结合相同抗原，例如结合抗原内的相同表位的同质抗体群。该术语不旨在限制抗体的来源或其制备方式。
[0542]
对于mab的产生，可以使用许多已知技术中的任何一种，例如，在us4196265或前述harlow和lane(1988)中举例说明的方法。
[0543]
例如，在足以刺激抗体产生细胞的条件下用免疫原免疫合适的动物。啮齿动物如兔、小鼠和大鼠是示例性动物。表达人免疫球蛋白但不表达例如鼠免疫球蛋白的基因工程小鼠也可用于产生本发明的抗体(例如，如wo 2002066630中所述)。
[0544]
免疫后，选择具有产生抗体潜力的体细胞例如b淋巴细胞(b细胞)用于mab生成方案。这些细胞可以获自脾、扁桃体或淋巴结的活组织检查，或获自外周血样品。然后将来自免疫动物的b细胞与永生骨髓瘤细胞融合，该永生骨髓瘤细胞通常来自与用免疫原免疫的动物相同的物种。
[0545]
通过在包含阻断组织培养基中核苷酸从头合成的试剂的选择性培养基中培养来扩增杂合体(hybrid)。示例性试剂是氨基蝶呤、甲氨蝶呤和重氮丝氨酸。
[0546]
对扩增的杂交瘤进行抗体特异性和/或效价的功能选择，例如通过流式细胞术和/或免疫组织化学和/或免疫测定(例如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬斑测定、斑点免疫测定等)。
[0547]
可替代地，使用abl-myc技术(neoclone，madison wi 53713，usa)产生分泌mab的细胞系(例如，如largaespada等人，j.immunol.methods.197:85-95,1996)。
[0548]
基于文库的方法
[0549]
本发明还涵盖抗体或其抗原结合片段(例如，包含其可变区)的文库的筛选。
[0550]
本发明考虑的文库的实例包括天然文库(来自未接受调查的受试者)、免疫文库(来自用抗原免疫的受试者)或合成文库。编码抗体或其区域(例如，可变区)的核酸通过常规技术克隆(例如，如sambrook和russell(编者)的《分子克隆实验指南》，第3版，1-3卷，冷泉港实验室出版社，2001)并使用本领域已知的方法用于编码和展示蛋白质。用于产生蛋白质文库的其他技术描述于例如us6300064(例如morphosys ag的hucal文库)；us5885793；us6204023；us6291158；或us6248516。
[0551]
根据本发明的抗原结合片段可以是可溶性分泌蛋白或可以作为融合蛋白呈现在细胞或颗粒(例如噬菌体或其他病毒、核糖体或孢子)的表面上。各种展示文库格式在本领域中是已知的。例如，文库是体外展示文库(例如核糖体展示文库、共价展示文库或mrna展示文库，例如如us7270969中所述)。在又一个实例中，展示文库是噬菌体展示文库，其中包含抗体的抗原结合片段的蛋白质在噬菌体上表达，例如如us6300064；us5885793；us6204023；us6291158；或us6248516中所述。其他噬菌体展示方法是本领域已知的，并且被本发明所考虑。类似地，本发明涵盖细胞展示方法，例如如us5516637中所述的细菌展示文库；例如如us6423538中所述的酵母展示文库；或哺乳动物展示文库。
[0552]
筛选展示文库的方法是本领域已知的。在一个实例中，使用亲和纯化筛选本发明的展示文库，例如如scopes(《蛋白质纯化的原理和方法》，第三版，springer verlag，1994)中所述。亲和纯化的方法通常包括使包含文库展示的抗原结合片段的蛋白质与靶抗原(例如btn2a1)接触，并在洗涤后洗脱保持与抗原结合的那些结构域。
[0553]
如果需要，通过筛选鉴定的任何可变区或scfv都可容易地修饰成完整抗体。将可变区或scfv修饰或重新格式化为完整抗体的示例性方法描述于例如jones等人，j immunol methods.354:85-90,2010；或jostock等人，j immunol methods,289:65-80,2004；或wo2012040793中。可替代地或另外地，使用标准克隆方法，例如，如ausubel等人(《分子生物学实验指南》，wiley interscience，isbn 047150338，1987)和/或sambrook等人(《分子克隆实验指南》，冷泉港实验室，纽约，第三版，2001)中所述。
[0554]
去免疫化、嵌合化、人源化、合成人源化、灵长类化(primatized)和人抗体或抗原结合片段
[0555]
本发明的抗体或抗原结合片段可以是人源化的。
[0556]
术语“人源化抗体(humanized antibody)”应理解为是指包含类人可变区(human-like variable region)的蛋白质，类人可变区包括来自非人物种(例如小鼠或大鼠或非人灵长类)的抗体的cdr，该cdr移植到或插入到来自人抗体的fr中(这种类型的抗体也称为“cdr移植抗体”)。人源化抗体还包括其中人蛋白的一个或多个残基被一个或多个氨基酸取代修饰和/或人抗体的一个或多个fr残基被相应的非人残基取代的抗体。人源化抗体还可包含既不存在于人抗体也不存在于非人抗体中的残基。抗体的任何其他区域(例如fc区域)通常是人的。人源化可以使用本领域已知的方法例如us5225539、us6054297、us7566771或us5585089进行。术语“人源化抗体”还包括超人源化抗体，例如，如us7732578中所述。类似的含义适用于术语“人源化抗原结合片段(humanized antigen binding fragment)”。
[0557]
本发明的抗体或其抗原结合片段可以是人抗体或其抗原结合片段。本文所用的术语“人抗体(人antibody)”是指具有在人中，例如在人种系或体细胞中或从使用这些区域产生的文库中发现的可变和任选恒定抗体区域的抗体。“人”抗体可以包括不由人序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机或定点突变引入的突变(特别是涉及保守取代的突变或蛋白的少量残基中例如蛋白的1、2、3、4或5个残基中的突变)。这些“人抗体”不一定需要作为人免疫应答的结果产生，相反，它们可以使用重组手段(例如，筛选噬菌体展示文库)和/或通过包含编码人抗体恒定区和/或可变区的核酸的转基因动物(例如，小鼠)和/或使用指导性选择(例如，如us5565332中所述)产生。该术语还包括这些抗体的亲和力成熟形式。为了本发明的目的，人抗体也将被认为包括包含来自人抗体的fr或包含来自人fr共有序列的fr
的蛋白质，并且其中一个或多个cdr是随机或半随机的，例如，如us6300064和/或us6248516中所述。类似的含义适用于术语“人抗原结合片段(人antigen binding fragment)”。
[0558]
本发明的抗体或其抗原结合片段可以是合成人源化抗体或其抗原结合片段。术语“合成人源化抗体(synhumanized antibody)”是指通过wo2007019620中描述的方法制备的抗体。合成人源化抗体包括抗体的可变区，其中可变区包含来自新世界灵长类抗体可变区的fr和来自非新世界灵长类抗体可变区的cdr。
[0559]
本发明的抗体或其抗原结合片段可以是灵长类化的。“灵长类化抗体(primatized antibody)”包含来自在免疫非人灵长类动物(例如猕猴)后产生的抗体的可变区。任选地，将非人灵长类抗体的可变区与人恒定区连接以产生灵长类化抗体。产生灵长类化抗体的示例性方法描述于us6113898中。
[0560]
在一个实例中，本发明的抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体或片段。术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”或“嵌合抗原结合片段(chimeric antigen binding fragment)”是指这样的抗体或片段，其中一个或多个可变结构域来自特定物种(例如，鼠科动物，如小鼠或大鼠)或属于特定抗体类别或亚类，而抗体或片段的其余部分来自另一物种(例如，人或非人灵长类动物)或属于另一抗体类别或亚类。在一个实例中，嵌合抗体包含来自非人抗体(例如鼠抗体)的vh和/或v
l
，且该抗体的剩余区域来自人抗体。这种嵌合抗体及其抗原结合片段的产生是本领域已知的，并且可以通过标准方法(如例如us6331415；us5807715；us4816567和us4816397中所述)实现
[0561]
本发明还考虑了去免疫化的抗体或其抗原结合片段，例如如wo2000034317和wo2004108158中所述。去免疫化的抗体和片段具有一个或多个表位，例如去除的b细胞表位或t细胞表位(即突变的)，从而降低受试者产生针对抗体或蛋白质的免疫应答的可能性。例如，分析本发明的抗体以鉴定一个或多个b或t细胞表位，并且该表位内的一个或多个氨基酸残基被突变，从而降低抗体的免疫原性。
[0562]
双特异性抗体
[0563]
本发明的抗体或抗原结合片段可以是双特异性抗体(bispecific antibody)或其片段。双特异性抗体是包含对不同抗原或表位具有特异性的两种类型的抗体或抗体片段(例如，两个半抗体)的分子。示例性双特异性抗体结合相同蛋白质的两个不同表位。可替代地，双特异性抗体结合两种不同蛋白质上的两种不同表位。
[0564]
示例性的“键和孔(key and hole)”或“旋钮和孔(knob and hole)”双特异性蛋白质如us5731168中所述。在一个实例中，恒定区(例如igg4恒定区)包含t366w突变(或旋钮)且恒定区(例如igg4恒定区)包含t366s、l368a和y407v突变(或孔)。在另一个实例中，第一恒定区包含t350v、t366l、k392l和t394w突变(旋钮)并且第二恒定区包含t350v、l351y、f405a和y407v突变(孔)。
[0565]
产生双特异性抗体的方法是本领域已知的，且本文描述了示例性方法。
[0566]
在一个实例中，igg型双特异性抗体由产生igg抗体的两种杂交瘤融合而成的杂交瘤(四价体瘤quadroma)分泌(milstein c等人，nature 1983,305:537-540)。在另一个实例中，抗体可以通过将构成两个目的igg的l链和h链的基因导入细胞中共表达来分泌(ridgway,jb等人，《蛋白质工程》(protein engineering)1996,9:617-621；merchant,am等人，《自然生物技术》(nature biotechnology)1998(16):677-681)
[0567]
在一个实例中，通过化学交联来源于不同抗体的fab's制备双特异性抗体片段(keler t等人，癌症研究(cancer research)1997,57:4008-4014)。
[0568]
在一个实例中，使用来自fos和jun等的亮氨酸拉链形成双特异性抗体片段(kostelny sa等人，《免疫学杂志》(j.of immunology)1992,148:1547-53)。
[0569]
在一个实例中，双特异性抗体片段以包含两个交叉scfv片段的双抗体形式制备(holliger等人，《美国国家科学院院刊》(proc.of the national academy of sciences of the usa)1993,90:6444-6448)。
[0570]
抗体片段
[0571]
单域抗体
[0572]
在一些实例中，本发明的抗体的抗原结合片段是或包含单域抗体(其可与术语“结构域抗体”或“dab”互换使用)。单域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域的单一多肽链。例如，单域抗体是纳米抗体。
[0573]
二聚抗体、三聚抗体、四聚抗体
[0574]
在一些实例中，本发明的抗原结合片段是或包含二聚抗体(diabody)、三聚抗体(triabody)、四聚抗体(tetrabody)或更高级蛋白质复合物，诸如wo98/044001和/或wo94/007921中描述的那些。
[0575]
例如，二聚抗体是包含两条缔合多肽链的蛋白质，每条多肽链包含结构v
l-x-vh或v
h-x-v
l
，其中x是包含不足以使单一多肽链中的vh和v
l
缔合(或形成fv)残基的接头或不存在x，并且其中一条多肽链的vh结合另一条多肽链的v
l
以形成抗原结合位点，即形成能够特异性结合一种或多种抗原的fv分子。v
l
和vh在每条多肽链中可以是相同的，或者v
l
和vh在每条多肽链中可以是不同的，以便形成双特异性二聚抗体(即，包含具有不同特异性的两个fv)。
[0576]
单链fv(scfv)片段
[0577]
本领域技术人员将意识到scfv包含单一多肽链中的vh和v
l
区以及vh和v
l
之间的多肽接头，该接头使得scfv形成抗原结合所需的结构(即，单一多肽链的vh和v
l
彼此结合形成fv)。例如，接头包含超过12个氨基酸残基，(gly4ser)3是scfv更有利的接头之一。
[0578]
在一个实例中，接头包含序列sggggsggggsggggs。
[0579]
本发明还考虑了二硫键稳定的fv(或difv或dsfv)，其中单个半胱氨酸残基被引入vh的fr和v
l
的fr，并且半胱氨酸残基通过二硫键连接以产生稳定的fv。
[0580]
可替代地或另外地，本发明涵盖二聚体scfv，即，包含通过非共价或共价连接(例如，通过亮氨酸拉链结构域(例如，来源于fos或jun))连接的两个scfv分子的蛋白质。可替代地，两个scfv通过足够长度的肽接头连接以允许两个scfv形成并结合抗原，例如，如us20060263367中所述。
[0581]
半抗体
[0582]
在一些实例中，本发明的抗原结合片段是半抗体(half-antibody)或半分子(half-molecule)。本领域技术人员将意识到半抗体是指包含单个重链和单个轻链的蛋白质。术语“半抗体”还包括包含抗体轻链和抗体重链的蛋白质，其中抗体重链已被突变以防止与另一抗体重链缔合。在一个实例中，当抗体解离形成两个分子时形成半抗体，每个分子含有单个重链和单个轻链。
和ignar中的v-nar，以便将它们与存在于常规4-链抗体中的重链可变区(称为“vh结构域”)和存在于常规4-链抗体中的轻链可变区(称为“v
l
结构域”)区分开来。
[0599]
重链免疫球蛋白不需要轻链的存在就能以高亲和力和高特异性结合相关抗原。这意味着单域结合片段可以来源于重链免疫球蛋白，其易于表达并且通常是稳定和可溶的。
[0600]
来自骆驼科动物的重链免疫球蛋白及其可变区以及它们的产生和/或分离和/或使用方法的一般描述尤其可参见以下参考文献wo94/04678、wo 97/49805和wo 97/49805
[0601]
来自软骨鱼的重链免疫球蛋白及其可变区以及它们的产生和/或分离和/或使用方法的一般描述尤其可参见wo2005118629。
[0602]
v样蛋白
[0603]
在一个实例中，本发明的抗原结合蛋白包含tcr。t细胞受体具有两个v结构域，它们组合成类似于抗体fv组件的结构。novotny等人，proc natl acad sci usa 88:8646-8650,1991描述了如何将t细胞受体的两个v结构域(称为α和β)融合并表达为单链多肽，以及进一步描述了如何改变表面残基以降低与抗体scfv直接相似的疏水性。描述了产生包含两个v-α和v-β结构域的单链t细胞受体或多聚tcr的其他出版物包括wo1999045110或wo2011107595。
[0604]
其他包含抗原结合结构域的非抗体蛋白质包括具有v样结构域的蛋白质，其通常是单体的。包含这种v样结构域的蛋白质的实例包括ctla-4、cd28和icos。包含这种v样结构域的蛋白质的进一步公开内容包括在wo1999045110中。
[0605]
粘附蛋白(adnectin)
[0606]
在一个实例中，本发明的抗原结合蛋白包含粘附蛋白。粘附蛋白基于人纤连蛋白的第十个iii型纤连蛋白(
10
fn3)结构域，其中环区被改变以赋予抗原结合。例如，可以工程化
10
fn3结构域的β夹心的一端的三个环以使粘附蛋白能够特异性识别抗原。更多细节参见us20080139791或wo2005056764。
[0607]
抗运载蛋白(anticalin)
[0608]
在另一个实例中，本发明的抗原结合蛋白包含抗运载蛋白。抗运载蛋白来源于脂质运载蛋白，其是转运小的疏水性分子如类固醇、胆色素、类维生素a和脂质的胞外蛋白家族。脂质运载蛋白具有刚性β-折叠二级结构，在锥形结构的开口端具有多个环，其可以被工程化以结合抗原。这类工程化脂质运载蛋白称为抗运载蛋白。对于抗运载蛋白的进一步描述，参见us7250297或us20070224633。
[0609]
亲和体(affibody)
[0610]
在另一个实例中，本发明的抗原结合蛋白包含亲和体。亲和体是来源于金黄色葡萄球菌蛋白a的z结构域(抗原结合结构域)的支架，其可以被工程化以结合抗原。z结构域由约58个氨基酸的三螺旋束组成。通过表面残基的随机化产生文库。更多细节参见ep1641818。
[0611]
avimer
[0612]
在另一个实例中，本发明的抗原结合蛋白包含avimer。avimer是来源于a结构域支架家族的多结构域蛋白。大约35个氨基酸的天然结构域采用确定的二硫键结构。多变区是通过对a结构域家族表现出的天然变异进行改组而产生的。更多细节参见wo2002088171。
[0613]
darpin
[0614]
在另一个实例中，本发明的抗原结合蛋白包含预设计锚蛋白重复蛋白(darpin)。darpin来源于锚蛋白(ankyrin)，其是介导整合膜蛋白与细胞骨架附着的蛋白质家族。单个锚蛋白重复序列是由两个α螺旋和一个β转角组成的33残基基序。它们可以被工程化以通过随机化每个重复的第一α螺旋和β转角中的残基来结合不同的靶抗原。它们的结合界面可以通过增加模块的数量来增加(亲和力成熟的方法)。更多细节参见us20040132028。
[0615]
膜联蛋白(annexin)
[0616]
在一个实例中，本发明的抗原结合蛋白包含膜联蛋白。
[0617]
膜联蛋白(也称为脂皮质蛋白)形成可溶性蛋白质家族，其以ca
2+
依赖性方式与暴露带负电荷的磷脂特别是磷脂酰丝氨酸(ps)的膜结合。膜联蛋白由高度保守的70个氨基酸结构域的四倍(特别是八倍)重复和可变的氨基(n)-末端结构域形成，认为该可变的氨基(n)-末端结构域导致了它们的功能特异性。膜联蛋白在各种细胞和生理过程例如提供与细胞形状变化相关的膜支架中非常重要。膜联蛋白也已显示参与囊泡的运输和组织、胞吐作用、胞吞作用以及钙离子通道形成。
[0618]
已知膜联蛋白种类ii、v和xi位于细胞膜内。膜联蛋白a5是最丰富的膜结合膜联蛋白支架。膜联蛋白a5在与膜的磷脂酰丝氨酸单元结合时可形成二维网络。膜联蛋白a5在内吞作用和胞吐作用以及其他细胞膜过程中有效稳定细胞形状的变化。
[0619]
膜联蛋白i类(或膜联蛋白a1)优先位于质膜的胞质面，并与膜的磷脂酰丝氨酸单元结合。膜联蛋白a1在激活膜上不形成二维网络。
[0620]
在一个实例中，膜联蛋白种类是膜联蛋白或其变体。膜联蛋白衍生物或其变体是本领域已知的，本文公开了示例性的衍生物或变体。举例而言，膜联蛋白变体/衍生物公开于wo199219279、wo2002067857、wo2007069895、wo2010140886、wo2012126157、schutters等人《细胞死亡和分化》(cell death and differentiation)20:49
–
56,2013或ungeth
ü
m等人，j biol chem.,286(3):1903-10,2011。
[0621]
例如，膜联蛋白衍生物可以是截短的，例如包括一个或多个结构域或比天然蛋白更少的氨基酸残基，或者可以含有取代的氨基酸。在一个实例中，膜联蛋白衍生物是截短的膜联蛋白1。例如，截短的膜联蛋白1不包含n-末端自切割位点(例如，缺失了41个n-末端氨基酸)。在一个实例中，修饰的膜联蛋白可具有包含氨基酸延伸的n-末端螯合位点如x
1-gly-x2，其中x1和x2选自gly和cys。在一个实例中，膜联蛋白衍生物或修饰的膜联蛋白结合磷脂酰丝氨酸。在一个实例中，膜联蛋白衍生物或修饰的膜联蛋白以与野生型膜联蛋白相似的水平结合磷脂酰丝氨酸。例如，膜联蛋白衍生物或修饰的膜联蛋白以与野生型膜联蛋白相同的水平结合磷脂酰丝氨酸。
[0622]
在一个实例中，本发明的抗原结合蛋白包含膜联蛋白a5。仅出于命名而非限制的目的，annexin a5的氨基酸序列教导于基因登录号id 308，ncbi参考序列np_001145和/或seq id no:5中。仅出于命名而非限制的目的，annexin a1的氨基酸序列教导于ncbi参考序列np_000691.1和/或seq id no:7中。
[0623]
富含γ-羧基谷氨酸(gla)结构域
[0624]
在一个实例中，本发明的抗原结合蛋白包含富含γ-羧基谷氨酸(gla)的结构域或其变体。
[0625]
gla结构域含有谷氨酸残基，其已经通过维生素k依赖性羧化进行翻译后修饰以形
成γ-羧基谷氨酸(gla)。
[0626]
已知包含gla结构域的蛋白是本领域已知的，包括但不限于维生素k依赖性蛋白s和z、凝血酶原、转甲状腺素蛋白、骨钙蛋白、基质gla蛋白、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链h2和生长停滞特异性蛋白6。
[0627]
乳凝集素结构域
[0628]
在一个实例中，本发明的抗原结合蛋白包含乳凝集素结构域。
[0629]
乳凝集素是由多种细胞类型分泌的糖蛋白，并且含有两个egf域和两个c域(c1c2和c2)，其与凝血因子v和viii的c1和c2域具有序列同源性。类似于这些凝血因子，乳凝集素以高亲和力结合含磷脂酰丝氨酸(ps)的膜。
[0630]
在一个实例中，乳凝集素结构域是c1c2结构域(例如，如seq id no:27所示)。在另一个实例中，乳凝集素结构域是c2结构域。
[0631]
蛋白激酶结构域
[0632]
在一个实例中，本发明提供了包含蛋白激酶c结构域的抗原结合蛋白。
[0633]
蛋白激酶c(pkc)是蛋白激酶家族或该家族的成员，该蛋白激酶通过磷酸化这些蛋白质上的丝氨酸和苏氨酸氨基酸残基的羟基来参与控制其他蛋白质的功能。
[0634]
pkc的结构是本领域已知的，并且由通过铰链区连接在一起的调节结构域和催化结构域组成。调节结构域包含c1和c2结构域，其分别结合dag和ca
2+
以将pkc募集到质膜。
[0635]
在一个实例中，蛋白激酶c结构域是c1结构域。在另一个实例中，蛋白激酶c结构域是c2结构域。
[0636]
普列克底物蛋白同源结构域
[0637]
在一个实例中，本发明提供了包含普列克底物蛋白同源(ph)结构域的抗原结合蛋白。
[0638]
ph结构域是本领域已知的，并且是小的模块结构域，其存在于广泛的参与细胞内信号传导的蛋白质中或作为细胞骨架的成分。ph结构域包含约120个氨基酸。该结构域可结合生物膜内的磷脂酰肌醇和蛋白质如异三聚体g蛋白的β/γ亚基。通过这些相互作用，ph结构域在将蛋白质募集至不同的膜中起作用，从而将它们靶向至适当的细胞区室或使它们能够与信号转导途径的其他组分相互作用。
[0639]
磷脂酰丝氨酸相互作用肽
[0640]
在一个实例中，本发明提供包含磷脂酰丝氨酸相互作用肽的抗原结合蛋白。合适的肽是本领域已知的，包括例如thapa等人，j.cell.mol.med.12.1649-1660,2008和kim等人，plos one,10(3):e0121171。psp1包括序列clsyypsyc(seq id no:28)。本发明还考虑了保持其结合磷脂酰丝氨酸的能力的psp1的变体。
[0641]
可溶性t细胞受体
[0642]
在一个实例中，本发明的btn2a1拮抗剂是可溶性vγ9
+
tcr。
[0643]
可用于本发明的可溶性vγ9
+
tcr通常为包含γ链的异二聚体，其包含vγ9
+
γ链和δ链，但包含两种不同γδ异二聚体或两种相同γδ异二聚体的多聚体(例如，四聚体)也预期用于本发明。
[0644]
本发明的可溶性vγ9
+
tcr可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法产生，并且最通常是由重组产生。根据本发明，可用于产生可溶性γδtcr的重组核酸分子通常包
含重组载体和编码γδtcr的一个或多个片段(例如链)的核酸序列。根据本发明，重组载体是工程化的(即人工产生的)核酸分子，其作为操纵选择的核酸序列和/或将这样的核酸序列导入宿主细胞的工具。因此，重组载体适用于克隆、测序和/或以其他方式操纵选择的核酸序列，例如通过将选择的核酸序列表达和/或递送至宿主细胞中以形成重组细胞。这样的载体通常含有异源核酸序列，即，与待克隆或递送的核酸序列非天然相邻的核酸序列，但是该载体还可以含有与编码目的蛋白质(例如，tcr链)的核酸序列天然相邻的调节核酸序列(例如，启动子、非翻译区)或可用于核酸分子表达的调节核酸序列。载体可以是rna或dna、原核或真核，且通常是质粒。
[0645]
通常，重组核酸分子包含与一个或多个转录控制序列有效连接的本发明的至少一个核酸分子。如本文所用，短语“重组分子(recombinant molecule)”或“重组核酸分子(recombinant nucleic acid molecule)”主要是指与转录控制序列可操作地连接的核酸分子或核酸序列，但当这类核酸分子是如本文所述的重组分子时，可与短语“核酸分子(nucleic acid molecule)”互换使用。根据本发明，短语“可操作地连接(operatively linked)”是指将核酸分子以这样的方式连接至转录控制序列，使得该分子在转染(即转化、转导、转染、缀合或导入)至宿主细胞中时能够表达。转录控制序列是控制转录起始、延伸或终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制转录起始的那些，例如启动子、增强子、操纵子和阻遏物序列。合适的转录控制序列包括可以在重组核酸分子将被导入的宿主细胞或生物体中起作用的任何转录控制序列。
[0646]
本发明的一种或多种重组分子可用于产生本发明的编码产物(例如可溶性γδtcr)。在一个实施方案中，通过在有效产生蛋白质的条件下表达本文所述的核酸分子来产生编码产物。生产编码蛋白的优选方法是用一种或多种重组分子转染宿主细胞以形成重组细胞。转染的合适宿主细胞包括但不限于可被转染的任何细菌、真菌(例如酵母)、昆虫、植物或动物细胞。宿主细胞可以是未转染的细胞或已经用至少一种其他重组核酸分子转染的细胞。本发明的所得蛋白质可以保留在重组细胞内；分泌到培养基中；分泌到两个细胞膜之间的空间中；或保留在细胞膜的外表面上。短语“回收蛋白质(recovering the protein)”是指收集含有蛋白质的整个培养基，并且不需要暗示另外的分离或纯化步骤。根据本发明产生的蛋白质可以使用多种标准蛋白质纯化技术纯化，例如但不限于亲和层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析、反相层析、伴刀豆球蛋白a层析、层析聚焦和差异增溶(differential solubilization)。根据本发明产生的蛋白质优选以“基本上纯的(substantially pure)”形式回收。如本文所用，“基本上纯的”是指允许在本发明的组合物和方法中有效使用可溶性γδtcr的纯度。
[0647]
举例而言，含有相关γ和δ基因(例如，编码γδtcr的γ和δ链的所需部分的核酸序列)的重组构建体可从头合成或可通过来源于表达所需受体的γδt细胞(例如，杂交瘤、克隆、转基因细胞)来源的tcr cdna的pcr产生。可以设计所需γ和δ基因的pcr扩增，以便省略链的跨膜和胞质结构域(即，产生可溶性受体)。优选地，保存了形成链间二硫键的基因部分，从而保留了γδ异二聚体的形成。此外，如果需要，可以将编码用于纯化或标记产物或构建体的选择标记的序列加入到构建体中。然后将扩增的γ和δcdna对克隆、序列验证、并转移到合适的载体中，例如含有双杆状病毒启动子的杆状病毒载体(例如pacuw51、pharmingen corp.、san diego、calif.)。
[0648]
然后将可溶性γδtcr dna构建体共转染到合适的宿主细胞中(例如，在杆状病毒载体的情况下，共转染到合适的昆虫宿主细胞中或在哺乳动物表达载体的情况下，共转染到合适的哺乳动物宿主细胞中)，该宿主细胞将表达重组受体并将其分泌到例如上清液中。含有可溶性γδtcr的培养上清液然后可以使用各种亲和柱纯化，例如镍-次氮基三乙酸亲和柱。产品可以浓缩和储存。本领域技术人员将清楚，其他方法和方案可用于产生用于本发明的可溶性tcr，并且这些方法明确预期用于本文。
[0649]
药物组合物
[0650]
合适地，在用于向受试者施用btn2a1激动剂或拮抗剂的组合物或方法中，btn2a1激动剂或拮抗剂与本领域中理解的药学上可接受的载体组合。因此，本发明的一个实例提供包含本发明的btn2a1激动剂或拮抗剂以及药学上可接受的载体的组合物(例如，药物组合物)。
[0651]
一般而言，“载体(carrier)”是指可安全施用于任何受试者(例如人)的固体或液体填充剂、粘合剂、稀释剂、包封物质、乳化剂、润湿剂、溶剂、悬浮剂、包衣或润滑剂。根据具体的给药途径，可以使用本领域已知的多种可接受的载体，例如《雷明登氏药学全书》(remington's pharmaceutical sciences)(mack publishing co.n.j.usa,1991)中所述。
[0652]
本发明的btn2a1激动剂或拮抗剂可用于肠胃外、局部、口服或局部施用、气溶胶施用或透皮施用，用于预防性或治疗性治疗。在一个实例中，btn2a1激动剂或拮抗剂胃肠外施用，例如皮下或静脉内施用。例如，静脉内施用btn2a1激动剂或拮抗剂。
[0653]
待施用的btn2a1激动剂或拮抗剂的制剂将根据施用途径和所选择的制剂(例如，溶液、乳液、胶囊)而变化。待施用的包含btn2a1激动剂或拮抗剂的合适的药物组合物可在生理学可接受的载体中制备。对于溶液或乳液，合适的载体包括例如水溶液或醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体可包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化林格氏或不挥发性油。本领域技术人员已知多种合适的水性载体，包括水、缓冲水、缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)、右旋糖溶液和甘氨酸。静脉内载体可包括各种添加剂、防腐剂、或流体、营养物或电解质补充剂(通常参见mack编著的《雷明登氏药学全书》，第16版(remington's pharmaceutical science,16th edition,mack,ed.1980)。组合物可以任选地含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如ph调节剂和缓冲剂以及毒性调节剂，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳酸钠。btn2a1激动剂或拮抗剂可在液体阶段储存或可冻干用于储存并在使用之前根据本领域已知的冻干和重构技术在合适的载体中重构。
[0654]
γδt细胞免疫应答的功能性测定
[0655]
本发明还涉及btn2a1激动剂或拮抗剂，其可以激活或抑制γδt细胞的细胞溶解功能、一种或多种细胞因子的产生和/或增殖。t细胞数量和功能可以通过检测t细胞的活性如细胞因子产生、增殖或细胞毒性的试验来监测。这种活性可能与临床结果相关。例如，在用btn2a1激动剂或拮抗剂治疗后，细胞溶解活性的激活可导致肿瘤靶标或感染细胞的溶解。激活和增加的细胞因子产生可导致肿瘤或其他靶标的细胞因子诱导的细胞死亡。
[0656]
通过激活γδt细胞的细胞溶解功能，意味着γδt细胞的细胞毒性增加，即γδt细胞对靶细胞的特异性溶解增加。通过抑制γδt细胞的细胞溶解功能，意味着γδt细胞的细胞毒性降低，即，γδt细胞对靶细胞的特异性溶解降低。γδt细胞的细胞溶解功能可以通过
例如直接细胞毒性测定来测量。细胞毒性测定通常包括将含有t细胞或pbmc的样品与负载有
51
cr或铕的靶混合，并测量靶细胞裂解后铬或铕的释放。经常使用替代靶标，例如肿瘤细胞系。靶标可以负载有抗原，例如pag。在存在或不存在btn2a1激动剂或拮抗剂的情况下孵育样品和靶标。通过与靶标的最大可实现裂解相比较，计算温育约4小时后靶标的裂解百分比。细胞毒性测定可用于监测被动递送的t细胞的活性和主动免疫治疗方法。
[0657]
通过激活或抑制γδt细胞产生一种或多种细胞因子，意味着分别增加或减少γδt细胞产生的一种或多种特定细胞因子(例如，ifn-γ、tnf-α、gm-csf、il-2、il-6、il-8、ip-10、mcp-1、mip-1α、mip-1β或il-17a)的总量。t细胞的细胞因子分泌可以通过测量大量细胞因子产生(通过elisa)、通过基于微珠的测定(例如luminex)、或计数产生单个细胞因子的t细胞(通过elispot测定)来检测。
[0658]
在elisa测定中，在存在或不存在btn2a1激动剂或拮抗剂的情况下，在添加或不添加表达btn2a1的细胞的情况下孵育pbmc样品，并且在限定的时间段之后，收获来自培养物的上清液并且添加至包被有针对目的细胞因子的抗体的微量滴定板中。加入与可检测标记或报道分子连接的抗体，洗涤平板并读数。通常，在每个孔中测量单个细胞因子，尽管在单个样品中可测量多达15个细胞因子。目的细胞因子的抗体可以与具有均匀的、不同比例的荧光染料的微球共价结合。然后加入与荧光报道染料缀合的检测抗体，并进行流式细胞术。通过对指示目的特定细胞因子的特定荧光进行门控，可以定量与报告荧光的量成比例的细胞因子的量。
[0659]
在基于微珠的测定如luminex中，通常将样品加入到预先包被有分析物特异性捕获抗体的颜色编码微珠的混合物中。抗体与目的分析物结合。加入对目的分析物特异的生物素化的检测抗体，并形成抗体-抗原夹心。加入荧光团缀合的链霉亲和素并与生物素化的检测抗体结合。在基于流动的检测仪器上读取微珠。一个激光器对微珠进行分类并确定被检测的分析物。第二激光器测定荧光团衍生信号的大小，其与结合的分析物的量成正比。
[0660]
elispot测定通常包括：用纯化的细胞因子特异性抗体包被96孔微量滴定板；封闭板以防止随机蛋白的非特异性吸收；在存在或不存在btn2a1激动剂或拮抗剂的情况下，以几种不同的稀释度将细胞因子分泌型t细胞与刺激细胞(stimulator cell)孵育；用去污剂裂解细胞；添加标记的第二抗体；以及检测抗体-细胞因子复合物。最后一步的产物通常是酶/底物反应产生的有色产物，可以通过显微镜、视觉或电子方式进行定量。每个斑点代表分泌目的细胞因子的单个细胞。
[0661]
也可以通过多参数流式细胞术检测γδt细胞产生的一种或多种细胞因子。这里，细胞因子分泌在γδt细胞中用布雷菲德菌素a(bfa)或莫能菌素(这两种蛋白质转运抑制剂以不同的方式作用于高尔基体，这最依赖于待检查的细胞因子)阻断4-24小时，然后将细胞表面染色以获得目的标记，然后固定并透化，接着用靶向目的细胞因子的荧光团偶联抗体进行细胞内染色。然后通过流式细胞术分析细胞。通过流式细胞术表征外周血、淋巴结或组织中t细胞的细胞因子分泌模式，可以监测人体的免疫应答。这可以在没有bfa或莫能菌素处理的情况下离体进行。
[0662]
通过激活或抑制γδt细胞的增殖，意味着分别增加或减少γδt细胞的数目。可用淋巴组织增生测定法来测量增殖。在存在或不存在btn2a1激动剂或拮抗剂的情况下，将纯化的t细胞或pbmc的样品与刺激细胞的各种稀释液混合。72-120小时后，加入[3h]胸苷，通
biotec)的pbs/2％胎牛血清(fbs)一起孵育。将小鼠nih-3t3细胞与抗cd16/cd32(克隆2.4g2，内部生产)一起孵育。然后将细胞与7-氨基放线菌素d(7-aad，sigma)或活力标记物(thermofisher)加抗体一起孵育(表1)。使用内部生产的单克隆抗体检测btn2a1和btn3a(见下文)。抗btn2a1 mab或匹配的同型对照(克隆bm4，内部生产)通过胺偶联(thermo fisher)与alexa缀合，且使用磺基-smcc异双功能交联剂将抗btn3a(克隆103.2)与r-藻红蛋白(prozyme)缀合。在一些实验中，使用山羊抗小鼠多克隆第二抗体pe(bd-pharmingen)检测未缀合的抗btn2a1 mab，随后进行封闭步骤(5％正常小鼠血清)。细胞也用四聚体vγ9vδ2
+
γδtcr、btn2a1或小鼠cd1d-α-galcer胞外结构域(内部生产，见下文)或单独的等量的链霉亲和素缀合物(bd)染色。滴定各试剂以测定最佳稀释因子。所有数据在lsrfortessa
tm
ii(bd)上获得，并用facsdiva和flowjo(bd)软件分析。分别使用时间、前向散射面积对高度和活性染料(viability dye)参数门控所有样品以排除不稳定事件、双峰和死细胞。
[0677]
表1.用于流式细胞术的抗体.
[0678]
[0679][0680]
γδt细胞分离和扩增
[0681]
在一些实验中，使用抗γδtcr-pecy7，随后抗藻红蛋白介导的磁珠纯化，或使用γδt细胞分离试剂盒(miltenyibiotec)，通过macs富集γδt细胞。富集后，使用ariaiii(bd)通过分选进一步纯化cd3
+
vδ2
+
γδt细胞。用平板结合的抗cd3ε(okt3，10μg/ml，bio-x-cell)、可溶性抗cd28(cd28.2，1μg/ml，bbd pharmingen)、植物凝集素(0.5μg/ml，sigma)和重组人il-2(100u/ml，peprotech)体外刺激富集的γδt细胞48小时，然后用il-2维持14-21天。在完全培养基中培养细胞，该完全培养基由补充有10％(v/v)fcs(jrh biosciences)、青霉素(100u/ml)、链霉素(100μg/ml)、glutamax(2mm)、丙酮酸钠(1mm)、非必需氨基酸(0.1mm)和ph 7.2-7.5的hepes缓冲液(15mm)(全部来自invitrogen life technologies)加上50μm 2-巯基乙醇(sigma-aldrich)的rpmi-1640和aim-v(invitrogen)的50∶50(v/v)混合物组成。
[0682]
转染
[0683]
将btn2a1、btn2a2、btn3a1、btn3a2、btnl3和btnl8(所有同型1)克隆到pmig ii哺乳动物表达载体(由d.vignali赠送(addgene质粒#52107)(j.holst等人(2006))中，并通过sanger测序进行验证。在前一天将小鼠nih-3t3、仓鼠cho-k1、人lm-mel-62细胞铺板，并根据制造商的说明书在optimem中使用fugene或viafect
tm
转染。48小时后(lm-mel-62细胞72小时)使基因表达，测试细胞的gfp和基因表达，随后用于表型分析或功能分析。
[0684]
γδt细胞功能分析
[0685]
在24孔板
±
唑来膦酸盐(4μm，sigma)中培养新鲜的pbmc(2
×
106)，并纯化抗btn2a1、btn3a1或同型对照igg1κ(mopc-21,biolegend)的mab(10μg/ml)。24小时后，通过流式细胞术评估cd3ε
+
γδtcr
+
vδ2
+/-γδt细胞激活，并根据制造商的说明书(bd)通过细胞计数微珠阵列测定细胞因子产生。对于图14中的测定，将pbmc在24孔板中培养并用抗btn2a1、btn3a1或同型对照的mab(10μg/ml)阻断30分钟。然后用hmbpp(0.5ng/ml，sigma)、唑来膦酸盐(4μm，sigma)和cef(1μg/ml，miltenyi)以及il-2(25u/ml，miltenyi)和golgiplug蛋白转
运抑制剂(bd biosciences)的组合刺激细胞18小时。将细胞表面染色，然后根据制造商的实验方案使用foxp3/转录因子染色缓冲液组(invitrogen)固定和透化，接着用抗ifn-γ(biolegend)染色。对于共培养测定，将纯化的和体外扩增的γδt细胞(5
×
105)在96孔板中与apc(3
×
105)一起孵育24h
±
唑来膦酸盐(4μm)，并通过如上所述的流式细胞术测定γδt细胞激活。或者(在图3c中)，将使用γδt细胞磁珠分离试剂盒(miltenyi)从pbmc供体纯化的4
×
104个原代γδt细胞与lm-mel-62wt或apc以2∶1的比率在1um唑来膦酸盐存在下培养2天。随后洗涤未粘附的细胞，并在不含apc的新鲜平板中，在添加100u/ml il-2的培养基中再培养7天。然后通过流式细胞术计数vδ2
+
γδt细胞。
[0686]
fret测定
[0687]
为了检测btn2a1和btn3a1胞外结构域之间的fret，将细胞用pe缀合的抗btn3a1(供体)和alexa647缀合的btn2a1(受体)染色。在补偿的黄色670/30通道中检测fret。合成含有长的(用于btn3a1和btnl3)或短的(用于btn2a1和btnl8)柔性n-末端接头(图19b)的cfp(mturquoise2，供体)和yfp(mvenus，受体)构建体(thermofisher)，并将其克隆到嗜乳脂蛋白构建体的c-末端，位于通过定点突变引入的框内mfei位点和也除去了pmig ires-gfp基序的3'sali位点之间。在紫色450/50通道中检测到cfp，使用黄色585/15检测到yfp，并且使用紫色530/30通道检测到fret，通过补偿从其去除cfp和yfp溢出。对于双转染子，在门控cfp
+
yfp
+
nih-3t3细胞上检测鉴定为fret
+
的细胞的频率，对于单转染子，检测鉴定为cfp
+
或yfp
+
的细胞的频率。
[0688]
肿瘤活力测定
[0689]
将肿瘤(104)细胞铺在rf-10的96孔板中。第二天，向2x104γδt细胞中加入100u/ml il-2(miltenyi)
±
1μm唑来膦酸盐(sigma)。孵育1或3天后，通过mts测定法评估活力，其中在spectrostar nano酶标仪(bmg labtech)上在490nm处测量吸光度，针对背景进行校正，并在每个时间点针对仅含有apc的孔进行归一化。
[0690]
单细胞γδtcr测序
[0691]
分别分选来自健康pbmc供体的cd3ε
+
γδtcr
+
vδ2
+
γδt细胞。然后用补充表2中所列的引物扩增γδtcr。然后将pcr扩增子克隆到含有γ链或δ链胞外结构域的phl-sec中(图8c)用于表达。
[0692]
全基因组crispr/cas9敲除筛选
[0693]
crispr/cas9敲除筛选基本上如j.young等人(2017)所述进行。简言之，将含有n＝6grna/基因的合并的慢病毒人grna敲除文库(geckov2，由feng zhang赠送，addgene#1000000048)以》500x覆盖度转化到endura
tm
电感受态细胞(lucigen)中，并在37℃下在1l液体luria肉汤培养物中生长16小时。纯化质粒dna(purelink
tm
gigaprep,thermofisher)，并通过测序pcr扩增的文库(illumina hiseq，每个样品60
×
106个读数)确认扩增前和扩增后文库中的grna丰度，其中《0.2％的grna丢失。使用(promega)通过用grna文库dna加包装质粒瞬时转染hek-293t细胞产生慢病毒颗粒，并使用嘌呤霉素(1μg/ml，thermofisher)在lm-mel-62细胞上滴定培养上清液以测定病毒滴度。用慢病毒文库以～0.3的感染复数转导lm-mel-62细胞的四个生物复制品(各2
×
108)。然后用嘌呤霉素再选择转导的细胞5天，之后将vγ9vδ2
+
γδtcr四聚体#6
低
细胞从每个复制品的一半(～6
×
107)中分选出来，且剩余的一半用作未分选的对照。将分选的细胞再扩增约2周，随后再分选。将其
再重复2次以充分富集澄清的vγ9vδ2
+
γδtcr四聚体#6
低
lm-mel-62细胞群(图9a)。然后如前所述(s.chen等人(2015))提取基因组dna，包括另外的酚-氯仿纯化步骤。如前所述(j.young等人(2017))，使用pcr(33个循环)，用基于pfu的dna聚合酶(herculaseiifusion，agilent technologies)和含有索引和接头序列的一步引物(idt ultramer oligos)，从基因组dna扩增来自未分选的～6
×
107和分选的～3
×
107细胞的grna电泳后凝胶提取扩增子(sv gel clean-up system,promega)，用(thermofisher)定量并用novaseq(illumina)测序。使用正向引物交错基序和反向8-mer条形码的组合，使用cutadapt(m.martin et al(2011))对样品数据进行解多路复用)，并使用r studio的edger软件包(m.d.robinson等人(2010))进行分析。使用processamplicons函数枚举向导，允许单个碱基对错配或移位的向导位置。至少五个样本中计数小于0.5/106的向导被排除在分析之外。在分散评估后，使用exacttest函数确定未分选和分选样品之间的差别grna表达，其中错误发现率(fdr)《0.05被认为具有统计学意义。
[0694]
可溶性蛋白的产生
[0695]
通过利用编码具有c-末端生物素连接酶(avitag
tm
)和his6标签的构建体的phl-sec载体dna，分别使用expifectamine或pei瞬时转染哺乳动物expi293f或gnti缺陷的hek-293s细胞，表达可溶性人γδtcr、嗜乳脂蛋白2a1和小鼠cd1d胞外结构域(a.r.aricescu等人(2006))。如前所述((h.f.koay等人(2019))产生mr1-5-op-ru四聚体。使用固定化金属亲和层析(imac)和凝胶过滤从培养上清液中纯化蛋白质，并使用bira(内部生产)酶促生物素化。通过尺寸排阻层析再纯化蛋白质并储存在-80℃。生物素化蛋白质与链霉亲和素-pe(bd)以4∶1的摩尔比进行四聚化。从头合成编码具有c-末端his6标签的嗜乳脂蛋白b30.2胞内结构域的dna构建体(thermofisher)，并克隆到pet-30细菌表达载体中。在用iptg(1mm)诱导后，bl21 de3(plyss)大肠杆菌在30℃过夜表达。洗涤细胞沉淀并使用超声波仪在pbs/1mm dtt中裂解，并使用imac和凝胶过滤从澄清的裂解物中纯化b30.2蛋白。
[0696]
抗btn2a1单克隆抗体的产生
[0697]
使用人抗体噬菌体展示文库筛选对btn2a1具有特异性的抗体克隆。筛选由三轮选择组成，以结合固定在链霉亲和素包被的顺磁珠(dynal)上的50nm重组可溶性c-末端his标记的btn2a1胞外结构域，其中非特异性结合物预吸附到也固定在链霉亲和素蛋白包被的微珠上的不相关对照his标记的蛋白质上。在充分洗涤后，洗脱结合的噬菌体并通过感染指数生长的细菌培养物而扩增过夜(tg1；stratagene)。然后将纯化的噬菌体用于随后的一轮淘选。三轮后，洗脱结合的噬菌体，并随机挑取190个克隆，通过elisa测试与固定在微孔板中的btn2a1的结合。阳性克隆的测序揭示了总共52个单独的抗体克隆，然后将其中45个亚克隆到哺乳动物表达载体中，用于在expi293f
tm
细胞(thermofisher)中表达并在mabselect sure树脂(ge lifesciences)上纯化为包含人igg
4 fab区和鼠igg2a fc区的全长igg分子。同型对照克隆bm4含有相同的fc区，除了具有不相关特异性的小鼠fab区。
[0698]
表2：
[0699]
[0700]
[0701][0702]
抗btn3a抗体的产生
[0703]
合成编码抗btn3a抗体可变结构域的dna构建体(克隆20.1和103.2；描述于palakodeti等人(2012))(thermofisher)，并克隆到含有小鼠ighv信号肽和igg1恒定区的哺乳动物表达载体中。如上所述在expi293f
tm
细胞中表达抗体，并使用蛋白g柱层析60(ge)纯化，然后将缓冲液交换到pbs中。
[0704]
酶联免疫吸附测定
[0705]
将纯化的重组蛋白(0.2-20μg/ml)在pbs缓冲液中的微孔板孔中于4℃固定过夜。然后通过在含有0.05％tween 20加5％脱脂奶粉或0.5％(w/v)牛血清白蛋白(bsa)的pbs中孵育来阻断非特异性结合。然后在pbs/0.05％tween-20/2％脱脂奶粉或0.5％bsa中，在2-5
μg/ml的抗体存在下，将孔于室温孵育60分钟，然后在pbs/0.05％tween-20中洗涤。然后将板与hrp标记的绵羊抗小鼠igg二抗(chemicon)或山羊抗小鼠igg二抗(millipore)孵育，随后使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物(sigma)检测，并使用酶标仪在450nm测量吸光度。
[0706]
crispr/cas9介导的敲除细胞系的产生
[0707]
对于btn2a1敲除系，根据制造商的实验方案将两种grna(5
′‑
tcacaaaggtggttcttcct-3
′
(seq id no:55)和5
′‑
caatagatgcatacggcaat-3
′
(seq id no:57))克隆到crispr核酸酶载体试剂盒(life technologies)中，并通过sanger测序进行序列验证。用lipofectamine 2000转染细胞，48小时后基于橙色荧光蛋白表达进行分选。将细胞培养并用抗btn2a1(克隆hu34c)染色，并分选阴性级分。对于btn3a1敲除系，使用含有三个特异性grna序列(5
′‑
ggcacttacgagatgcatac-3
′
(seq id no:59)；5
′‑
gagagacattcagcctataa-3
′
(seq id no:60)；5
′‑
accatcagaagttccctcct-3
′
(seq id no:61))的btn3a1 crispr/cas9 ko质粒试剂盒(santa cruz biotechnology)。用lipofectamine 3000(thermofisher)转染细胞，48小时后基于绿色荧光蛋白进行分选。将分选的细胞培养并用抗btn3a1(克隆103.2)染色，并将阴性级分分选并培养。
[0708]
jurkat测定
[0709]
lm-mel-62或lm-mel-75apc在96孔板中以2.5
×
104个细胞/孔孵育过夜。然后加入表达2
×
104g115突变体γδtcr的j.rt3-t3.5(tib-153
tm
)(jurkat)细胞
±
唑来膦酸盐、hmbpp或ipp 20小时。然后通过流式细胞术测量jurkat细胞上的cd69表达。使用表2中列出的引物通过定点突变产生了一组19个单残基丙氨酸(ala)突变体，每个突变体都位于vγ9vδ2
+
g115 tcr的vγ9或vδ2结构域内。将引物(idt)磷酸化(pnk，neb)，随后使用kapa hifi主混合物(kapa biosystems)，使用pmig中的wt g115作为模板进行25个循环的pcr，并用dpni(neb)消化pcr产物并用t4 dna连接酶(neb)连接。然后在转染前通过sanger测序验证构建体序列。为了检测g115 tcr突变体结合btn2a1四聚体的能力，将hek-293t细胞用单独的γ链或δ链突变体分别加上相应的wtδ或γ链、以及编码2a连接的人cd3γδεζ的pmig构建体，以1∶3的比率在optimem
tm
(gibco，thermo-fisher)中用hd(promega)进行转染。转染48小时后，通过吸取将hek293t细胞重悬，并对cd3ε表达和pe标记的btn2a1四聚体或对照pe缀合的链霉亲和素进行染色。通过流式细胞术在门控cd3
+
gfp
+
hek293t细胞上检测btn2a1四聚体与突变体g115 tcr相互作用的中位数的荧光强度(mfi)。
[0710]
通过用g115突变体tcr转导j.rt3-t3.5 jurkat细胞来评估g115突变体响应pag刺激的能力。将hek-293t细胞用每种特定的γ链或δ链突变体、分别加上相应的野生型δ或γ链、以及人cd3、pvsv(-g)和peq-pam3(-e)进行转染，以1∶3的比率与optimem
tm
中的hd混合。24小时后，收集病毒上清液并通过0.45μm ca注射器式滤器过滤，然后与jrt3-t3.5 jurakt细胞孵育12小时。该过程每天重复两次，持续四天。通过facs(bd facsaria
tm
iii)纯化cd3
+
gfp
+
细胞，并如上所述检测它们对野生型lm-mel-75apc呈递的pag的应答能力。
[0711]
为了测量表达g115γδtcr的jurkat细胞对抗btn3a1(克隆20.1)mab的应答性，将2.5
×
104lm-mel-75apc细胞与功能级20.1(10μg/ml，biolegend)或匹配的同型对照在室温下预孵育30分钟，随后铺于平底96孔板中。一旦apc粘附，加入2.5
×
104jurkat细胞，使最终抗体浓度为5μg/ml。共培养24小时后，通过流式细胞术测定cd3
+
gfp
+
jurkat细胞上的cd69水
平。
[0712]
表面等离子体共振
[0713]
spr实验在25℃下在proteon xpr36仪器(bio-rad)上使用10mm hepes-hcl(ph 7.4)、300mm nacl和0.005％tween-20缓冲液进行。γδtcr胞外结构域直接固定到用链霉亲和素蛋白预固定的biacore传感器芯片sa上的260个共振单位(ru)上。将可溶性嗜乳脂蛋白连续稀释(200-3.1μm)并以30μl/min的速率同时注射到测试和对照表面上。在从对照流动细胞(单独的链霉亲和素)和空白注射减去数据后，使用biacore t200评价软件(ge healthcare)和prism第8版(graphpad)分析相互作用，并推导出平衡时的平衡解离常数(kd)。
[0714]
等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry)
[0715]
在25℃下在microcal itc200仪器(ge healthcare)上进行itc实验。将btn2a1或btn3a1 b30.2结构域缓冲液交换到pbs中，并调节终浓度至100μm。将hmbpp(cayman chemical)或ipp调节终浓度至2mm，并以2μl增量连续注入细胞中，随后从分析中丢弃最初的0.4μl注射液。用microcal origin软件分析数据。
[0716]
共聚焦显微分析
[0717]
将lm-mel-75wt、btn2a1
空
、btn3a1
空
细胞在补充有10％(v/v)fcs(jrh biosciences)、青霉素(100u/ml)、链霉素(100μg/ml)、glutamax(2mm)、丙酮酸钠(1mm)、非必需氨基酸(0.1mm)和hepes缓冲液(15mm)ph7.2-7.5(全部来自nvitrogen life technologies)加50μm 2-巯基乙醇(sigma-aldrich)的rpmi-1640(thermo-fisher)中培养过夜，并使其粘附于腔室载玻片(lab-tek,thermo-fisher)。第二天，洗涤细胞，并与用optimem
tm
(thermo-fisher)稀释的人fc受体块(miltenyi biotec)在冰上孵育20分钟。洗涤细胞并用在冰上用optimem
tm
稀释的抗btn2a1-af647(克隆259)、抗btn3a-pe(克隆103.2)和抗pan-hlai类-af488(克隆w6/32，biolegend)染色20分钟。将细胞用1％多聚甲醛(electron microscopy sciences)的pbs溶液固定20分钟，然后用prolong gold antifade(thermo-fisher)固定并用#1盖玻片覆盖过夜。滴定各试剂以测定最佳稀释因子。在具有倒置的20
×
(0.8na)物镜和zen软件(zeiss)的lsm780激光扫描共焦显微镜上获得具有76.9nm横向和400nm轴向体素尺寸和1024
×
1024体素灰度的z堆栈单平铺图像。用488nm、561nm和633nm激光波长线激发荧光染料。用huygens professional(scientific volume imaging)对图像去卷积并用imaris(oxford instruments)软件进行分析。基于明视野通道制作限定成像细胞的目的区域，并使用imaris coloc模块计算体素的皮尔逊相关系数(pearson correlation coefficient)，其中基于每个染色的阴性对照为每个分析通道设置强度阈值。
[0718]
btn2a1是vγ9
+
γδtcr的配体
[0719]
为了鉴定vγ9vδ2
+
γδtcr的候选配体，本发明人生产了来源于pag反应性γδt细胞的可溶性vγ9vδ2
+
tcr四聚体(图8)，并将它们用于染色不同组的人细胞系。这显示了包括hek-293t在内的一些细胞系的清晰染色，而包括b细胞系c1r在内的其他细胞系则没有(图1a)。特别地，黑色素瘤细胞系lm-mel-62被强烈染色(a.behran等人(2013))(图1a)。使用全基因组敲除筛选(图9)，负责vγ9vδ2
+
tcr四聚体反应性的最重要的指导rna(grna)是btn2a1，与对照相比具有》13倍的富集(图1a和图9)。btn2a1是嗜乳脂蛋白家族的表征很差
的成员，在人中发现，但在小鼠中却没有发现。与btn3a1类似，它由两个胞外结构域(igv和igc)和一个胞内b30.2结构域组成。除了一项研究表明它可以糖基化依赖的方式(g.malcherek et al(2007))与c-型凝集素受体cd209(dc-sign)相互作用外，btn2a1通常被认为是孤儿受体。为了进一步研究该发现的重要性，本发明人证实了在两个独立的lm-mel-62btn2a1突变细胞系(和)中对vγ9vδ2
+
tcr四聚体的反应性丧失，不同lm-mel-75btn2a1突变细胞系也具有类似的结果(图1c和图10)。这与btn3a1表达无关，btn3a1表达在亲本lm-mel-62和btn2a1
空
细胞系之间基本上没有变化(图1c和图10a)。另外，btn3a1
空
细胞系的vγ9vδ2tcr四聚体反应性与亲本细胞系相当(图10b)。将btn2a1再导入lm-mel-62或或细胞恢复了vγ9vδ2tcr四聚体反应性，而用btn3a1转染则没有影响(图1d)。因此，btn2a1表达对于vγ9vδ2
+
tcr四聚体反应性是必需的。
[0720]
本发明人接下来生产了一组btn2a1反应性mab，其对btn2a2(87％胞外结构域同源性)表现出不同程度的交叉反应性，但对btn3a2(45％胞外结构域同源性)则没有(图11a-c)。这些mab对亲本lm-mel-62染色，但大多数不能结合lm-mel-62btn2a1
空
细胞系，证实了它们对btn2a1的反应性(图11d-e)。大多数抗btn2a1克隆阻断或部分阻断lm-mel-62、lm-mel-75和293t细胞上的vγ9vδ2tcr四聚体染色(图1e)，表明btn2a1是vγ9vδ2
+
γδtcr的配体。
[0721]
为了探究btn2a1是否选择性地结合vγ9vδ2
+
γδt细胞，本发明人生产了荧光btn2a1胞外结构域四聚体(图12)，其将pmbc内的cd3
+
t细胞亚群染色，但没有对其他细胞类型进行染色(图2a)。btn2a1四聚体
+
细胞是γδtcr
+
，但不是αβtcr
+
(图2a)。btn2a1四聚体基本上标记所有vγ9
+
vδ2
+
和vγ9
+
vδ1
+
γδt细胞，但没有标记vγ9-vδ1
+
γδt细胞，表明tcrγ链的vγ9结构域与反应性相关(图2b)。此外，荧光btn2a1四聚体与抗cd3εmab(p.batard et al(2002))之间的共振能量转移(fret)表明btn2a1四聚体在～10nm内与γδtcr结合(图2c)。为了直接评估btn2a1是否结合vγ9
+
γδtcr，本发明人进行了表面等离振子共振(spr)以测量可溶性btn2a1和γδtcr胞外结构域之间的相互作用。与原代γδt细胞中btn2a1四聚体反应性的模式一致，可溶性btn2a1 tcr#6(vγ9vδ2
+
)具有kd＝40μm的亲和力，类似于在经典αβt细胞中观察到的情况。它还以相当的亲和力(50μm)结合共表达与不相关vδ1
+
γ链配对的tcr#6γ链的“杂合”γδtcr。然而，btn2a1不结合由与vδ1
+
δ链配对的vγ5
+
γ链组成的γδtcr(图2d)。最后，本发明人测试了其他嗜乳脂蛋白家族成员是否能够结合vγ9vδ2tcr。btn2a2仅表现出非常弱的结合，并且btn3a1
+
btn3a2和btnl3
+
btnl8转染的细胞不结合vγ9vδ2tcr四聚体(图13)。因此，btn2a1是vγ9
+
γδtcr的配体。
[0722]
btn2a1对于对pag的γδt细胞应答很重要
[0723]
本发明人接下来确定btn2a1在pag介导的γδt细胞应答中是否重要。如所预期的，用诱导pag ipp积累的氨基二膦酸盐化合物唑来膦酸盐(a.j.roelofs等人(2009))培养的pbmc导致vδ2
+
而非vδ1
+
γδt细胞诱导cd25、下调表面cd3(图3a)以及ifn-γ和tnf产生(图3b)。与同型对照mab处理的样品相比，这些tcr依赖性激活的指示剂被抗btn2a1 mab克隆hu34显著抑制，而被克隆259和267抑制的程度较低。接下来，将纯化的体外预扩增的vγ9vδ2
+
t细胞与作为apc的亲代或btn2a1
空
lm-mel-62细胞一起培养。在亲本lm-mel-62apc的存在下，观察到在cd25上调和cd3下调方面对唑来膦酸盐的强vδ2
+
t细胞应答。然而，和apc都未能在不含apc的对照培养物上促进γδt细胞激活(图3c)。类似地，当使
用apc时，vδ2
+
γδ细胞的增殖扩增减少(图3d)。本发明人还观察到γδt细胞介导的唑来膦酸盐依赖性杀伤亲本lm-mel-62肿瘤细胞，这在细胞中未观察到，表明btn2a1对于肿瘤靶标的vγ9vδ2
+
t细胞细胞毒性很重要(图3d)。这些数据表明btn2a1对于对内源性形式的pag的γδt细胞应答很重要。
[0724]
vγ9vδ2
+
γδt细胞可在不存在apc的情况下自我呈递高亲和力外源形式的pag，例如微生物hmbpp(c.t.morita等人(1995))。btn2a1在这种情况下也是必不可少的，因为在中和抗btn2a1 mab(克隆hu34c、227、236和266)存在下纯化的体外预扩增vδ2
+
t细胞未能上调cd25并产生ifn-γ(图3e)。克隆267仅是hmbpp诱导的激活的部分抑制剂(图3e)。重要的是，这些mab不抑制抗cd3加抗cd28介导的激活(图3e)，也不阻断由来源于巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒和流感表位的病毒肽的混合物介导的初级cd8
+
αβt细胞激活(“cef”肽，图14)。因此，这些btn2a1 mab是pag驱动的t细胞免疫的自身和外源形式的特异性拮抗剂。总之，btn2a1在人vγ9vδ2
+
γδt细胞的pag介导的细胞因子产生、激活、增殖和肿瘤细胞毒性中起重要作用。
[0725]
btn2a1与btn3a1协同作用以引发γδt细胞的pag应答
[0726]
本发明人接下来确定btn2a1依赖性pag应答是否经由γδtcr信号传导特异性介导。在与亲本lm-mel-75或lm-mel-62apc共培养后，表达原型“g115”vγ9vδ2
+
tcr克隆型(t.j.allison等人(2001))的j.rt3-t3.5(jurkat)t细胞响应于唑来膦酸盐而上调cd69；然而，btn2a1
空
和btn3a1
空
apc在很大程度上不能诱导pag反应性(图4a)。未转导的(亲本)jurkat细胞或表达不相关γδtcr(克隆9c2；a.p.uldrich等人(2013))也未能应答pag。使用hmbpp和ipp获得了类似的结果(图15a-c)，表明btn2a1和btn3a1都需要以vγ9vδ2
+
γδtcr依赖性方式特异性介导pag应答。
[0727]
尽管btn3a1对于pag介导的应答是必需的，但强制btn3a1过表达不能赋予仓鼠和小鼠apc以pag驱动的γδt细胞刺激能力，表明需要其他因子。本发明人发现，用btn2a1和btn3a1组合但不单独转染的仓鼠和小鼠apc均能够pag依赖性激活γδt细胞(图4b和图16a-b)。尽管另一种嗜乳脂蛋白分子btn3a2对于该应答不是必需的，但当与btn2a1和btn3a1组合时，它适度增强γδt细胞激活，这与其在增加btn3a1活性中的潜在作用一致(p.vantourout等人(2018))。还测试了具有来自小鼠成对免疫球蛋白样2型受体β的不相关跨膜和细胞内结构域的修饰的btn2a1构建体，称为btn2a1δb30。这仍然在细胞表面表达并结合vγ9vδ2
+
tcr四聚体(图16c)，但它不赋予pag呈递能力(图4c)。因此，除了其胞外结构域在结合vγ9
+
γδtcr中的作用之外，btn2a1的胞内或跨膜结构域对于pag介导的vγ9vδ2
+
γδt细胞激活也可能是重要的。这似乎不是由于btn2a1的胞内b30.2结构域直接结合纯化的pag(hmbpp或ipp)，因为使用等温滴定量热法没有检测到这些分子之间的明显相互作用(图17)，这与如预期的btn3a1 b30.2结构域与pag之间的明显相互作用相反(a.sandstrom等人(2014)，s.gu等人(2017)，m.salim等人(2017))。
[0728]
最后，本发明人测试了btn2a1和btn3a1在相同细胞(顺式)或在不同细胞(反式)上表达时是否诱导pag介导的激活。与btn3a1
+
apc或btn3a1
+
btn3a2
+
apc混合的btn2a1
+
apc均不能引发针对pag的γδt细胞应答(图4d)，表明这些分子必须在相同的apc上表达以介导pag诱导的γδt细胞激活。
[0729]
btn2a1与细胞表面上的btn3a分子缔合
[0730]
对btn2a1和btn3a1顺式共表达的要求提高了它们相互缔合的可能性。用抗btn2a1和抗btn3a1/3a2/3a3(“btn3a分子”)mab染色的亲本lm-mel-75细胞在细胞表面上显示出类似的btn2a1和btn3a分子染色模式(图5a-c)。与任一与不相关对照(hla-a、b、c)的重叠相比，皮尔逊相关系数表明btn2a1和btn3a分子的染色之间显著重叠。因此，btn2a1和btn3a分子似乎在质膜上缔合(图5b)。此外，lm-mel-75细胞与抗btn2a1(克隆259)和抗btn3a(克隆103.2)的共染色产生清楚的fret信号(图5c)，指示细胞表面上的共定位(图5c)。用抗btn3a(克隆20.1)共染色不能引起fret，同样，一些其他抗btn2a1克隆(hu34c和267)仅产生较弱的fret，这可能是因为一些mab组合产生超过fret检测的10-nm极限(10-nm limit for fret detection)的空间分离的供体和受体荧光染料。使用用btn分子的不同组合转染的小鼠nih-3t3成纤维细胞得到类似的结果(图18)。有趣的是，用抗btn2a1和抗btn3a染色btn2a1δb30
+
btn3a1
+
或btn2a1δb30
+
btn3a2
+
nih-3t3细胞也产生清晰的fret。后一发现表明，这些分子之间的结合不依赖于b30.2结构域，因为btn3a2也缺乏b30.2结构域(图18)。
[0731]
本发明人接下来确定btn2a1和btn3a1的胞内结构域是否也通过产生青色荧光蛋白(cfp)或黄色荧光蛋白(yfp)-缀合的嗜乳脂蛋白构建体而缔合(图19)。小鼠nih-3t3成纤维细胞与btn2a1cfp+btn3a1
yfp
或btn2a1
yfp
+btn3a1
cfp
的共转染产生清晰的fret信号，类似于已知结合的阳性对照(嗜乳脂蛋白样分子3(btnl3)
cfp
+btnl8
yfp
)(p.vantourout等人(2018))。在btn3a1
cfp
+btnl8
yfp
或btnl3
cfp
+btn2a1
yfp
或单转染对照中观察到很少或没有fret(图5d和图20a)。本发明人还测试了pag是否调节btn2a1和btn3a1之间的fret信号，但没有检测到任何大的变化(图20b和20c)；然而，具有拮抗剂活性的抗btn2a1 mab克隆(来自图3d)都强烈破坏了它们的缔合(图21)。因此，btn2a1和btn3a1的胞外和胞内结构域紧密缔合。
[0732]
vγ9vδ2
+
γδtcr共识别至少两个配体
[0733]
鉴于btn2a1结合所有vγ9
+
γδtcr，而只有vγ9
+
vδ2
+
t细胞是pag反应性的，本发明人假设vδ2也参与相互作用。这种假设的推论可能是vγ9vδ2
+
γδtcr上的分开的结合结构域，一个负责结合btn2a1，位于种系编码的vγ9区内，另一个也负责pag反应性，包括vδ2特异性。vγ9残基arg20、glu70和his85(以及较小程度的glu22)突变为ala均导致btn2a1四聚体反应性的完全丧失，而vδ2突变均未对此产生影响(图6a)。这些vγ9敏感残基的侧链彼此紧密接近(glu70-his85距离his85-arg20距离arg20距离)，并且分别位于vγ9的abed反平行β-片层的b、d和e链的外表面。它们一起在vγ9的构架区内形成极性三联体(图6b)，这与btn2a1结合至绝大多数vγ9
+
t细胞一致(图2b)。因此，btn2a1似乎结合至vγ9的一侧，远离δ链且不在通常与ag识别相关的互补决定区(cdr)环附近。
[0734]
本发明人接下来检验了哪些残基对于介导对pag的功能性应答是重要的。虽然用γδtcr突变体转导的jurkat细胞在其表面上表达相似水平的cd3/γδtcr复合物，并且对固定的抗cd3 mab同等地应答(图22)，但对每个结合btn2a1三联体的γ链突变体的突变也消除了pag介导的jurkat细胞激活(图6b)。然而，vδ2编码的cdr2环的arg51和tcrγ链的cdr3环的lys108这两个另外残基的突变也消除了pag介导的激活(图6c和(h.wang等人(2010))。这些残基对btn2a1结合没有影响(图6b)，并且位于tcr的与推定的btn2a1足迹相对的一侧(分离)。然而，它们彼此非常接近(图6d)，从而潜在地代表了vγ9vδ2
+
γδtcr的pag介导的激活所必需的单独的结合界面，但对于btn2a1结合不是必需的。该第二结
合界面(i)通过种系编码残基的参与解释了vδ2
+
tcrδ链的重要性，以及(ii)通过在该环内接合特定残基解释了pag-反应性γδt细胞中cdr3γ基序的不变性质的重要性。
[0735]
最后，本发明人测试了激动剂btn3a1 mab(克隆20.1)介导的激活，其被认为通过btn3a1的构象调节或交联来模拟pag介导的信号传导(c.harly等人(2012))。虽然激动剂btn3a1 mab脉冲的亲本apc诱导vγ9vδ2γδtcr
+
jurkat细胞激活(图7)，但btn2a1
空
apc中没有发生这种情况，表明btn2a1对于btn3a1介导的γδt细胞激活是关键的。此外，表达btn2a1结合残基his85、arg20和glu70的tcrγ链ala突变体以及arg51(δ链)和lys108(γ链)的btn2a1非依赖性突变体的jurkat细胞，都不能对用激动剂抗btn3a1 mab脉冲的亲本apc作出应答(图7)。因此，btn2a1和vγ9
+
tcrγ链之间的相互作用对于btn3a1驱动的γδt细胞应答是必需的，但不是足够的。这一事实可以解释为什么在早期研究中，激动剂抗btn3a1 mab在与用单独的人btn3a1转染的小鼠来源的apc共培养中不能诱导γδt细胞激活(a.sandstorm等人(2014))，因为小鼠不表达btn2a1。
[0736]
因此，这些突变研究揭示了pag和btn3a1介导的激活所必需的vγ9vδ2
+
γδtcr上存在两个单独的相互作用位点。vγ9一侧的一个位点对于btn2a1结合和激活是必需的，而掺入vδ2 cdr2和γ链cdr3环的另一个位点对于pag和btn3a1介导的激活是必需的。因此，vγ9vδ2
+
t细胞似乎通过不同的双配体相互作用由pag选择性地激活，由此btn2a1结合vγ9结构域并且另一配体(潜在地btn3a1)结合并入vγ9和vδ2结构域两者的单独界面。
[0737]
总结评论
[0738]
该发现支持了btn2a1和btn3在细胞表面缔合的模型，并且都是pag介导的γδt细胞激活所需的。该模型还表明，pag通过其细胞内b30.2结构域结合btn3(例如btn3a1)后，btn2a1-btn3复合物通过两个不同的结合位点与γδtcr结合：btn2a1与vγ9构架区结合，而另一种配体(可能是btn3，例如btn3a1)与tcr相对侧上的vδ2编码的cdr2和γ链编码的cdr3环结合。这代表了与αβt细胞的典型mhc-ag复合物识别高度不同的ag感测的独特模型。
[0739]
使用短发夹rna(shrna)敲除的先前研究发现btn2a1在pag呈递中没有明显作用(s.vavassori等人(2013))。然而，由于敲除效率仅为81％，且未测定btn2a1蛋白，残余btn2a1可能保留了功能。迄今为止，btn2a1的表征一直很差，只有一项早期研究鉴定了糖基化依赖性受体cd209((g.malcherek等人(2007))。本发明人发现n-连接的聚糖对于btn2a1与γδtcr的结合不是必需的(图24)，使得cd209不太可能在该相互作用中起作用。虽然关于btn2a1的表达模式知之甚少，但是rna分析预测了免疫细胞上的广泛表达。本发明人证实了btn2a1在循环t、b和nk细胞和单核细胞以及vγ9vδ2
+
t细胞上表达(图24)，潜在地解释了γδt细胞如何向自身呈递pag(c.t.morita等人(1995))。
[0740]
最近的研究揭示，人btnl3和btnl8共缔合，并刺激人vγ4
+
γδt细胞，其中btnl3与称为hv4环的γ链可变结构域的种系编码区相互作用(r.di marco barros等人(2016)；d.melandri等人(2018))。同样，小鼠btnl1和btnl6是连接的，并且对于肠vγ7
+
γδt细胞功能很重要，并且似乎与γδtcr的类似区域结合(r.di marco barros等人(2016)；d.melandri等人(2018))。相反，btn2a1
–
vγ9结合界面似乎比hv4环对vγ9tcr的abedβ-折叠的外表面表现出更大的依赖性，表明vγ9上的btn2a1结合足迹可位于更远离cdr环且更靠近cγ结构域的位置。鉴于嗜乳脂蛋白分子二聚化的倾向(例如btn3a1可形成稳定的v形同型二聚体，以及与btn3a2(s.gu等人(2017))和btnl3-btnl8异二聚体(d.melandri等人
(2018))形成异二聚体，btn2a1和btn3(例如btn3a1)之间的缔合可能代表直接相互作用，尽管其分子基础仍有待确定。
[0741]
与其他抗原呈递分子(mhc和mhc样分子)相比，异聚嗜乳脂蛋白复合物的识别代表了一类根本不同的免疫识别。还不知道pag如何改变该复合物以诱导抗原性，但它可能涉及嗜乳脂蛋白二聚体或多聚体重塑，和/或btn2a1和btn3的构象变化。其他相关分子如abca1(b.castella等人(2017))可能是直接需要的。
[0742]
这些发现显示btn2a1代表在针对传染病、癌症和自身免疫的γδt细胞介导的免疫疗法中激动和/或拮抗干预的直接靶标。
[0743]
肿瘤杀伤/抑制试验
[0744]
在以下实验中，使用pe-cy7缀合的抗γδtcr，随后通过抗藻红蛋白介导的磁珠纯化，通过macs富集γδt细胞(miltenyi biotec)。富集后，使用ariaiii(bd)通过分选进一步纯化cd3
+
vδ2
+
γδt细胞。用平板结合的抗cd3ε(okt3，10μg/ml，bio-x-cell)、可溶性抗cd28(cd28.2，1μg/ml，bbd pharmingen)、植物凝集素(0.5μg/ml，sigma)、il-15(50ng/ml)和重组人il-2(100u/ml，peprotech)体外刺激富集的γδt细胞48小时，然后用il-2和il-15维持14-21天。在完全培养基中培养细胞，该完全培养基由补充有10％(v/v)fcs(jrh biosciences)、青霉素(100u/ml)、链霉素(100μg/ml)、glutamax(2mm)、丙酮酸钠(1mm)、非必需氨基酸(0.1mm)和ph 7.2-7.5的hepes缓冲液(15mm)(全部来自invitrogen life technologies)加上50μm 2-巯基乙醇(sigma-aldrich)的rpmi-1640和aim-v(invitrogen)的50∶50(v/v)混合物组成。
[0745]
将lm-mel-62和lm-mel-75黑色素瘤细胞以1
×
104/孔铺板在96孔平底板中的补充有10％fbs的rpmi1640培养基中，并使其粘附过夜。以效应细胞:靶标＝2∶1的比率在含有100u/ml il-2的tcrpmi中加入t25γδt细胞，并用5μm唑来膦酸盐、0.5ng/ml hmbpp刺激，或不刺激。将激动性抗体253、259或同型对照bm4以10μg/ml加入各孔中。所有条件重复三次。将细胞在37℃孵育，并在第3天通过流式细胞术获得vd2
+
细胞。门控活细胞并通过分析cd25表达测定激活。通过mts测定法测定黑色素瘤细胞活力。将mts试剂以1∶5的比率加入到rpmi培养基中，每孔加入100μl。将细胞在37℃孵育30分钟，并在spectrostar纳米酶标仪上490nm处读板。
[0746]
在激动性抗体存在下测量γδt细胞激活
[0747]
在一些实验中，使用pe-cy7缀合的抗γδtcr，随后通过抗藻红蛋白介导的磁珠纯化，通过macs富集γδt细胞(miltenyi biotec)。富集后，使用ariaiii(bd)通过分选进一步纯化cd3
+
vδ2
+
γδt细胞。用平板结合的抗cd3ε(okt3，10μg/ml，bio-x-cell)、可溶性抗cd28(cd28.2，1μg/ml，bbd pharmingen)、植物凝集素(0.5μg/ml，sigma)、il-15(50ng/ml)和重组人il-2(100u/ml，peprotech)体外刺激富集的γδt细胞48小时，然后用il-2和il-15维持14-21天。在完全培养基中培养细胞，该完全培养基由补充有10％(v/v)fcs(jrh biosciences)、青霉素(100u/ml)、链霉素(100μg/ml)、glutamax(2mm)、丙酮酸钠(1mm)、非必需氨基酸(0.1mm)和ph 7.2-7.5的hepes缓冲液(15mm)(全部来自invitrogen life technologies)加上50μm 2-巯基乙醇(sigma-aldrich)的rpmi-1640和aim-v(invitrogen)的50∶50(v/v)混合物组成。
[0748]
将体外预扩增的cd3
+
vδ2
+
γδt细胞(5
×
105)与hmbpp(0.5ng/ml)
±
10μg/ml中和性
抗btn2a1 mab或同型对照一起培养24小时。通过流式细胞术测定cd25表达，且根据制造商的说明书通过细胞计数微珠阵列(bd bioscience)测定ifn-γ浓度。
[0749]
btn2a1激动性抗体的鉴定
[0750]
如上所述本发明人筛选了btn2a1特异性抗体组，以鉴定能够激动btn2a1的抗体。本发明人评估了抗btn2a1抗体激活γδt细胞的能力。本发明人评估了在用10μg/ml抗btn2a1抗体或同型对照抗体(bm4)培养细胞过夜后先前扩增的γδt细胞表面上cd25的上调。如图26a所示，抗体244、253和259均能够增加表达cd25的γδt细胞的百分比。
[0751]
本发明人还测量了在10μg/ml抗btn2a1抗体或同型对照抗体(bm4)存在下培养过夜后由γδt细胞分泌的干扰素γ的水平。分泌的干扰素γ是tcr依赖性激活的另一指示剂。如图26b所示，抗体244、253和259均能够增加分泌的干扰素γ的水平。
[0752]
本发明人还在共培养实验中测试了抗btn2a1抗体激活γδt细胞并杀伤癌细胞和/或防止癌细胞生长的能力。以2∶1的比率用γδt细胞和黑色素瘤细胞(lm-mel-75或lm-mel-62)进行培养。用抗体253或259或bm4(同型对照)或唑来膦酸盐(阳性对照)或hmbpp(阳性对照)培养细胞3天。如图27a所示，在抗体253或259存在下培养的细胞诱导至少一种黑色素瘤细胞系的细胞裂解水平与阳性对照相似。图27b显示了通过cd25上调评估的γδt细胞激活水平。特别地，图27b显示了在抗体253或259存在下培养的γδt细胞中表达水平上调。
[0753]
在不存在磷酸抗原的情况下γδt细胞激活和细胞死亡的诱导
[0754]
材料和方法
[0755]
luminex(pbmc)
[0756]
将来自健康供体(澳大利亚红十字会)的血液进行聚蔗糖分离(ficolled)，收集pbmc层，洗涤，并将5
×
105个细胞用所示抗体以一式两份@10μg/ml在补充有100u/ml il-2的500ul tcrpmi中处理，并在37℃和5％co2下孵育16小时。收集上清液并提交给crux biolabs(scoresby，vic，澳大利亚)用于luminex人20丛炎性组分析(luminex human 20-plex inflammation panel analysis)(epx200-12185-901)。这可测量以下分析物：gm-csf；icam-1、ifn-α；ifn-g、il-1α、il-1b、il-10、il-12p70、il-13、il-17a、il-4、il-8、ip-10、mcp-1、il-6、mip-1a、mip-1b、se-选择素、sp-选择素、tnf-α。所有样品均使用适当的对照品和标准品运行。用抗体259处理仅在一个孔中进行。
[0757]
luminex(vγ9vδ2)
[0758]
简言之，使用tcrγ/δ
+
t细胞分离试剂盒(miltenyi)从1名健康供体(澳大利亚红十字会)和1名癌症患者来源的pbmc分离vγ9vδ2细胞。在补充有100u/ml il-2、cd3(10μg/ml)和cd28(1μg/ml)的tcrpmi中刺激细胞48小时。洗涤细胞，并于37℃和5％co2下在补充有100u/ml il-2的tcrpmi中生长14天，然后冷冻。患者提供了知情同意书，研究根据hrec 14/425获得批准。将vγ9vδ2解冻并于37℃和5％co2下在补充有50u/ml il-2的tcrpmi中静置过夜。第二天，在补充有100u/ml il-2的200ul tcrpmi中，用所示抗体以一式两份@10μg/ml或唑来膦酸(4μm)或hmbpp(0.5ng/ml)处理2
×
105个细胞，并在37℃和5％co2下孵育16小时。收集上清液并提交给crux biolabs(scoresby，vic，澳大利亚)用于luminex人20丛炎性组分析(luminex human 20-plex inflammation panel analysis)(epx200-12185-901)。所有样品均使用适当的对照品和标准品运行。
[0759]
体外杀伤试验
[0760]
使用tcrγ/δ
+
t细胞分离试剂盒(miltenyi)从健康供体(澳大利亚红十字会)或癌症患者来源的pbmc分离vγ9vδ2细胞。患者提供了知情同意书，研究根据hrec 14/425获得批准。在补充有100u/ml il-2、cd3(10μg/ml)和cd28(1μg/ml)的tcrpmi中刺激细胞48小时。洗涤细胞，并于37℃和5％co2下在补充有100u/ml il-2的tcrpmi中生长14天，然后冷冻。将vγ9vδ2解冻并于37℃和5％co2下在补充有50u/ml il-2的tcrpmi中静置过夜。
[0761]
对于所有测定，将lm-mel-62黑色素瘤细胞以10,000个细胞/孔铺板在96孔平底板中的100μl rf10培养基中，并在37℃和5％co2下粘附过夜。
[0762]
e∶t滴定
[0763]
第二天，洗涤vγ9vδ2细胞，计数，并以e∶t为2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8或1∶16的比率加入到补充有100u/ml il-2和4um唑来膦酸盐或10ug/ml抗体259的tcrpmi中的黑色素瘤细胞中。
[0764]
抗体滴定
[0765]
洗涤vγ9vδ2细胞，计数。并以10,000个细胞/孔铺板于补充有100u/ml il-2的tcrpmi中。将抗btn2a1抗体253、259或bm4同型对照以10、1、0.1和0.01μg/ml的稀释度一式两份加入孔中。将细胞在37℃和5％co2下孵育。在第3天，洗涤vγ9vδ2细胞，并根据制造商的实验方案(promega，usa)将100μl mts试剂加入孔中1小时。随后使用spectrostar纳米酶标仪(bmg labtech)在490nm处读板以测定针对背景吸光度校正的细胞活力(cell viability)。
[0766]
流式细胞术
[0767]
如前所述将vγ9vδ2细胞针对cd3、vδ2、cd25和live/dead活性染料染色，并在canto流式细胞仪(bd)上分析。在淋巴细胞、单细胞、活细胞、cd3
+
vδ2
+
上门控细胞，并基于cd25表达测定激活。
[0768]
讨论
[0769]
vγ9vδ2细胞对磷酸抗原呈递有影响，其中上调包括cd25和cd69的激活标志物以及细胞因子表达这需要btn2a1和btn3a1在抗原呈递细胞表面表达。抗btn2a1抗体259和253可模拟磷酸抗原介导的不同程度的激活，而不存在甲羟戊酸/非甲羟戊酸途径的这些中间物(图28a)。
[0770]
在功能上，这种激活导致预扩增的vγ9vδ2t细胞识别并杀伤黑色素瘤肿瘤细胞(本文称为：lm-mel-62)的能力的剂量依赖性增加。将来源于2个不同供体(黑色素瘤患者)的vγ9vδ2细胞预扩增并与黑色素瘤细胞(1:1比率)共孵育，并用不同量的抗体253或抗体259处理。类似于图28a中的激活数据，与抗体253相比，用抗体259处理导致lm-mel-62细胞存活率(viability rate)较低。较高浓度的抗体259增强了vγ9vδ2细胞介导的肿瘤细胞杀伤，在1和10μg/ml之间实现了在两个供体之间的最大杀伤(图28b)。
[0771]
肿瘤细胞杀伤不仅取决于抗体的剂量，而且取决于效应细胞(vγ9vδ2)与靶细胞(lm-mel-62)的比率(图28c)。当与唑来膦酸处理相比时，抗体259介导的细胞杀伤显示与e∶t相关(更多的效应细胞导致更高的杀伤)，尽管在两个供体中杀伤发生的程度较低。有趣的是，与健康供体来源的细胞相比，来自癌症患者(患者1)的vγ9vδ2细胞在独立于所用刺激的情况下杀伤肿瘤细胞的能力似乎较低。这表明vγ9vδ2细胞在癌症环境中的(可逆的)功能改变，可能延伸超出肿瘤微环境(细胞从循环中分离)。
[0772]
这些差异部分反映在来源于体外扩增的vγ9vδ2细胞并用唑来膦酸盐、hmbpp激活或用所示的不同抗体处理的细胞因子/趋化因子分布中(图29a和b，表3和4)。在健康供体和患者来源的vγ9vδ2中，用唑来膦酸盐和hmbpp处理导致gmcsf、icam-1、ifnγ、il-13、mip-1a、mip-1b、se-选择素、sp-选择素和tnfα的表达/分泌增加。除了icam1之外，当使用更强的刺激-hmbpp时，所有这些都更高地表达，icam-1表达上调至与唑来膦酸盐和hmbpp相似的程度。il-17a和il-4的分泌只能在hmbpp激活的情况下检测到。鉴于il-17的免疫抑制功能，这证明了能够微调激活和阻断信号以实现最期望的结果的必要性。用2种激动性抗btn2a1抗体253和259的处理显示出与用唑来膦酸盐和hmbpp的处理类似的模式，然而253是较弱的刺激。
[0773]
表3.如图29a所示的来自患者1的γδt细胞中的细胞因子和趋化因子表达(以pg/ml计)
[0774][0775][0776]
表4.如图29b所示的来自健康供体的γδt细胞中的细胞因子和趋化因子表达(以pg/ml计)。
[0777][0778]
在健康供体来源的vγ9vδ2细胞中，用抗体253处理仅导致分泌的gmcsf的量的少量增加，但其他测量的细胞因子/趋化因子没有增加。在癌症患者来源的vγ9vδ2细胞中没有检测到任何分析物的增加，然而多种分析物的基础水平高于健康供体来源的细胞，当单独用同型抗体(bm4)处理时，其通常没有可检测的表达。
[0779]
抗体259导致两个供体的多种分析物的显著增加，包括gmcsf、ifnγ、il-13、il-17(非常低)、mip1α和mip1β、se-选择素和sp-选择素以及tnfα。健康供体来源的细胞的独特之处在于抗体259处理后icam1的增加和癌症来源的细胞中il-4的从头表达增加超过400pg/ml。在健康供体中，经抗体259处理未检测到il-4。
[0780]
本发明人另外使用btn2a1拮抗性抗体来探索可通过抑制btn2a1γδtcr结合/激活来阻断预扩增的vγ9vδ2细胞内基线表达的细胞因子。在健康供体细胞中，与同型(bm4)处理的对照相比，34c1处理导致mip1α和b以及gmcsf的下调。在具有高得多的细胞因子基线表达的癌症患者来源的细胞中，可检测到gmcsf、icam1(至不可检测的水平)、ifnγ、il-13、mip1α和mip1β以及se-选择素的水平的降低，并且btn2a1阻断可能是降低这些因子的有效治疗策略。
[0781]
为了探究我们的激动性抗btn2a1抗体259如何影响pbmc环境中的细胞因子/趋化因子表达，本发明人用抗体259和抗体229(拮抗性抗btn2a1抗体)以及同型对照处理来自健康供体的新鲜分离的pbmc。研究了在btn2a1阻断和激活信号(259)的基线设置中细胞因子表达抑制信号的后果，包括来自表达btn2a1和/或3a1的其他免疫细胞亚群的信号，或vγ9vδ2细胞激活的次级效应。
[0782]
与来自分离的vγ9vδ2细胞培养物的早期数据一致，抗体259在完整pbmc的情况下增加ifnγ和se-选择素的表达，并且btn2a1和btn3a1抑制性抗体均阻断基线表达(图30)。存在于高度富集的vγ9vδ2细胞培养物中的其他信号在完整pbmc的情况下未检测到。最显著的是，在与抗体259接触时没有检测到tnfα水平的增加(表5)。这可能是由于pbmc内的vγ
9vδ2细胞的数量少，将信号稀释超过检测阈值。
[0783]
表5：如图30所示的pbmc中的细胞因子和趋化因子表达(以pg/ml计)
[0784][0785]
有趣的是，本发明人发现被259上调的另外的细胞因子/趋化因子，但它们在单培养物中未检测到。这些因子包括il-8(cxcl8)，另一种是用于免疫细胞主要是嗜中性粒细胞和t细胞的化学引诱物(henkels等人，2011)，其可以通过吸引t细胞在自身免疫性病症如银屑病中起重要作用(zheng等人，1998)。另外，本发明人发现在259处理后，作为原型的树突细胞的强化学引诱物ccl2(mcp-1)以及与炎性过程相关的典型的关键白介素il-6有所增加(erlandsson等人，2017；hashizume等人，2015)。所有这些细胞因子/趋化因子通过用229阻断btn2a1/3a1信号传导轴而下调，证实它们对通过该复合物进行信号传导的依赖。
[0786]
一些细胞因子和趋化因子被拮抗性抗体降低到同型对照水平以下，即使它们的表达没有被抗体259的处理而增强。这些因子包括icam-1、mip1α和mip1β以及se-选择素。
[0787]
vδ2-γδt细胞激活
[0788]
方法
[0789]
使用pmscv-ires-gfp质粒和fugene转染试剂，用全长人cd1c或cd1d重链或对照构建体(btnl3)转染小鼠3t3成纤维细胞。约2天后，当3t3细胞表达表面cd1c或cd1d时，将它们与表达对cd1c(vγ9vδ1
+
)或cd1d(vγ9vδ1
+
或vγ5vδ1
+
)具有特异性的人γδtcr的人t细胞系共培养24小时，之后通过流式细胞术使用cd69测定t细胞系上的激活水平。在固定的抗-cd3/抗-cd28上培养t细胞系作为阳性对照，或与未转染的3t3细胞一起培养作为阴性对照。
[0790]
讨论
[0791]
为了测试btn2a1增强vδ2-γδt细胞对其同源配体的反应性的能力，本发明人使用分别对cd1c和cd1d具有反应性的两种γδt细胞系(均为vγ9vδ1γδtcr
+
)进行了体外测定(图31)。本发明人还包括对照vγ5vδ1
+
γδt细胞系(克隆9c2；a.p.uldrich等人(2013))，其
也是cd1d反应性的，但不应结合btn2a1，因为其缺乏vγ9。本发明人用人cd1c或cd1d加上btn2a1或不相关的对照构建体(人btnl3)转染小鼠3t3 apc，并将它们与γδt细胞系共培养，并在24小时后测量激活(cd69)。数据显示btn2a1可以(a)甚至在不存在另外的tcr配体的情况下诱导这些vγ9
+
γδt细胞系的一些激活，以及(b)增强cd1c特异性和cd1d特异性γδtcr的激活。这似乎对vγ9
+
tcr具有特异性，因为虽然9c2(vγ5
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)对cd1d具有特异性反应，但btn2a1表达并未增强。
[0792]
这些发现表明，btn2a1除了对vγ9vδ2
+
γδt细胞激活是必需的之外，还可直接诱导vδ2-γδt细胞激活，并且还可增强这些细胞对其同源ag的应答。
[0793]
参考文献
[0794]
al-lazikani et al.,(1997)journal of molecular biology,273:927-948
[0795]
ausubel et al.,(1987)current protocols in molecular biology wiley,boston
[0796]
ausubel et al.,(1988,including all updates until present)current protocols in molecular biology,greene pub.associates and wiley-interscience
[0797]
bork et al.,(1994)journal of molecular biology,242:309-320
[0798]
brown,(1991)essential molecular biology:a practical approach,vol.1and 2,irl press
[0799]
chothia and lesk,(1987)journal of molecular biology,196:901-917
[0800]
chothia et al.,(1989)nature,342:877-883
[0801]
coligan et al.,(all updates until present)current protocols in immunology,john wiley&sons
[0802]
edelman et al.,(1969)pnas,63:78-85,
[0803]
erlandsson,et al.,(2017)biochim biophys acta mol basis dis.1863(9):2158-2170.
[0804]
glover and hames,(1995 and 1996)dna cloning:a practical approach,volumes 1-4,irl press
[0805]
harlow and lane,(1988)antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory
[0806]
hashizume,and ohsugi,(2015)endocr metab immune disord drug targets.
[0807]
henkels et al.,(2011)febs lett.585(1):159-66
[0808]
holliger et al.,(1993)pnas,90:6444-6448
[0809]
jones et al.,(2010)journal of immunological methods,354:85-90
[0810]
jostock et al.,(2004)journal of immunological methods,289:65-80
[0811]
kabat,(1987 and 1991)sequences of proteins of immunological interest,national institutes of health,bethesda,md
[0812]
keler et al.,(1997)cancer research,57:4008-4014
[0813]
kim et al.,(2015)plos one,10(3):e0121171
[0814]
kostelny et al.,(1992)the journal of immunology,148:1547-1553
[0815]
largaespada et al.,(1996)journal of immunological methods 197:85-95,
[0816]
merchant et al.,(1998)nature biotechnology,16:677-681
[0817]
milstein et al.,(1983)nature,305:537-540
[0818]
novotny et al.,(1991)pnas,88:8646-8650
[0819]
osol,(1980)remington's pharmaceutical science,16th edition,mack publishing company
[0820]
remington's pharmaceutical sciences(mack publishing co.n.j.usa,1991)
[0821]
palakodeti et al.,(2012)j.biological chemistry,287(39):32780-90
[0822]
perbal,(1984)a practical guide to molecular cloning,john wiley and sons
[0823]
ridgway et al.,(1996)protein engineering,9:617-621
[0824]
sambrook and russell,(2001)molecular cloning:a laboratory manual,3
rd edition,cold spring harborlaboratory press
[0825]
sambrook et al.,(1989)molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press
[0826]
schutters et al.,(2013)cell death and differentiation,20:49-56,
[0827]
scopes,(1994)protein purification:principles and practice,3
rd edition,springer verlag
[0828]
thapa et al.,(2008)journal of cellular and molecular medicine,12:1649-1660
[0829]
ungeth
ü
m et al.,(2011)the journal of biological chemistry,286:1903-1910
[0830]
zheng,et al.(1998)chin med j(engl).111(2):p.166-8
[0831]
j.rossjohn et al.,t cell antigen receptor recognition of antigen-presenting molecules.annu rev immunol 33,169-200(2015)
[0832]
p.constant et al.,stimulation of人gamma delta t cells by nonpeptidic mycobacterial ligands.science 264,267-270(1994).
[0833]
y.tanaka et al.,natural and synthetic non-peptide antigens recognized by人gamma delta t cells.nature 375,155-158(1995).
[0834]
l.zhao,w.c.chang,y.xiao,h.w.liu,p.liu,methylerythritol phosphate pathway of isoprenoid biosynthesis.annu rev biochem 82,497-530(2013).
[0835]
a.sandstrom et al.,the intracellular b30.2 domain of butyrophilin 3a1 binds phosphoantigens to mediate activation of人vgamma9vdelta2 t cells.immunity 40,490-500(2014).
[0836]
y.l.wu et al.,gammadelta t cells and their potential for immunotherapy.int j biol sci 10,119-135(2014).
[0837]
j.zheng,y.liu,y.l.lau,w.tu,gammadelta-t cells:an unpolished sword in人anti-infection immunity.cellular&molecular immunology 10,50-57(2013).
[0838]
l.wang,a.kamath,h.das,l.li,j.f.bukowski,antibacterial effect of人v gamma 2v delta 2t cells in vivo.the journal of clinical investigation 108,
fluorescence resonance energy transfer analyzed by flow cytometry:advantages and limitations.cytometry 48,97-105(2002).
[0853]
t.j.allison,c.c.winter,j.j.fournie,m.bonneville,d.n.garboczi,structure of a人gammadelta t-cell antigen receptor.nature 411,820-824(2001).
[0854]
a.p.uldrich et al.,cd1d-lipid antigen recognition by the gammadelta tcr.nature immunology 14,1137-1145(2013).
[0855]
p.vantourout et al.,heteromeric interactions regulate butyrophilin(btn)and btn-like molecules governing gammadelta t cell biology.proceedings of the national academy of sciences of the united states of america 115,1039-1044(2018).
[0856]
s.vavassori et al.,butyrophilin 3a1 binds phosphorylated antigens and stimulates人gammadelta t cells.nature immunology 14,908-916(2013).
[0857]
r.di marco barros et al.,epithelia use butyrophilin-like molecules to shape organ-specific gammadelta t cell compartments.cell 167,203-218e217(2016).
[0858]
d.melandri et al.,the gammadeltatcr combines innate immunity with adaptive immunity by utilizing spatially distinct regions for agonist selection and antigen responsiveness.nature immunology 19,1352-1365(2018).
[0859]
b.castella et al.,the atp-binding cassette transporter a1 regulates phosphoantigen release and vgamma9vdelta2 t cell activation by dendritic cells.nature communications 8,15663(2017).
[0860]
s.chen et al.,genome-wide crispr screen in a小鼠model of tumor growth and metastasis.cell 160,1246-1260(2015).
[0861]
m.martin,cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.2011 17,3％j embnet.journal(2011).
[0862]
m.d.robinson,d.j.mccarthy,g.k.smyth,edger:a bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.bioinformatics 26,139-140(2010).
[0863]
a.r.aricescu,w.lu,e.y.jones,a time-and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.acta crystallogr d biol crystallogr 62,1243-1250(2006