一种防治核桃黑斑病的复合菌剂和制备方法及其应用与流程

1.本发明属于微生物技术领域，具体是一种防治核桃黑斑病的复合菌剂，并涉及一种防治核桃黑斑病的复合菌剂的制备及其在防治核桃黑斑病中的应用。


背景技术：

2.核桃黑斑病是世界各地核桃主产区主要的病害之一，随着核桃产业的扩大发展，该病的发病率逐年增高，植株受害率达40-70％以上，受害部位包括雌花序、叶片、嫩梢和果实，可造成核桃的产量和品质的降低。细菌性核桃黑斑病可由多种病原菌造成，除普遍已知的树生黄单胞菌核桃致病变种xanthomonas arboricola pv.juglandis外，野油菜黄单胞菌xanthomonas campestris pv.campestris和成团泛菌 pantoea agglomerans均能引起核桃黑斑病的发生。
3.目前，对于核桃黑斑病的防治以化学农药为主，但化学农药对水体、土壤等环境污染严重，毒性残留并进入生物链，以及容易造成病原菌耐药。随着人们对于生态环境保护和可持续发展意识的加强，生物农药因具有安全无毒、环境友好、可持续作用等优点受到人们重视，以高效拮抗菌株为基础的生物防治展现出巨大应用潜力。
4.本发明所述解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)ab191于 2020年8月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为cgmcc no.20525；解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)，革兰氏阳性细菌，可产生芽孢，生长繁殖速度快，抗逆性强，易存活，与植物之间的亲和性很高，在自然界中广泛分布，且制剂的生产工艺相对简单，具有开发微生物农药和肥料菌种前景。
5.本发明所述绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)pck02 于2020年8月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为cgmcc no.20524。绿针假单胞菌(pseudomonaschlororaphis)，革兰氏阴性细菌，分布范围广，有较强的生态环境适应能力，是公认的环境友好型能促进植株生长的细菌，且其菌株产生的代谢产物可对植物形成保护作用，生防潜力与应用前景广阔。


技术实现要素：

6.针对野油菜黄单胞菌xanthomonas campestris pv.campestris或成团泛菌pantoea agglomerans引起核桃黑斑病专性微生物复合菌剂，本发明的目的是提供一种防治核桃黑斑病的复合菌剂和制备方法及其应用。
7.本发明所述的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)ab191 和绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)pck02对核桃黑斑病病菌(野油菜黄单胞菌xanthomonas campestris pv.campestris和成团泛菌pantoea agglomerans)均具有显著抑制作用。
8.本发明的目的可通过以下技术方案来实现：
9.本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)ab191 分离自陕西省渭南市核桃种植园核桃根际土壤，已于2020年8月12 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 cgmcc，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为cgmcc no.20525。解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ab191具有以下生物学特性：在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈乳白色，不透明，边缘平整，表面突起，易挑起；显微镜检，菌体细胞呈杆状，产芽孢，革兰氏染色阳性。绿针假单胞菌 (pseudomonas chlororaphis)pck02分离自陕西省宝鸡市太白山国家森林公园，已于2020年8月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为cgmcc no.20524。绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)pck02具有以下生物学特征：在 kmb培养基上菌落呈橙色，圆形，表面突起，光滑，易挑起，较粘稠；显微镜检，菌体细胞呈杆状，无芽孢，革兰氏染色阴性。
10.本发明也提供了上述解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ab191和绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis) pck02的复合菌剂的制备及其在核桃黑斑病防治中的应用。
11.本发明所述复合生防菌剂的制备方法包括以下步骤：
12.(1)活化菌株：将保存于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上的解淀粉芽孢杆菌ab191划线于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，绿针假单胞菌 pck02划线于kmb培养基上，28℃倒置培养1-2d；
13.(2)制备种子液：挑取步骤(1)培养基平板上的单菌落分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基和kmb液体培养基中，28℃摇床振荡 24h得到种子液；
14.(3)发酵培养：将液体发酵培养基a灭菌，步骤(2)所得解淀粉芽孢杆菌ab191的种子液按5％-8％体积比接入发酵培养基a，发酵罐设置恒温30
±
1℃，搅拌速度180-220rpm，发酵48-72h，通过血球计数板进行活菌计数，菌数达到2.0
×
10
11
个/ml以上时终止发酵；
15.将液体发酵培养基b灭菌，步骤(2)所得绿针假单胞菌pck02 的种子液按8％-10％体积比接入发酵培养基b，发酵罐设置恒温 32
±
1℃，搅拌速度220-250rpm，发酵48-60h，通过血球计数板进行活菌计数，菌数达到1.0
×
10
11
个/ml以上时终止发酵；
16.优选的，所述步骤(3)中发酵培养基a(g/l)：葡萄糖10-15，柠檬酸钠5-10，na2hpo
4 1.5-2.0，(nh4)2so
4 3.5-4.0，mgso
4 0.3-0.5，酵母浸粉0.05-0.1，cacl2·
2h2o 0.05-0.1，橙皮精油0.5-1.0，调节ph7.0-7.2。
17.优选的，所述步骤(3)中发酵培养基b(g/l)：甘油15-20，胰蛋白胨2.8-3.0，水解酪素1.5-2.0，k2hpo4·
3h2o 1.8-2.2，(nh4)2so
4 1.0-1.6， feso4·
7h2o 0.05-0.10，zncl
2 0.02-0.05，l-天冬氨酸0.01-0.02，调节ph 7.2-7.4。
18.(4)菌剂制备：将步骤(3)发酵所得两种菌液按质量比例1:1 混合得到混合菌液，按照混合菌液的质量比例0.1-0.8％加入羧甲基壳聚糖，之后再分别与硅藻土、高岭土以1:(4.0-4.5):(5.5-6.0)的质量比混合均匀，形成复合菌体-硅藻土-高岭土混合物；再将按质量比例 (％)0.01-0.05％的比例加入(nh4)2hpo4，质量比例(％)0.005％-0.01％的比例加入十二烷基磺酸钠，混合搅拌均匀，即为防治核桃黑斑病复合菌剂(菌数1.0
×
10
10
个/g)。
19.本发明所述所述的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ab191和绿针
假单胞菌(pseudomonas chlororaphis) pck02菌株或权利要求2所述的复合生防菌剂在防治病原菌野油菜黄单胞菌xanthomonas campestris pv.campestris和成团泛菌pantoeaagglomerans)引起的中核桃黑斑病的应用。
20.本发明所述的复合菌剂在防治核桃黑斑病方面的应用方法，其特征在于，在使用前，将制得的生防菌剂稀释至1
×
108个/g，在作物叶片喷施或灌根处理，防治作物病害的发生发展。
21.本发明具有的有益效果：
22.本发明为防治核桃黑斑病提供了一种新思路。本发明提供的防治核桃黑斑病复合菌剂对2种核桃黑斑病病菌(野油菜黄单胞菌 xanthomonas campestris pv.campestris和成团泛菌pantoeaagglomerans)均呈现较好的抑制作用，引起的能够有效的防治核桃黑斑病，是一种安全、环保、高效的制剂，具有巨大的应用价值。
附图说明
23.图1为解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)ab191的菌落形态；
24.图2为绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)pck02的菌落形态；
25.图3为本发明所制备的防治核桃黑斑病的复合菌剂田间试验的效果图。试验植物为一年生胡桃属作物，进行核桃黑斑病防治处理。处理组：喷施常规施肥+叶面喷施本发明所述的复合菌剂(图3a和图 3c)；对照组：喷施常规施肥+叶面喷施等量清水(图3b和图3d)。
具体实施方式
26.下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
27.实例1：解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)ab191和绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)pck02的分离与纯化
28.本发明的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)ab191是分离自陕西省渭南市核桃种植园核桃根际土壤，绿针假单胞菌 (pseudomonas chlororaphis)pck02采用稀释涂布法和平板划线法
29.1.菌株分离：取5g土壤样品加于45ml无菌生理盐水中，28℃150 rpm摇床振荡30min后，用无菌生理盐水梯度稀释成10-1-10-6
共6个梯度的土壤菌悬液。每个梯度各取100μl均匀涂布于培养基平板上， 28℃倒置培养2d后挑取不同形态的单菌落于培养基平板上划线纯化，定时观察菌落形态及生长情况，并进行编号保存。
30.2.拮抗菌株的筛选
31.采用平板对峙法，制备含核桃黑斑病菌的牛肉膏蛋白胨平板，用无菌打孔器在上述分离纯化的菌株边缘打取直径7mm的菌饼，倒置在含病原菌平板上，28℃倒置培养3d，定时观察菌株对病原菌的抑制作用，每株待测菌株重复3次。
32.筛选出抑菌效果明显的菌株，即为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)ab191和绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis) pck02。
33.3.菌株鉴定
34.(1)形态学特征：
35.解淀粉芽孢杆菌ab191在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈乳白色，不透明，边缘平
整，表面突起，易挑起(见图1)；显微镜检，菌体细胞呈杆状，产芽孢，革兰氏染色阳性。
36.绿针假单胞菌pck02在kmb培养基上菌落呈橙色，圆形，表面突起，光滑，易挑起(见图2)，较粘稠；显微镜检，菌体细胞呈杆状，无芽孢，革兰氏染色阴性。
37.(2)分子生物学特性：
38.解淀粉芽孢杆菌ab191的16s rrna基本序列：
39.tggccgtttgggggccgtgccctaatacatgcaagtcgagcgg acagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtga gtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgg gaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttc agacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccg cggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcga cgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggac tgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaat cttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgag tgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaa caagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaacc agaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacg taggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctc gcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaac cggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaaga ggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatg tggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaact gacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagat accctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttag ggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactc cgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattg acgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaa gcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaat cctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtgg tgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagt cccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagt tgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaagg tggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctac acacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcg aggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcag tctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcg gatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacac cgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtga ggtaaccttttaggagccagccgccgaaaaggggaaccaaag
40.绿针假单胞菌pck02的16s rrna基本序列：
41.gacattccgtggtaccgtcctcccaaaggttagactagctactt ctggtgcaacccactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaa ggcccgggaacgtattcaccgcgacattctgattcgcgattact agcgattccgacttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccg gactacgatcggttttatgggattagctccacctcgcggcttgg caaccctctgtaccgaccattgtagcacgtgtgtagcccaggcc gtaagggccatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccggt ttgtcaccggcagtctccttagagtgcccaccataacgtgctgg taactaaggacaagggttgcgctcgttacgggacttaacccaa catctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtct caatgttcccgaaggcaccaatccatctctggaaagttcattgg atgtcaaggcctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaac cacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttgag ttttaaccttgcggccgtactccccaggcggtcaacttaatgcg ttagctgcgccactaagagctcaaggctcccaacggctagttg acatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttg ctccccacgctttcgcacctcagtgtcagtatcagtccaggtgg tcgccttcgccactggtgttccttcctatatctacgcatttcacc gctacacaggaaattccaccaccctctaccatactctagctcgc cagttttggatgcagttcccaggttgagcccggggatttcacat ccaacttaacgaaccacctacgcgcgctttacgcccagtaattc cgattaacgcttgcaccctctgtattaccgcggctgctg
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42.(3)生理生化特性：
43.表1菌种理化特征鉴定表
[0044][0045][0046]
实施例2：解淀粉芽孢杆菌ab191和绿针假单胞菌pck02的发酵过程
[0047]
菌种活化培养基：
[0048]
牛肉膏蛋白胨培养基(g/l)：牛肉浸膏3.0，蛋白胨10.0，nacl5.0，定容至1000ml，调节ph 7.0-7.2，121℃灭菌20min，如需配置固体培养基，在培养基中加入琼脂粉15.0g。
[0049]
kmb培养基(g/l)：蛋白胨20.0，mgso4·
7h2o 2.5，k2hpo4·
3h2o1.5，甘油20.0，定容至1000ml，调节ph 7.0-7.5，121℃灭菌20min，如需配置固体培养基，在培养基中加入琼脂粉15.0g。
[0050]
发酵培养基a(g/l)：发酵培养基a(g/l)：葡萄糖15，柠檬酸钠5， na2hpo
4 1.5，(nh4)2so
4 4.0，mgso
4 0.5，酵母浸粉0.05，cacl2·
2h2o0.1，橙皮精油0.5，调节ph 7.2。
[0051]
发酵培养基b(g/l)：甘油20，胰蛋白胨3.0，水解酪素1.5， k2hpo4·
3h2o 2.2，(nh4)2so
4 1.6，feso4·
7h2o 0.10，zncl
2 0.02-0.05， l-天冬氨酸0.01，调节ph7.4。
[0052]
(1)活化菌株：将保存于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上的解淀粉芽孢杆菌ab191划线于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，保存于kmb 培养基斜面上的绿针假单胞菌pck02划线于kmb
培养基平板上28℃倒置培养1-2d；
[0053]
(2)制备种子液：挑取步骤(1)培养基平板上的单菌落分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基和kmb液体培养基中，28℃摇床振荡 24h得到种子液；
[0054]
(3)发酵培养：将液体发酵培养基a灭菌，步骤(2)所得解淀粉芽孢杆菌ab191的种子液按5％体积比接入发酵培养基a，发酵罐设置恒温30
±
1℃，搅拌速度200rpm，发酵72h，通过血球计数板进行活菌计数，菌数达到2.0
×
10
11
个/ml以上时终止发酵；
[0055]
将液体发酵培养基b灭菌，步骤(2)所得绿针假单胞菌pck02 的种子液按10％体积比接入发酵培养基b，发酵罐设置恒温32
±
1℃，搅拌速度250rpm，发酵48h，通过血球计数板进行活菌计数，菌数达到1.0
×
10
11
个/ml以上时终止发酵；
[0056]
(4)菌剂制备：将步骤(3)发酵所得两种菌液按质量比例1:1 混合得到混合菌液，按照混合菌液的质量比例0.8％加入羧甲基壳聚糖，之后再分别与硅藻土、高岭土以1:4.5):5.5的质量比混合均匀，形成复合菌体-硅藻土-高岭土混合物；再将按质量比例(％)0.05％的比例加入(nh4)2hpo4，质量比例(％)0.01％的比例加入十二烷基磺酸钠，混合搅拌均匀，即为防治核桃黑斑病复合菌剂(菌数1.0
×
10
10
个/g)。
[0057]
通过以上步骤可以制备活菌数为10
10
个/g的防治核桃黑斑病复合菌剂。
[0058]
实施例3：防治核桃黑斑病复合菌剂的防病田间试验
[0059]
实例2所得防治核桃黑斑病复合菌剂进行核桃黑斑病防治处理，试验设置4个药剂处理，如下：
[0060]
处理1：常规施肥+叶面喷施供试实例2所得防治核桃黑斑病复合菌剂1000倍；
[0061]
处理2：常规施肥+叶面喷施市售某公司琥胶硫酸铜850倍；
[0062]
处理3：常规施肥+叶面喷施市售某公司春雷霉素1000倍；
[0063]
处理4：常规施肥+叶面喷施等量清水(空白对照)。田间小区随机分布排列，每个处理组10株，各处理组设置3次重复。喷施药剂时，确保药剂均匀喷施在病叶及病果表面，施药量标准为叶片正反面均匀着药，稍有药液下滴。喷药结束后，悬挂标识牌并记录。每次喷药间隔15d，期间不进行其他农事处理。
[0064]
田间调查时间为施药后10d，调查叶片和果实黑斑病发生及防治情况(图3)。每个处理组随机抽样调查3株。调查时每株按东、南、西、北方向，选中层枝和下层枝，共计8个样点，每样点随机调查5 片树叶或5个果实。根据黑斑面积设定分级标准，统计病情指数，计算药剂防治效果，公式如下：
[0065][0066]
[0067][0068]
数据整理后通过单因素anova分析，事后检验通过duncan’s新复极差法进行数据分析比较差异。
[0069]
结果表明，防治核桃黑斑病复合菌剂对核桃黑斑病具有较好的防治效果(见表1)，防效可达60％以上。
[0070]
表1-1供试菌剂对核桃细菌性黑斑病(叶片)的田间防效
[0071][0072]
数值由平均值
±
标准误组成，不同字母标示具显著差异，事后检验通过duncan比较差异(p《0.05)
[0073]
表2-2供试菌剂对核桃细菌性黑斑病(果实)的田间防效
[0074][0075]
数值由平均值
±
标准误组成，不同字母标示具显著差异，事后检验通过duncan比较差异(p《0.05)
[0076]
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。