循环肿瘤细胞分选微流控芯片的制作方法

1.本发明涉及细胞分选技术领域，特别是涉及一种循环肿瘤细胞分选微流控芯片。


背景技术：

2.癌症在全球正常死因中排名第二，每6人中就有1人死于癌症。肿瘤转移是引起癌症90％的死亡原因。肿瘤转移过程就是肿瘤细胞从原发灶或转移灶上脱落，在淋巴系统或外周血中循环，从而入侵远端的组织，并形成新的肿瘤灶，最终导致患者死亡。这些脱落下来的肿瘤细胞就称为循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,ctc)。因而通过检查血液中循环肿瘤细胞的数量和种类，即可监测肿瘤病变的动态变化，评估治疗效果。对分离出来的循环肿瘤细胞进行免疫分型、基因组测序等分析，可以找到药物靶点，从而实现个性化精准治疗。循环肿瘤细胞对于肿瘤早期筛查也极为重要，肿瘤在1-2毫米时，影像学等手段很难检测出来。但是在很多中癌症的早期阶段，血液中就含有一定数量的循环肿瘤细胞。对于一些有高风险患者，定期的进行循环肿瘤细胞检测，有助于癌症的早发现，早治疗，避免病情恶化。因此，从血液中分选和富集循环肿瘤细胞显得尤为重要，但是循环肿瘤细胞含量极低，通常情况下每毫升的血液中含1-10个循环肿瘤细胞，每毫升白细胞的含量为数百万个，红细胞含量为数十亿个，要分选和富集循环肿瘤细胞的难度如同大海捞针。
3.为实现循环肿瘤细胞的分选，传统技术采用在微流控芯片上设置螺旋通道，但螺旋通道制造难度大且尺寸较大。一般的线性弧形流道利用不对称惯性聚焦及迪恩涡旋原理对循环肿瘤细胞进行聚集回收，但是循环肿瘤细胞回收率低。


技术实现要素：

4.基于此，有必要针对上述的问题，提供一种循环肿瘤细胞分选微流控芯片，能有效提高循环肿瘤细胞回收率。
5.一种循环肿瘤细胞分选微流控芯片，包括功能板，所述功能板的第一侧面上设有用于使循环肿瘤细胞聚集成带的分选流道，所述分选流道中开设有贯穿所述分选流道壁面的分流孔，且所述分选流道中对应所述分流孔入口处设有阻挡件，且所述阻挡件位于所述分流孔靠近循环肿瘤细胞聚集的一侧。
6.将血液样品稀释通入分选流道中，由于惯性升力、迪恩曳力等的受力影响，在分选流道作用力的平衡下，红细胞、白细胞、循环肿瘤细胞会在分选流道的横截面中产生相对移动，当移动到横截面的平衡位置，直径较大的白细胞、循环肿瘤细胞会稳定在横截面某一位置，形成聚焦流动，因白细胞、循环肿瘤细胞直径不同，会在分选流道横截面的不同位置聚集，通过分选流道中开设有贯穿分选流道壁面的分流孔，并在分选流道中对应所述分流孔入口处设有阻挡件，且阻挡件位于分流孔靠近循环肿瘤细胞聚集的一侧，阻挡件能挡住聚焦的循环肿瘤细胞避免其流入分流孔，循环肿瘤细胞沿阻挡件流向分选流道的下游，而白细胞、红细胞在分选流道中分布较为均匀，部分白细胞和红细胞则从分流孔流出分选流道。该循环肿瘤细胞分选微流控芯片，通过在分选流道中设置分流孔提前排出部分红细胞与白
细胞，而且利用分流孔排出时设置阻挡件阻挡循环肿瘤细胞，避免循环肿瘤细胞流入分流孔，使分流孔下游的液体中循环肿瘤细胞含量比例增大，进而能有效提高循环肿瘤细胞回收率。另外该循环肿瘤细胞分选微流控芯片只聚集循环肿瘤细胞，不聚集白细胞和红细胞，芯片的整体尺寸可以小型化，芯片中流道的高度和宽度可以较大，血液样本可以做大倍数的稀释，从而可以使得液体流速较大，减少分选时间。
7.在其中一实施例中，所述阻挡件沿所述分选流道的延伸方向的宽度大于所述分流孔的直径。
8.在其中一实施例中，所述阻挡件凸出所述分选流道的壁面设置，所述阻挡件靠近循环肿瘤细胞聚集的一侧为弧形壁，且所述弧形壁的弯曲方向与所述分选流道靠近循环肿瘤细胞聚集的一侧侧壁的弯曲方向一致。
9.在其中一实施例中，所述阻挡件与所述功能板为一体成型结构，所述阻挡件远离弧形壁的一侧中部绕所述分流孔对应侧的外周设置。
10.在其中一实施例中，沿所述分选流道的延伸方向依次设有多个所述分流孔，所述功能板的第二侧面上设有多个呈往复回折结构的缓冲流道，所述缓冲流道与所述分流孔一一对应连通。
11.在其中一实施例中，沿样品流动方向，位于上游的分流孔对应的缓冲流道的长度大于其他缓冲流道的长度。
12.在其中一实施例中，沿样品流动方向，多个所述分流孔逐渐向所述分选流道中循环肿瘤细胞聚集的一侧靠近设置。
13.在其中一实施例中，所述缓冲流道流出的液体的占比为30％-70％；或者所述缓冲流道流出的液体的占比为45％-60％。
14.在其中一实施例中，所述功能板的第一侧面上还设有与所述分选流道末端连接的转弯流道，所述转弯流道的曲率半径大于所述分选流道的曲率半径，所述转弯流道远离所述分选流道的一端设有相互独立的回收流道与废液流道，所述回收流道与所述转弯流道中靠近循环肿瘤细胞聚集的一侧连通，所述废液流道与所述转弯流道中远离循环肿瘤细胞聚集的一侧连通。
15.在其中一实施例中，所述废液流道与所述回收流道流出的液体的占比为45％-65％：3％-20％；或者所述废液流道与所述回收流道流出的液体的占比为50％-60％：5％-10％。
16.在其中一实施例中，所述分选流道为正弦型弧形流道，所述废液流道与所述回收流道均为迂回设置结构。
17.在其中一实施例中，所述的循环肿瘤细胞分选微流控芯片还包括上盖板与下盖板，所述上盖板上开设有与所述分选流道连通的样品入口，所述上盖板与所述功能板的第一侧面叠置连接，所述下盖板上开设有回收孔、废液孔及排出孔，所述下盖板与所述功能板的第二侧面叠置连接，所述回收流道与所述回收孔连通，所述废液流道与所述废液孔连通，所述缓冲流道与所述排出孔连通。
附图说明
18.图1为一实施例中循环肿瘤细胞分选微流控芯片的分选流道的示意图；
19.图2为一实施例中循环肿瘤细胞分选微流控芯片的上盖板的示意图；
20.图3为一实施例中循环肿瘤细胞分选微流控芯片的功能板的第一侧面的示意图；
21.图4为一实施例中循环肿瘤细胞分选微流控芯片的功能板的第二侧面的示意图；
22.图5为一实施例中循环肿瘤细胞分选微流控芯片的下盖板的示意图。
23.附图标记说明：
24.01、红细胞；02、白细胞；03、循环肿瘤细胞；1、功能板；10、入口流道；20、聚集流道；30、加深流道；40、换向流道，50、分选流道；51、分流孔；52、阻挡件；522、弧形壁；60、转弯流道；70、回收流道；71、第一流出孔；80、废液流道；81、第二流出孔；90、缓冲流道；2、上盖板；21、样品入口；3、下盖板；31、回收孔；32、废液孔；33、排出孔。
具体实施方式
25.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
26.请参阅图1-5，一实施例提供一种循环肿瘤细胞分选微流控芯片，包括功能板1。进一步地，循环肿瘤细胞分选微流控芯片还包括上盖板2与下盖板3。所述上盖板2与所述功能板1的第一侧面叠置连接，所述下盖板3与所述功能板1的第二侧面叠置连接，所述上盖板2上开设有样品入口21。
27.参照图1、2，在其中一实施例中，所述功能板1的第一侧面上设有用于使循环肿瘤细胞03聚集成带的分选流道50。所述分选流道50中开设有贯穿所述分选流道50壁面的分流孔51，且所述分选流道50中对应所述分流孔51入口处设有阻挡件52，且所述阻挡件52位于所述分流孔51靠近循环肿瘤细胞03聚集的一侧。图1中放大示出血液样品中循环肿瘤细胞、白细胞、红细胞在分选流道中的运动状态。
28.将血液样品稀释通过样品入口21通入分选流道50中，由于惯性升力、迪恩曳力等的受力影响，在分选流道50作用力的平衡下，红细胞01、白细胞02、循环肿瘤细胞03会在分选流道50的横截面中产生相对移动，当移动到横截面的平衡位置，直径较大的白细胞02、循环肿瘤细胞03会稳定在横截面某一位置，形成聚焦流动，因白细胞02、循环肿瘤细胞03直径不同，会在分选流道50横截面的不同位置聚集，通过分选流道50中开设有贯穿分选流道50壁面的分流孔51，并在分选流道50中对应所述分流孔51入口处设有阻挡件52，且阻挡件52位于分流孔51靠近循环肿瘤细胞03聚集的一侧，阻挡件52能挡住聚焦的循环肿瘤细胞03避免其流入分流孔51，循环肿瘤细胞03沿阻挡件52流向分选流道50的下游，而白细胞02、红细胞01在分选流道50中分布较为均匀，部分白细胞02和红细胞01则从分流孔51流出分选流道50。该循环肿瘤细胞03分选微流控芯片，通过在分选流道50中设置分流孔51提前排出部分红细胞01与白细胞02，而且利用分流孔51排出时设置阻挡件52阻挡循环肿瘤细胞03，避免循环肿瘤细胞03流入分流孔51，使分流孔51下游的液体中循环肿瘤细胞03含量比例增大，进而能有效提高循环肿瘤细胞03回收率。另外该循环肿瘤细胞分选微流控芯片只聚集循环肿瘤细胞03，不聚集白细胞02和红细胞01，芯片的整体尺寸可以小型化，芯片中流道的高度和宽度可以较大，血液样本可以做大倍数的稀释，从而可以使得液体流速较大，减少分选时
间。
29.参照图1、2，在其中一实施例中，所述阻挡件52沿所述分选流道50的延伸方向的宽度大于所述分流孔51的直径。使阻挡件52在沿样品流动的方向上对聚集的循环肿瘤细胞03进行较长距离的阻挡，循环肿瘤细胞03沿阻挡件52远离分流孔51的一侧流向下游。
30.参照图1、2，在其中一实施例中，所述阻挡件52凸出所述分选流道50的壁面设置，即阻挡件52所在位置的高度高于分选流道50其他位置，阻挡在循环肿瘤细胞03与分流孔51之间，避免循环肿瘤细胞03从分流孔51流出。所述阻挡件52靠近循环肿瘤细胞03聚集的一侧为弧形壁522，且所述弧形壁522的弯曲方向与所述分选流道50靠近循环肿瘤细胞03聚集的一侧侧壁的弯曲方向一致。阻挡件52靠近循环肿瘤细胞03聚集的一侧为弧形壁522，与循环肿瘤细胞03聚集带匹配，使阻挡件52对循环肿瘤细胞03聚体的影响保持一致，避免扰乱循环肿瘤细胞03聚体，循环肿瘤细胞03沿阻挡件52的弧形壁522流向下游。
31.在其中一实施例中，所述阻挡件52与所述功能板1为一体成型结构，阻挡件52为去除流道50开设过程中预留的凸出部分形成。所述阻挡件52远离弧形壁522的一侧中部绕所述分流孔51对应侧的外周设置。流向分流孔51的白细胞02与红细胞01被阻挡件52远离弧形壁522的侧壁挡住，最终流入分流孔51。
32.参照图1、2、3，在其中一实施例中，沿所述分选流道50的延伸方向依次设有多个所述分流孔51，所述功能板1的第二侧面上设有多个呈往复回折结构的缓冲流道90，所述缓冲流道90与所述分流孔51一一对应连通。沿液体流动方向设置多个分流孔51对白细胞02和红细胞01进行多次去除，有利于后续循环肿瘤细胞03的回收。将缓冲流道90设计为往复回折结构，使流出分选流道50的液体状态稳定，避免分选流道50中剩余液体流动受到抖动干扰，影响后续循环肿瘤细胞03的回收。在所述分选流道50中各对应的分流孔51入口处设有阻挡件52，且所述阻挡件52位于所述分流孔51靠近循环肿瘤细胞03聚集的一侧，所述阻挡件52沿所述分选流道50的延伸方向的宽度大于所述分流孔51的直径，通过阻挡件52保护循环肿瘤细胞03不被流入分流孔51，白细胞02和红细胞01则从分流孔51流出，垂直流入功能板1的第二侧面，流入缓冲流道90。
33.在其中一实施例中，沿样品流动方向，位于上游的分流孔51对应的缓冲流道90的长度大于其他缓冲流道90的长度。参照图3可以看出，位于上游的分流孔51对应的缓冲流道90的长度较其他的设计得更长，由于位于上游的分流孔51流入的液体量相对其他的分流孔51会更多，将缓冲流道90设计得更长，缓冲流道90能流出更多的液体，使流出的液体趋于平稳，避免对后续液体的流速造成影响，扰乱循环肿瘤细胞03的流动。
34.参照图1，在其中一实施例中，沿样品流动方向，多个所述分流孔51逐渐向所述分选流道50中循环肿瘤细胞03聚集的一侧靠近设置。参照图5，沿样品流动方向，多个所述分流孔51与对应的分选流道50中循环肿瘤细胞03聚集的一侧侧壁的距离l逐渐减小。随着液体的排出，白细胞02和红细胞01则会逐渐向循环肿瘤细胞03聚集的一侧流动，对应沿样品流动方向，将所述分流孔51逐渐向循环肿瘤细胞03聚集的一侧的方向设置，便于白细胞02和红细胞01从后续分流孔51流出。
35.在其中一实施例中，所述缓冲流道90流出的液体的占比为30％-70％。优选地，所述缓冲流道90流出的液体的占比为45％-60％。缓冲流道90的长短可以控制排出液体的多少。缓冲流道90的长度及结合分流孔51的位置来调节排除白细胞02和红细胞01的量及调控
循环肿瘤细胞03的运动轨迹。一实施例中，分流孔51去除的白细胞02和红细胞01占比为30％-70％，优选45％-60％。同理分流孔51所流出的液体占比为30％-70％，最优范围为45％-60％。如此设置，使液体流出量小于70％，最后流速相对减小不超过70％以上，避免影响到循环肿瘤细胞03原来的运动轨迹，造成部分循环肿瘤细胞03难以被回收。
36.参照图2，在其中一实施例中，所述功能板1的第一侧面上还设有与所述分选流道50末端连接的转弯流道60，所述转弯流道60的曲率半径大于所述分选流道50的曲率半径。所述转弯流道60远离所述分选流道50的一端设有相互独立的回收流道70与废液流道80，所述回收流道70与所述转弯流道60中靠近循环肿瘤细胞03聚集的一侧连通，所述废液流道80与所述转弯流道60中远离循环肿瘤细胞03聚集的一侧连通。血液流过分流孔51后，白细胞02和红细胞01含量逐渐减少，同时流速也逐渐减小。通过衔接曲率半径大于所述分选流道50的曲率半径的转弯流道60，能起到稳定循环肿瘤细胞03的运动轨迹的作用，便于后续对循环肿瘤细胞03的回收。循环肿瘤细胞03紧贴转弯流道60内壁流入回收流道70，白细胞02和红细胞01流入废液流道80。在其中一实施例中，所述废液流道80与所述回收流道70呈往复回折结构，起到稳定液体流动状态，防止液体后续流出跌落的过程中，影响了转弯流道60末端循环肿瘤细胞03的运动轨迹。
37.在其中一实施例中，所述废液流道80与所述回收流道70流出的液体的占比为45％-65％：3％-20％；或者所述废液流道80与所述回收流道70流出的液体的占比为50％-60％：5％-10％。通过调节废液流道80、回收流道70的长度和深度，可以调节两者的体积占比，从而调节去除白细胞02和红细胞01占比。在其中一实施例中，废液流道80流出的液体占比为45％-65％，优先50％-60％。回收流道70流出的液体占比为3％-20％，优先为5％-10％。从回收孔31收集到的液体，循环肿瘤细胞03回收率可达到90％以上，白细胞02和红细胞01去除率在90％以上。将回收的液体再返回芯片循环过滤多次，能进一步提高白细胞02和红细胞01去除率，提高循环肿瘤细胞03的回收纯度。
38.回收循环肿瘤细胞03的回收流道70的体积占比很少，废液流道80的体积占比很大，因此就可以在回收肿瘤细胞的时候，间接去除了白细胞02和红细胞01。由于此芯片的循环肿瘤细胞03回收率高，所以可以多次过滤。从而整体上循环肿瘤细胞03的减少量较少，白细胞02在多次过滤后，几乎全部去除。
39.在其中一实施例中，所述分选流道50为正弦型弧形流道。流体在弧形流道中流动时，呈抛物线流动的流体在通道中间速度最大。在经过通道转弯处时，微通道中间的流体因其流速最大而受到的离心力最大，从而流向弧形流道的外侧壁。靠近通道壁的流体流速最小，所受离心力也最小，从而受到中间高流速流体的挤压。为了保持流体中各处质量守恒，在垂直于流体流动的方向上，形成一对反向旋转且对称的涡流，分别位于通道横截面的上部和下部，由此产生迪恩涡流的二次流。迪恩涡流会对流体中的颗粒产生曳力作用，被称为迪恩曳力。在弧形流道中，流动的粒子会同时受到惯性升力和迪恩曳力的作用，这两种力的相对大小决定粒子在弯弧形流道中流动的聚焦流动情况。本实施例中，分选流道50中由于惯性升力和迪恩曳力的作用，循环肿瘤细胞03在不对称的分选流道50的内壁聚焦成一带。
40.参照图2-5，在其中一实施例中，所述上盖板2与所述功能板1的第一侧面粘接，所述下盖板3与所述功能板1的第二侧面粘接，使功能板1的第一侧面与第二侧面的各流道形成密封的通道。所述上盖板2上开设与功能板1的第一侧面的分选流道50连通的样品入口
21，便于血液样品从样品入口21导入微流控芯片内。下盖板3上开设有回收孔31、废液孔32及排出孔33，所述分流孔51与所述排出孔33连通，部分白细胞02和红细胞01在分选流道50由分流孔51流向功能板1的第二侧面，并从下盖板3的排出孔33流出微流控芯片，所述回收流道70通过贯穿功能板1第一侧面与第二侧面的第一流出孔71与所述回收孔31连通，分选出的循环肿瘤细胞03由下盖板3的回收孔31流出微流控芯片，所述废液流道80通过贯穿功能板1第一侧面与第二侧面的第二流出孔81与所述废液孔32连通，剩余的其他液体由下盖板3的废液孔32流出微流控芯片。
41.参照图2，在一实施例中，所述功能板1上还设有依次连接的入口流道10、聚集流道20及换向流道40，所述换向流道40的末端与所述分选流道50连接。血液样品由样品入口21流入入口流道10，再依次流经聚集流道20与换向流道40，再进入分选流道50。其中，入口流道10呈往复回折结构，起到缓冲进入循环肿瘤细胞03分选微流控芯片内样品的作用。聚集流道20为非对称的弧形流道，起到对循环肿瘤细胞03聚集的作用。在分选流道50与聚集流道20之间连接了一个换向流道40，由于换向流道40的半径大，惯性升力的相对优势更加大。经过换向流道40处时,流道中间流体受到的离心力最大,从而流向通道外侧边缘。靠近通道壁的流体流速最小,所受离心力也最小,从而受到中间流体的挤压。从而在换向流道40的作用下，循环肿瘤细胞03能大限度地贴近流道内壁底部，为后续通过分选流道50分选循环肿瘤细胞03和排除白细胞02做准备。
42.进一步地，聚集流道20、换向流道40、分选流道50及转弯流道60中远离循环肿瘤细胞03聚集的一侧设有加深流道30。加深流道30沿样品流动方向设置，打乱了加深流道30所在侧附近的液体流动状态，使得惯性升力与迪恩曳力改变，破坏原有的平衡，从而使得白细胞02能产生无序的运动状态，进而使得白细胞02在精筛流道20中分布更加均匀，避免白细胞02聚体的带和循环肿瘤细胞03重叠，同理红细胞01也分布得更加均匀，既保证了不干扰循环肿瘤细胞03的聚体，也防止了白细胞02聚集于精筛流道20内壁底部，便于后续把循环肿瘤细胞03与白细胞02分离开，利于循环肿瘤细胞03的回收。
43.上述实施例中的循环肿瘤细胞分选微流控芯片材质不受限定，可以用pmma、pc、abs、玻璃等材质。本芯片可以重复使用，不需要抗原抗体，也不需要磁珠，从而大大的降低了成本。
44.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
45.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
46.在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内
部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
47.在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
48.需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“上”、“下”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。
49.以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
50.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。