1.一种pkek融合蛋白,其特征在于:包括将若干美白多肽pkek与柔性连接肽依次串联构成的蛋白,其结构式如下:(pkek-b)n;b为柔性连接肽;n为1~30的整数。
2.根据权利要求1所述的pkek融合蛋白,其特征在于:所述的pkek融合蛋白的结构式如下:a–dd-(pkek-b)n;其中:a为伴侣蛋白;d为蛋白酶酶切位点;b为柔性连接肽;n为1~30的整数;d为0~10的整数。
3.根据权利要求2所述的pkek融合蛋白,其特征在于:
所述的柔性连接肽为如xm---x2-x1所示的肽序列,x1为蛋白酶酶切位点,x2至xm为柔性片段,m为0~10的整数;
所述的伴侣蛋白为ksi、pagp、pap3.30、taf12、gdf15、gygb、mksi、mpagp、mpap3.30、mgdf15、mgygb和mtaf12中的一种或两种以上形成的组合,m表示突变体。
4.根据权利要求3所述的pkek融合蛋白,其特征在于:
所述的蛋白酶酶切位点为arg或lys;
所述的m为0时,所述的d不能为0或是所述的n不能为1;
所述的柔性片段中的氨基酸不能为pro、thr或trp。
5.根据权利要求4所述的pkek融合蛋白,其特征在于:
所述的n为10~30;
所述的m为2~9的整数;
所述的柔性片段中的氨基酸为gly、ala或ser;
所述的d为1~5。
6.根据权利要求1~5任一项所述的pkek融合蛋白,其特征在于:
所述的柔性连接肽为ak、gk、aak、aagk、aaggk、ggaak、ggsask或aaggsgagk。
7.根据权利要求6所述的pkek融合蛋白,其特征在于:
所述的伴侣蛋白为taf12或是taf12与其他伴侣蛋白融合形成的伴侣蛋白时,所述的柔性连接肽为ak、gk、aak、aagk、aaggk或ggaak;
所述的伴侣蛋白为ksi或是ksi与其他伴侣蛋白融合形成的伴侣蛋白时,所述的柔性连接肽为ak、gk、aak、aagk、aaggk或ggaak;
所述的伴侣蛋白为pagp或是pagp与其他伴侣蛋白融合形成的伴侣蛋白时,所述的柔性连接肽为ak、gk、aak、aagk、aaggk、ggaak或ggsask。
8.一种编码权利要求1~7任一项所述的pkek融合蛋白的基因。
9.一种重组载体,其特征在于:含有权利要求8所述的基因;是将权利要求要求8所述的基因克隆入表达载体得到。
10.一种重组表达菌株,其特征在于:含有权利要求9所述的重组载体。
11.权利要求1~5任一项所述的pkek融合蛋白在制备美白多肽peke中的应用。
12.一种利用基因工程技术生产美白多肽peke的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
s1、获得包含编码pkek融合蛋白的基因的重组载体,其编码的融合蛋白的结构如a-dd-(pkek-b)n所示;其中:a为伴侣蛋白;b为柔性连接肽,柔性连接肽为如xm---x2-x1所示的肽序列,x1为蛋白酶酶切位点,x2至xm为柔性片段,m为0~10的整数;d为蛋白酶酶切位点;n为1~30的整数;d为0~10的整数;
s2、将步骤s1获得的重组载体转入基因工程菌株中,得到重组表达菌株;发酵培养重组表达菌株,收集融合蛋白的包涵体;
s3、溶解、酶切融合蛋白的包涵体,分离纯化即得活性美白多肽pkek。
13.根据权利要求12所述的利用基因工程技术生产美白多肽peke的制备方法,其特征在于:
步骤s2中所述的基因工程菌株为大肠杆菌;
所述的发酵中使用的发酵培养基的组成如下:酵母粉2.5~3.5g/l、蛋白胨4~6g/l、nacl0.5~1.5g/l、kh2po42.5~3.5g/l、na2hpo43~3.5g/l、mgso40.5~1.5g/l、(nh4)2so45~7g/l、cacl2·2h2o0.01~0.015g/l、甘油4~4.2g/l、微量元素0.8~1ml/l,溶剂为水;灭菌后用氨水调ph至6.8~7.2;
所述的微量元素混合液的组成如下:每100ml中,fecl2·4h2o2~2.5g、zncl20.1~0.15g、cocl2·6h2o0.15~0.25g、na2mo4·2h2o0.15~0.25g、cacl2·2h2o0.05~0.15g、cucl2·2h2o0.1~0.15g、h3bo40.03~0.06g、mnso4·h2o0.2~0.23g、37wt%浓盐酸9.5~10.5ml,溶剂为水;
所述的发酵的具体步骤如下:在36~38℃,ph控制为6.8~7.2,溶解氧5~50%的最大氧饱和度之间发酵;当培养至碳源耗尽时开始补料,当培养至菌体浓度od600为75~85时,添加iptg诱导;
步骤s2中所述的包涵体的获得步骤如下:将发酵液进行固液分离,获得菌体;将菌体重悬于破碎液中,水浴下匀浆破碎菌体,离心收集沉淀,将沉淀溶于洗涤缓冲液进行洗涤,离心收集包涵体沉淀;
步骤s3中所述的酶切中使用的蛋白酶为牛胰蛋白酶、猪胰蛋白酶和赖氨酰特异性内切酶中的一种或至少两种;
步骤s3中所述的溶解、酶切融合蛋白的包涵体的具体做法为:先将收集的融合蛋白的包涵体用尿素溶液溶解,稀释后用蛋白酶进行酶切。
14.权利要求12或13所述的利用基因工程技术生产美白多肽pkek的制备方法在工业化制备美白多肽peke中的应用。