一种用于封闭人类基因组上重复序列的封闭引物、其组合物及应用的制作方法

1.本发明涉及一种用于封闭人类基因组上重复序列的封闭引物、其组合物及应用，属于分子生物学领域。本发明涉及的封闭人基因组上重复序列的封闭引物组合物可替代人类cot-1序列，用于封闭人类基因组上重复序列及目标区域的杂交捕获，提高捕获效率。


背景技术：

2.基于液相杂交的目标区域捕获，是一种使用针对基因组中感兴趣的部分区域定制特异性探针，与基因组dna文库杂交结合，将基因组dna文库中目标区域片段进行捕获及富集，然后进行高通量测序的技术。它能够有效的降低测序成本及分析成本，同时提高了测序的灵敏度和精确性。随着精准医疗概念的提出与发展，目标区域捕获技术拥有着包括肿瘤预警、用药指导、筛查等极大的应用场景，同时其特征也更适合于临床检测中高精准度、高灵敏度、低检测成本的要求。
3.但是，当进行基于液相杂交的目标区域捕获等实验时，存在于起始基因组文库中的大量重复序列将会产生广泛的非特异性杂交反应，从而导致在后续进行特异性片段捕获时，会将通过重复序列互相杂交的非特异性序列也同时捕获下来，降低了目标区域捕获的效率。因此，在进行以上实验操作时，应当对基因组文库中的大量重复序列进行封阻，避免产生非特异性的杂交捕获，从而提高捕获效率，降低检测成本。cot-1 dna通常作为一种针对于dna序列的竞争性封阻序列，在目标区域捕获的杂交反应中封阻可能会引起非特异性杂交的重复序列。
4.人类cot-1序列(human cot-1 dna)，是一种针对于人类基因组的cot-1 dna序列，主要大小为50-300bp，富含重复dna序列，用于封闭人类基因组上重复序列。目前human cot-1 dna的制备方法主要是采用羟基磷石灰柱层析法(hap柱分离法)。该方法是将获得的基因组dna用超声波打断到需要大小，根据hap的吸附能力和分离柱所装的hap的量计算出所需要用的打断的dna的量，100℃变性10min，冰浴骤冷，根据dna样品浓度，计算cot＝1的dna(分子生物学中，将c0t＝1的一类dna定义为c0t-1dna，通常写作cot-1 dna。c0t是dna复性动力学中的一个单位，其所表示的是在单位浓度(c0,mol/l)下dna单链复性所需的时间(t,sec))，复性结束后，立即冰浴，加入等体积的水溶液，将样品加入到hap分离柱上，经过调整磷酸盐的浓度，依次洗脱游离核苷酸等杂质，单链核苷酸，最终洗脱双链dna，该dna即为cot-1dna，收集洗脱峰，乙醇沉淀、离心、sephadex g-50脱盐，收集dna峰，加入醋酸钠和酒精沉淀，收集得到cot-1dna(革文新等，人cot-1dna的制备[j]《肿瘤》，1998年5月，第18卷第3期(127))。上述的human cot-1 dna的制备方法虽然得到的human cot-1 dna其效果可用于目标区域捕获，但制作方法较为繁琐，成本较高，而且需要提取大量的人类基因组dna作为原材料。


技术实现要素：

[0005]
为了节约成本及简化human cot-1 dna的制备，本发明提供了一种用于封闭人类基因组上重复序列的封闭引物、其组合物、包含该组合物的试剂盒及其在封闭人类基因组上重复序列和杂交捕获中的应用，提供了一种人类cot-1 dna的替代品。
[0006]
本发明提供一种用于封闭人类基因组上重复序列的封闭引物，包括引物序列为seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12和seq id no:13所示核苷酸序列中的至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种或至少十二种。
[0007]
作为本发明的优选方案，所述封闭引物包括引物序列为seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12和seq id no:13所示核苷酸序列。
[0008]
其中，seq id no:1为5
’‑
ggccgggcgcggtggctcacgcctgtaatcccagcactttgggaggccgaggcgggcggatcacgaggtcaggagatcgagaccatcctggccaacacggtgaaaccccgtctctacta-3’；
[0009]
seq id no:2为5
’‑
gaggtcaggagatcgagaccatcctggccaacacggtgaaaccccgtctctactaaaaatacaaaaattagccgggcgtggtggcgggcgcctgtagtcccagctactcgggaggctgag-3’；
[0010]
seq id no:3为5
’‑
tcgagaccatcctggccaacacggtgaaaccccgtctctactaaaaatacaaaaattagccgggcgtggtggcgggcgcctgtagtcccagctactcgggaggctgaggcaggagaatgg-3’；
[0011]
seq id no:4为5
’‑
ggtgaaaccccgtctctactaaaaatacaaaaattagccgggcgtggtggcgggcgcctgtagtcccagctactcgggaggctgaggcaggagaatggcgtgaacccgggaggcggagct-3’；
[0012]
seq id no:5为5
’‑
ttagccgggcgtggtggcgggcgcctgtagtcccagctactcgggaggctgaggcaggagaatggcgtgaacccgggaggcggagcttgcagtgagccgagatcgcgccactgcactcca-3’；
[0013]
seq id no:6为5
’‑
gcgtgaacccgggaggcggagcttgcagtgagccgagatcgcgccactgcactccagcctgggcgacagagcgagactccgtctcaaaaaaaaaa-3’；
[0014]
seq id no:7为5
’‑
gctcagttggttagagcatagtgctaatgaggccaaggtcatgggttcaatccccatatgggccagttagcttcacacagagaaaahattgtgttccatggccatagactgcacccctaa-3’；
[0015]
seq id no:8为5
’‑
ccagttagcttcacacagagaaaahattgtgttccatggccatagactgcacccctaaccctagccagctgtctcamaaatgtatgccactggtcacaaggggaactrggaaaaaaaaaa-3’；
[0016]
seq id no:9为5
’‑
gcwgkgtggcgcagtggatagagcacgggacctggagtcaggaagacctgggttcgaatcccggctctgccacttactagctgtgtgaccttgggcaagtcacttaacctctctgtgcct-3’；
[0017]
seq id no:10为5
’‑
ccggctctgccacttactagctgtgtgaccttgggcaagtcacttaacctctctgtgcctcagtttcctcatctgtaaaatggggataataatagcacctacctcacagggttgttgtga-3’；
[0018]
seq id no:11为5
’‑
cagtttcctcatctgtaaaatggggataataatagcacctacctcacagggttgttgtgaggattaaatgagataatatatgtaaagcgcttagaacagtgcctggcacatagtaagcgc-3’；
[0019]
seq id no:12为5
’‑
grgaagcagygtggtacagtggaaagagcactggatttggagtcaggaggacctgggttcaaatcccggctctgacacttactagctgtgtgaccttgggcaagtcacttaacctctctg-3’；
[0020]
seq id no:13为5
’‑
aaatcccggctctgacacttactagctgtgtgaccttgggcaagtcacttaacctctctgggcctcagtttcctcatctgtaaaatgagggggttggactagatggcctctaaggtccct-3’。
[0021]
本发明提供的用于封闭人类基因组上重复序列的封闭引物的制备方法如下：选取
人参考基因组中的多个重复序列家族的多条序列，采用mafft及clusterw软件，对不同家族分别进行多序列比对分析，分别得到不同家族高度保守的同源性序列，从序列的5’端开始，以80-120nt为长度进行序列的选取，并保证各序列之间有至少60nt的重叠区域，得到封闭引物。
[0022]
其中，所述的人参考基因组中的多个重复序列选取于随机重复序列(tandem repeats)和散在重复序列(interspersed repeats)，优选为散在重复序列中的sines和/或lines家族；进一步优选为sines家族中的alu、mare3、ther-1及ther-2家族，数据来源自sinebase、基因信息研究所(genomic information research institute)的repbase及系统生物学研究所(institute for systems biology)的dfam database三个数据库。
[0023]
本发明另一方面涉及一种组合物，所述组合物包括上述封闭引物。
[0024]
作为本发明的优选方案，所述组合物包括seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12和seq id no:13所示核苷酸序列。
[0025]
作为本发明的优选方案，所述组合物是将各封闭引物以一定比例混合得到的，所述一定比例是指直接按相同浓度以相同体积混匀，或者根据各引物序列在人类基因组上的出现次数进行归一化后，按对应的比例混合。
[0026]
本发明再一方面涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含上述组合物。
[0027]
本发明再一方面提供上述封闭引物、组合物或试剂盒在封闭人类基因组上重复序列中的应用。
[0028]
本发明最后提供上述封闭引物、组合物或试剂盒在基于液相杂交的目标区域捕获杂交捕获中的应用。
[0029]
术语：
[0030]
序列一致性：也称为“序列同一性”，指两序列(例如查询序列和参照序列)之间一致性程度的量，一般以百分比表示。通常，在计算两序列之间的一致性百分比之前，先进行序列比对(alignment)并引入缺口(gap)(如果有的话)。如果在某个比对位置，两序列中的碱基或氨基酸相同，则认为两序列在该位置一致或匹配；两序列中的碱基或氨基酸不同，则认为在该位置不一致或错配。在一些算法中，用匹配位置数除以比对窗口中的位置总数以获得序列一致性。在另一些算法中，还将缺口数量和/或缺口长度考虑在内。出于本发明的目的，可以采用公开的比对软件blast(可在网页ncbi.nlm.nih.gov找到)，通过使用缺省设置来获得最佳序列比对并计算出两序列之间的序列一致性。
[0031]
重复序列：指拷贝数在10个以上的序列。
[0032]
散在重复序列：是散在方式分布于基因组内的重复序列。根据重复序列的长度可以分为短散在重复序列(short interspersed nuclear elements,sines)，在人基因组中的重复拷贝数达10万以上。长散在重复序列(long interspersed nuclear elements,lines)，重复序列单元长度在1000bp以上，在人基因组中有上万份拷贝。人类基因组中所有sine之间的平均距离约为2.2kb。
[0033]
归一化：指统计学中的常用的标准归一化和最大最小归一化。
[0034]
杂交：指相互间具有互补序列的两个单链核酸分子在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)按碱基互补配对原则退火形成双链核酸的过程。核酸杂交可以在dna-dna之
间，也可在dna-rna或rna-rna之间进行，只要它们之间存在互补序列，可以进行碱基配对。一般而言，杂交的双方是待测核酸分子和已知核酸分子。
[0035]
探针：在杂交体系中已知的核酸分子。探针通常是经标记的，从而在杂交反应结束后，通过利用探针上的标记物，可以分离和检测杂交后的双链。
[0036]
液相杂交：是在溶液中进行的杂交反应，是指待测核酸分子与探针在溶液中退火形成杂交复合物。
[0037]
文库：指用于研究、分离、扩增的特定的目标核酸(脱氧核糖核酸或核糖核酸)序列，包括单链序列、双链序列或其互补的序列，也包括通过将一类核酸分子(例如dna、rna和cdna)转化为另一类体外合成的产物以及含有核苷酸类似物的合成分子。
[0038]
捕获效率：测序读长(reads)中包含目标区域的碱基个数/所有测序读长中所有的碱基个数。
[0039]
覆盖均一性：表示各位点的实际测序深度偏离平均深度的程度。所述“深度”是指被测序基因组上单个碱基被测序的平均次数，如某样本的基因组上每一个单碱基平均被测序(read)了30次，即该样本的测序深度为30x；fold_80表示平均深度/(80％以上区域被覆盖的深度)。
[0040]
覆盖度(coverage)：表示测序数据对目标区域的覆盖情况，覆盖度越高越好。
[0041]
有益效果
[0042]
本发明制备的封闭引物在封闭人基因组上重复序列或杂交捕获中的应用的策略有效，化学合成的封闭引物序列明确，具有高效、高通量、成本低、批次稳定性优异的特点。本发明制备的封闭引物长度为80-120nt，既能保证引物的质量也能减少碱基错配，提高封闭的特异性。相对于目前较为昂贵的商品化human cot-1 dna，本发明制备的封闭引物成本较低，效果与thermo fisher human cot-1 dna一致，从而为杂交捕获实验提供了一种良好的可替代的选择。
附图说明
[0043]
图1：alu家族进行多序列比对的结果。
具体实施方式
[0044]
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0045]
实施例1：封闭引物的制备
[0046]
1、封闭引物的设计
[0047]
选取人参考基因组中的多个重复序列家族包括alu、mare3、ther-1及ther-2家族的多条序列，采用mafft及clusterw软件对不同家族分别进行多序列比对分析(alu家族的clusterw比对结果见图1)，分别得到四个家族高度保守的同源性序列：seq-alu(seq id no:14)、seq-mare3(seq id no:15)、seq-ther-1(seq id no:16)及seq-ther-2(seq id no:17)(表1)。根据这四条同源性序列，从序列的5’端开始，以120nt为长度进行序列的选取，并保证各序列之间有至少60nt的重叠区域。本发明设计的封闭引物见表2。
[0048]
表1：同源性序列
[0049][0050]
其中，简并碱基代码：h＝a/c/t；m＝a/c；r＝a/g；w＝a/t；k＝g/t；y＝c/t。
[0051]
表2：引物序列
[0052]
[0053][0054]
2、步骤1中的引物seq id no:1-seq id no:13由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0055]
3、用nuclease-free water将步骤2中合成的引物seq id no:1至seq id no:13溶解至50μm；
[0056]
4、按照等体积的原则，将稀释步骤3中稀释好的seq id no:1至seq id no:13共13条引物溶液进行混合，振荡混匀，瞬时离心，得到封闭引物。
[0057]
实施例2：在杂交捕获中的杂交效果验证
[0058]
本实施例比较了商品化human cot-1 dna试剂及本发明方法制备的封闭引物在基于液相杂交的目标区域捕获实验中的捕获效果。
[0059]
一、实验所用样本：
[0060]
验证样本：实施例1制备的封闭引物；
[0061]
对照样本：thermo fisher公司商品化的human cot-1 dna(cat.no.15279011)；
[0062]
杂交样本：人类基因组文库，构建流程采用genscript公司的gentrack dna library prep kit(cat.no.ngs09601&ngs09602)，按照其试剂盒说明书进行构建。
[0063]
二、实验试剂：genscript公司的genfisher hybridization and wash kit(cat.no.ngs09606&ngs09609)，采用来自于integrated dna technologies的xgen exome research panel v1.0(cat.no.1056115)、xgen human id research panel(cat.no.1075702)及xgen cnv backbone panel-tech access(cat.no.1080563)进行杂交捕获，探针的详细信息如表2所示。
[0064]
表2：实施例中使用的探针信息表
[0065][0066]
二、实验方法：
[0067]
验证样本与对照样本在基于液相杂交的目标区域捕获参照南京金斯瑞生物科技有限公司的genfisher hybridization and wash kit(cat.no.ngs09606&ngs09609)完成，详细步骤如下：
[0068]
a.杂交
[0069]
1.取500ng人类基因组文库样本至一新的200μl离心管中；
[0070]
2.向每一管文库中加入2.0μl gentrack universal blockers，然后向其中再加入human cot-1 dna，其中实验组加入本发明制备的替代human cot-1 dna的封闭引物，每个反应加入2μl，而对照组加入thermo fisher的human cot-1 dna，每个反应加入5.0μl。
[0071]
3.将离心管置于真空浓缩仪中，45℃浓缩至无可见液体残留。
[0072]
4.待步骤3中浓缩完成后，将浓缩后的样品从浓缩仪中取出，置于冰上，向其中依次加入以下试剂：
[0073][0074]
5.使用10μl移液器吹打混匀20次，室温静置至少5min；
[0075]
6.将离心管置于pcr仪中，运行以下杂交程序：
[0076]
(热盖温度：100℃体积：17μl)
[0077]
温度
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
时间
[0078]
95℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
30s
[0079]
65℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
hold(16～18h过夜)
[0080]
b.磁珠捕获与洗脱
[0081]
7.将捕获磁珠(cb)从4℃冰箱中取出，置于室温下平衡至少30min；
[0082]
8.配制所有1
×
工作液，现配现用，其中wb ii避光保存：
[0083][0084]
9.配制如下beads resuspension mix(现配现用，避光保存。)：
[0085][0086][0087]
10.待cb平衡至室温30min后，在使用前充分振荡混匀重悬cb；
[0088]
11.每个样本取25μl cb至一新的200μl离心管中；
[0089]
12.向每管25μl cb中加入100μl的1
×
bwb，吹打混匀10～15次，放置在磁力架上，至溶液澄清，弃上清；
[0090]
13.向每管中加入100μl的1
×
bwb，吹打混匀10～15次，放置在磁力架上，至溶液澄清，弃上清；
[0091]
14.再向每管中加入100μl的1
×
bwb，吹打混匀10～15次，放置在磁力架上，至溶液澄清，弃上清；
[0092]
15.加入17μl的bead resuspension mix至磁珠内，吹打混匀10～15次，确保没有干涸的磁珠在孔内。
[0093]
16.待杂交反应结束后，停止pcr程序，取出杂交液，同时设置并运行以下pcr程序：
[0094]
(热盖温度：70℃
ꢀꢀꢀ
体积：347μl)
[0095]
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
温度
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
时间
[0096]
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
65℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
∞
[0097]
17.将杂交反应液振荡混匀，瞬时离心；
[0098]
18.将杂交反应液全部转移至上述步骤15准备的17μl的磁珠重悬液中，吹打15～20次至溶液充分混匀；
[0099]
19.将上步混液放入步骤16中运行的pcr仪中进行65℃孵育，并手动计时45min，其中每10min将离心管取出进行快速轻微的震荡混匀；
[0100]
20.在上述65℃孵育期间，将1
×
wb i和1
×
wb ii放入65℃金属浴中预热；
[0101]
21.待45min计时结束后，将样本从pcr仪上取出，但pcr程序请勿停止；
[0102]
22.向每管中加入100μl预热(65℃)的1
×
wb i，吹打混匀15～20次，小心避免气泡的产生；
[0103]
23.1
×
wb i使用完成后，置于室温下平衡；
[0104]
24.将样本放置在磁力架上，静置1min，待溶液澄清后，弃上清；
[0105]
25.向每管中加入150μl预热(65℃)的1
×
wb ii，吹打混匀15～20次，小心避免气泡的产生；
[0106]
26.置于步骤16中运行的pcr仪上65℃计时孵育5min；
[0107]
27.孵育结束后，置于磁力架上，静置1min，待溶液澄清后，弃上清；
[0108]
28.向每管中加入150μl预热(65℃)的1
×
wb ii，吹打混匀15～20次；
[0109]
29.置于步骤16中运行的pcr仪上65℃计时孵育5min；
[0110]
30.孵育结束后，置于磁力架上，静置1min，待溶液澄清后，弃上清；
[0111]
以下步骤在室温下进行：
[0112]
31.向每管中加入150μl的室温下的1
×
wb i，充分震荡混匀；
[0113]
32.室温下静置2min，其中每30s震荡混匀，共震荡4次；
[0114]
33.瞬时离心，置于磁力架上1min，待溶液澄清后，弃上清；
[0115]
34.向每管中加入150μl的1
×
wb iii(室温)，充分震荡混匀；
[0116]
35.室温下静置2min，其中每30s震荡混匀，共震荡4次；
[0117]
36.瞬时离心，置于磁力架上1min，待溶液澄清后，弃上清；
[0118]
37.向每管中加入150μl的1
×
wb iv(室温)，充分震荡混匀；
[0119]
38.室温下静置2min，其中每30s震荡混匀，共震荡4次；
[0120]
39.瞬时离心，置于磁力加上1min，待溶液澄清后，弃上清；
[0121]
40.再使用10μl移液器小心去除管中残留的1
×
wb iv(无明显溶液残留即可)，并立即进行下一步。
[0122]
c.捕获后的pcr反应与pcr产物纯化
[0123]
41.向上步的离心管中加入以下试剂：
[0124]
试剂体积(μl)nuclease-free water36.05
×
pcr buffer10.0dntp1.0primer mix2.0dnap1.0总体积50
[0125]
42.吹打混匀15～20次，确保磁珠充分重悬；
[0126]
43.将离心管置于pcr仪中，并运行以下pcr程序：
[0127][0128]
44.将纯化磁珠(pb)从4℃冰箱中取出，置于室温下平衡至少30min；
[0129]
45.待pb平衡至室温30min后，在使用前充分振荡混匀重悬pb；
[0130]
46.待pcr结束后，向其中加入50μl的充分震荡混匀的pb磁珠；
[0131]
47.吹打混匀20～25次，室温静置5min；
[0132]
48.将离心管放在磁力架上，待溶液澄清，弃上清；
[0133]
49.保持离心管置于磁力架上，向其中加入200μl新鲜的80％乙醇，静置30s后，弃上清；
[0134]
50.重复上一步，共清洗两次；
[0135]
51.用10μl移液器小心去除管中残留的乙醇，保持离心管置于磁力架上，开盖晾干磁珠(不要过度干燥)；
[0136]
52.将离心管从磁力架上取下，向其中加入22μl nuclease-free water，并吹打混匀15～20次；
[0137]
53.室温静置5min，然后置于磁力架上；
[0138]
54.待溶液澄清，小心取20μl上清至新的200μl的pcr管中(不要吸到磁珠)，此即捕获好的文库。
[0139]
四、实验结果及数据分析：
[0140]
将步骤三捕获好的文库直接于illumina hiseq x ten上进行二代测序，并分析测序结果。结果如表3～5所示。
[0141]
表3：使用idt xgen pan cancer panel的探针进行杂交捕获的测序结果比较
[0142][0143]
表4：使用idt xgen human id research panel探针进行杂交捕获的测序结果比较
[0144][0145]
表5：使用idt xgen exome research panel v1.0探针进行杂交捕获的测序结果比较
[0146][0147]
*对于每个探针，各个实验及对照组均统一向下抽样至相同测序read数进行分析。
[0148]
本实施例对比了本发明方法制备的化学合成的人类基因组重复序列封闭引物及购买的商品化通过生物样品中制备提取的human cot-1 dna，分别应用于genscript生产的genfisher杂交捕获试剂盒的杂交捕获，通过不同杂交捕获探针文库的测试结果分析和对比可以发现，两者在探针捕获效率、靶区域覆盖度(coverage≥1
×
及coverage≥30
×
)及覆盖均一性(fold_80)三个方面并无明显差异，因此本发明通过化学合成制备的封闭引物可以成功封闭人类基因组上重复序列，取代商品化的human cot-1 dna并应用于核酸目标区域杂交捕获的技术中。
[0149]
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
[0150]
序列信息：
[0151]
seq id no:1
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