一种海参皂苷及其提取方法与流程

1.本发明涉及海参加工技术领域，具体涉及一种从海参加工副产物中的海参皂苷的提取方法。
技术背景
2.海参为棘皮动物门海参纲动物的总称，海参具有丰富的营养价值，其中海参皂苷是海参的主要次生代谢产物，也是其进行化学防御的物质基础。已有研究证明，多种海参皂甙具有显著的抗肿瘤活性及免疫调节作用，极富保健功能和药物价值。海参中的有效成分主要包括海参多糖，如刺参酸性黏多糖等，甾醇、三萜醇、海参皂苷等的活性物质。
3.海参皂苷极性较大，易溶于水、稀醇、热甲醇和乙醇中，难溶于丙醇，几乎不溶于乙醚、苯等亲脂性有机溶剂。为了充分利用海参皂苷的功能，现今人们对海参皂苷进行提取的方法比较简单，只能对海参本身中的海参皂苷进行提取，提取量小。
4.通过海参加工过程提取有效活性成分后的醇沉上清液副产物，一般将其回收乙醇后作为废弃物不再利用，造成环境污染和资源的浪费。但其中可能还含有可进一步回收利用的活性成分，例如海参皂苷可以从海参副产物中提取，此举可同时对海参废液进行回收利用，避免浪费废液本身的巨大价值。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种利用海参副产物提取海参皂苷的方法。本发明原材料来源于海参加工过程中的副产物，且实现了海参资源的多重利用。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种海参皂苷的提取方法，包括以下步骤：
8.(1)海参皂苷粗品制备：将海参副产物(酶解醇沉上清液)作为原料，减压浓缩至浸膏密度为1.1-1.3g/ml，加纯水溶解后，离心取清液，经超滤处理，超滤透过液减压浓缩，即得海参皂苷粗品溶液；
9.(2)海参皂苷粗品精制：取上述海参皂苷粗品溶液上已预处理好的大孔树脂柱，依次用纯水和乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液；
10.(3)将上述乙醇洗脱液减压干燥，即得海参皂苷。
11.优选地，所述步骤(1)中，所述海参副产物(酶解醇沉上清液)的制备方法为：取粉碎后的干燥海参，加入8-10倍海参重量的去离子水，质量分数为1％-1.5％的木瓜蛋白酶，50℃-55℃酶解6-8h，酶解液煮沸灭活，离心机离心取上清液，加乙醇溶液进行醇沉处理，使乙醇终浓度为60％-65％(v/v)，静置8h以上(优选8h-12h)，离心机离心取上清液。
12.在其中一种实施方式中，该干海参为糙海参；在另一实施方式中，所述海参副产物提取自梅花参。
13.优选地，步骤(1)中，减压浓缩温度≤80℃，真空度≤-0.08mpa，海参副产物浸膏密度为1.1-1.3g/ml。
14.优选地，步骤(1)中，溶解海参副产物浸膏加入的纯水量为浸膏重量的4-8倍。
15.优选地，步骤(1)中，离心4000-15000rpm。
16.优选地，步骤(1)中，超滤条件为：5kd中空纤维柱，回流压≤0.15mpa，超滤截留液体积至超滤前二分之一时，开始补去离子水，补至超滤前的液体体积数；超滤行为持续至超滤截留液cl-为阴性。
17.优选地，步骤(2)中所述大孔树脂柱选自：hp-20型非极性大孔树脂柱、ab-8型弱极性大孔树脂柱或者xad761型极性大孔树脂柱等。更优选地，所述大孔树脂为xad761型极性大孔树脂柱。
18.优选地，步骤(2)中，乙醇洗脱溶液浓度为30％-95％。
19.优选地，步骤(3)中，减压干燥条件为：温度≤80℃，真空度≤-0.08mpa。
20.本发明的另一个目的是提供一种上述制备方法所得的海参皂苷提取物。
21.本发明的还一个目的是提供所述海参皂苷在制备抗肿瘤、抗真菌、抗病毒、增强免疫力的药品或/及保健品、功能食品中的应用。
22.本发明的有益效果：
23.(1)本发明采用酶解、醇沉、离心、超滤、树脂纯化、乙醇洗脱等符合绿色环保、可持续发展理念的制备工艺，从海参加工副产物(酶解醇沉上清液)中制备获得海参皂苷，有效提高了海参的资源利用率，方法简单，对环境友好，且适宜于工业规模化生产。
24.(2)海参皂苷作为棘皮动物海参的主要次生代谢产物，也是其进行化学防御的物质基础。海参皂苷具有抗肿瘤、抗真菌、抗病毒、增强免疫力等多种生物活性。本发明技术方案既节省了生产成本，获得的海参皂苷部位中的皂苷可用于制备相关药品、保健品、功能食品。
具体实施方式
25.下文结合具体实施例来详细说明本发明内容，但这些具体实施例对本发明的权利要求的范围不构成任何限制。
26.仪器和试剂
27.5kd中空纤维超滤柱：北京旭邦膜设备有限责任公司，003w型。
28.hp-20型(非极性)大孔树脂柱：郑州和成新材料科技有限公司，250g/瓶。
29.ab-8型(弱极性)大孔树脂柱：天津允开树脂科技有限公司，1kg/袋。
30.xad761型(极性)大孔树脂柱：陶氏化学(罗门哈斯公司)，amberlite xad761型，1l/瓶。其他试剂均为市售产品。
31.实施例1
32.从糙海参副产物中提取海参皂苷的方法，包括以下步骤：
33.(1)海参副产物的制备：称取粉碎后的干燥糙海参，分别加入8倍海参重量的去离子水，质量分数为1％的木瓜蛋白酶，50℃酶解6h，酶解液煮沸灭活，离心机离心得上清液，加95％乙醇溶液进行醇沉处理，使乙醇终浓度为60％(v/v)，静置10h，离心机离心得上清液，即为海参副产物。
34.(2)海参皂苷粗品的提取：将原药材是糙海参的海参副产物，在温度为60℃，真空度≤-0.085mpa的条件下，减压浓缩至海参副产物浸膏密度为1.1g/ml，用海参副产物浸膏
重量4倍的纯水溶解，4000rpm离心处理，取清液，经5kd中空纤维超滤柱超滤处理，超滤条件为：5kd中空纤维柱，回流压≤0.15mpa，超滤截留液体积至超滤前二分之一时，开始补去离子水，补至超滤前的液体体积数；超滤行为持续至超滤截留液cl-为阴性；超滤透过液经60℃减压浓缩，即得海参皂苷粗品溶液；
35.(3)海参皂苷粗品精制：取上述海参皂苷粗品溶液，均分成三份，分别命名为样1、样2和样3，处理如下：
36.样1上已预处理好的hp-20型(非极性)大孔树脂柱，依次用5倍柱体积纯水和5倍柱体积20％乙醇溶液、5倍柱体积70％乙醇溶液、5倍柱体积95％乙醇溶液洗脱，洗脱流速控制在每小时1.5个柱床体积，收集70％乙醇洗脱液；
37.样2上已预处理好的ab-8型(弱极性)大孔树脂柱，依次用5倍柱体积纯水和5倍柱体积20％乙醇溶液、5倍柱体积70％乙醇溶液、5倍柱体积95％乙醇溶液洗脱，洗脱流速控制在每小时1.5个柱床体积，收集70％乙醇洗脱液；
38.样3上已预处理好的xad761型(极性)大孔树脂柱，依次用5倍柱体积纯水和5倍柱体积20％乙醇溶液、5倍柱体积70％乙醇溶液、5倍柱体积95％乙醇溶液洗脱，洗脱流速控制在每小时1.5个柱床体积，收集70％乙醇洗脱液；
39.(4)分别将上述三个样品的乙醇洗脱液减压干燥，减压干燥条件为：温度60℃，真空度≤-0.08mpa，即得海参皂苷；样1的海参皂苷得率为0.103％，样2的海参皂苷得率为0.129％，样3的海参皂苷得率为0.152％。
40.实施例2
41.从糙海参加工副产物中提取海参皂苷的方法，包括以下步骤：
42.(1)海参副产物的制备：称取粉碎后的干燥糙海参，分别加入10倍海参重量的去离子水，质量分数为1.5％的木瓜蛋白酶，55℃酶解6h，酶解液煮沸灭活，离心机离心得上清液，加95％乙醇溶液进行醇沉处理，使乙醇终浓度为62％(v/v)，静置12h，离心机离心得上清液，即为海参副产物。
43.(2)海参皂苷粗品的提取：将原药材是糙海参的海参副产物，在温度为70℃，真空度≤-0.085mpa的条件下，减压浓缩至海参副产物浸膏密度为1.2g/ml，用海参副产物浸膏重量6倍的纯水溶解，8000rpm离心，取清液，经5kd中空纤维超滤柱超滤处理，超滤条件为：5kd中空纤维柱，回流压≤0.15mpa，超滤截留液体积至超滤前二分之一时，开始补去离子水，补至超滤前的液体体积数；超滤行为持续至超滤截留液cl-为阴性；超滤透过液经60℃减压浓缩，即得海参皂苷粗品溶液；
44.(3)海参皂苷粗品精制：取上述海参皂苷粗品溶液，均分成三份，分别命名为样4、样5和样6，处理如下：
45.样4上已预处理好的hp-20型(非极性)大孔树脂柱，依次用5倍柱体积纯水和5倍柱体积20％乙醇溶液、5倍柱体积70％乙醇溶液、5倍柱体积95％乙醇溶液洗脱，洗脱流速控制在每小时1.5个柱床体积，收集70％乙醇洗脱液；
46.样5上已预处理好的ab-8型(弱极性)大孔树脂柱，依次用5倍柱体积纯水和5倍柱体积20％乙醇溶液、5倍柱体积70％乙醇溶液、5倍柱体积95％乙醇溶液洗脱，洗脱流速控制在每小时1.5个柱床体积，收集70％乙醇洗脱液；
47.样6上已预处理好的xad761型(极性)大孔树脂柱，依次用5倍柱体积纯水和5倍柱
体积20％乙醇溶液、5倍柱体积70％乙醇溶液、5倍柱体积95％乙醇溶液洗脱，洗脱流速控制在每小时1.5个柱床体积，收集70％乙醇洗脱液；
48.(4)分别将上述三个样品的乙醇洗脱液减压干燥，减压干燥条件为：温度70℃，真空度≤-0.08mpa，即得海参皂苷；样4的海参皂苷得率为0.112％，样5的海参皂苷得率为0.113％，样6的海参皂苷得率为0.163％。
49.实施例3
50.从糙海参加工副产物中提取海参皂苷的方法，包括以下步骤：
51.(1)海参副产物的制备：称取粉碎后的干燥糙海参，分别加入8倍海参重量的去离子水，质量分数为1％的木瓜蛋白酶，52℃酶解8h，酶解液煮沸灭活，离心机离心得上清液，加95％乙醇溶液进行醇沉处理，使乙醇终浓度为65％(v/v)，静置12h，离心机离心得上清液，即为海参副产物。
52.(2)海参皂苷粗品的提取：将原药材是糙海参的海参副产物，在温度为80℃，真空度≤-0.085mpa的条件下，减压浓缩至海参副产物浸膏密度为1.3g/ml，用海参副产物浸膏重量8倍的纯水溶解，15000rpm离心，取清液，经5kd中空纤维超滤柱超滤处理，超滤条件为：5kd中空纤维柱，回流压≤0.15mpa，超滤截留液体积至超滤前二分之一时，开始补去离子水，补至超滤前的液体体积数；超滤行为持续至超滤截留液cl-为阴性；超滤透过液经55℃减压浓缩，即得海参皂苷粗品溶液；
53.(3)海参皂苷粗品精制：取上述海参皂苷粗品溶液，均分成三份，分别命名为样7、样8和样9，处理如下：
54.样7上已预处理好的hp-20型(非极性)大孔树脂柱，依次用5倍柱体积纯水和5倍柱体积20％乙醇溶液、5倍柱体积70％乙醇溶液、5倍柱体积95％乙醇溶液洗脱，洗脱流速控制在每小时1.5个柱床体积，收集70％乙醇洗脱液；
55.样8上已预处理好的ab-8型(弱极性)大孔树脂柱，依次用5倍柱体积纯水和5倍柱体积20％乙醇溶液、5倍柱体积70％乙醇溶液、5倍柱体积95％乙醇溶液洗脱，洗脱流速控制在每小时1.5个柱床体积，收集70％乙醇洗脱液；
56.样9上已预处理好的xad761型(极性)大孔树脂柱，依次用5倍柱体积纯水和5倍柱体积20％乙醇溶液、5倍柱体积70％乙醇溶液、5倍柱体积95％乙醇溶液洗脱，洗脱流速控制在每小时1.5个柱床体积，收集70％乙醇洗脱液；
57.(4)分别将上述三个样品的乙醇洗脱液减压干燥，减压干燥条件为：温度80℃，真空度≤-0.08mpa，即得海参皂苷；样7的海参皂苷得率为0.121％，样8的海参皂苷得率为0.130％，样9的海参皂苷得率为0.159％。
58.实施例4
59.取上述实施例1、2和3的海参皂苷样品，采用紫外-可见分光光度法,以齐墩果酸为对照品建立标准曲线,5％香草醛-冰醋酸与高氯酸为显色剂,在560nm处检测测定总皂苷含量；三个实施例的海参皂苷得率及海参总皂苷含量如表1。
60.表1：糙海参副产物中海参皂苷得率及海参总皂苷含量
[0061][0062]
由实验结果可知，糙海参加工副产物中的海参皂苷提取，采用xad761型(极性)大孔树脂柱纯化处理，得到的海参皂苷产率较高，三种大孔树脂处理得到的海参皂苷的纯度(总皂苷含量)没有明显差异。
[0063]
实施例5
[0064]
从梅花参加工副产物中提取海参皂苷的方法，包括以下步骤：
[0065]
(1)海参副产物的制备：称取粉碎后的干燥梅花参，分别加入8倍海参重量的去离子水，质量分数为1％的木瓜蛋白酶，50℃酶解6h，酶解液煮沸灭活，离心机离心得上清液，加95％乙醇溶液进行醇沉处理，使乙醇终浓度为60％(v/v)，静置10h，离心机离心得上清液，即为海参副产物。
[0066]
(2)海参皂苷粗品的提取：将原药材是梅花参的海参副产物，在温度为60℃，真空度≤-0.085mpa的条件下，减压浓缩至海参副产物浸膏密度为1.1g/ml，用海参副产物浸膏重量4倍的纯水溶解，离心4000rpm，取清液，经5kd中空纤维超滤柱超滤处理，超滤条件为：5kd中空纤维柱，回流压≤0.15mpa，超滤截留液体积至超滤前二分之一时，开始补去离子水，补至超滤前的液体体积数；超滤行为持续至超滤截留液cl-为阴性；超滤透过液经60℃减压浓缩，即得海参皂苷粗品溶液；
[0067]
(3)海参皂苷粗品精制：取上述海参皂苷粗品溶液，均分成三份，分别命名为样10、样11和样12，处理如下：
[0068]
样10上已预处理好的hp-20型(非极性)大孔树脂柱，依次用5倍柱体积纯水和5倍柱体积20％乙醇溶液、5倍柱体积70％乙醇溶液、5倍柱体积95％乙醇溶液洗脱，洗脱流速控制在每小时1.5个柱床体积，收集70％乙醇洗脱液；
[0069]
样11上已预处理好的ab-8型(弱极性)大孔树脂柱，依次用5倍柱体积纯水和5倍柱体积20％乙醇溶液、5倍柱体积70％乙醇溶液、5倍柱体积95％乙醇溶液洗脱，洗脱流速控制在每小时1.5个柱床体积，收集70％乙醇洗脱液；
[0070]
样12上已预处理好的xad761型(极性)大孔树脂柱，依次用5倍柱体积纯水和5倍柱体积20％乙醇溶液、5倍柱体积70％乙醇溶液、5倍柱体积95％乙醇溶液洗脱，洗脱流速控制在每小时1.5个柱床体积，收集70％乙醇洗脱液；
[0071]
(4)分别将上述三个样品的乙醇洗脱液减压干燥，减压干燥条件为：温度60℃，真空度≤-0.08mpa，即得海参皂苷；样10的海参皂苷得率为0.162％，样11的海参皂苷得率为0.195％，样12的海参皂苷得率为0.226％。
[0072]
实施例6
[0073]
从梅花参加工副产物中提取海参皂苷的方法，包括以下步骤：
[0074]
(1)海参副产物的制备：称取粉碎后的干燥梅花参，分别加入10倍海参重量的去离子水，质量分数为1.5％的木瓜蛋白酶，55℃酶解6h，酶解液煮沸灭活，离心机离心得上清液，加95％乙醇溶液进行醇沉处理，使乙醇终浓度为62％(v/v)，静置12h，离心机离心得上清液，即为海参副产物。
[0075]
(2)海参皂苷粗品的提取：将原药材是梅花参的海参副产物，在温度为70℃，真空度≤-0.085mpa的条件下，减压浓缩至海参副产物浸膏密度为1.2g/ml，用海参副产物浸膏重量6倍的纯水溶解，离心8000rpm，取清液，经5kd中空纤维超滤柱超滤处理，超滤条件为：5kd中空纤维柱，回流压≤0.15mpa，超滤截留液体积至超滤前二分之一时，开始补去离子水，补至超滤前的液体体积数；超滤行为持续至超滤截留液cl-为阴性；超滤透过液经60℃减压浓缩，即得海参皂苷粗品溶液；
[0076]
(3)海参皂苷粗品精制：取上述海参皂苷粗品溶液，均分成三份，分别命名为样13、样14和样15，处理如下：
[0077]
样13上已预处理好的hp-20型(非极性)大孔树脂柱，依次用5倍柱体积纯水和5倍柱体积20％乙醇溶液、5倍柱体积70％乙醇溶液、5倍柱体积95％乙醇溶液洗脱，洗脱流速控制在每小时1.5个柱床体积，收集70％乙醇洗脱液；
[0078]
样14上已预处理好的ab-8型(弱极性)大孔树脂柱，依次用5倍柱体积纯水和5倍柱体积20％乙醇溶液、5倍柱体积70％乙醇溶液、5倍柱体积95％乙醇溶液洗脱，洗脱流速控制在每小时1.5个柱床体积，收集70％乙醇洗脱液；
[0079]
样15上已预处理好的xad761型(极性)大孔树脂柱，依次用5倍柱体积纯水和5倍柱体积20％乙醇溶液、5倍柱体积70％乙醇溶液、5倍柱体积95％乙醇溶液洗脱，洗脱流速控制在每小时1.5个柱床体积，收集70％乙醇洗脱液；
[0080]
(4)分别将上述三个样品的乙醇洗脱液减压干燥，减压干燥条件为：温度70℃，真空度≤-0.08mpa，即得海参皂苷；样13的海参皂苷得率为0.173％，样14的海参皂苷得率为0.189％，样15的海参皂苷得率为0.230％。
[0081]
实施例7
[0082]
从梅花参加工副产物中提取海参皂苷的方法，包括以下步骤：
[0083]
(1)海参副产物的制备：称取粉碎后的干燥梅花参，分别加入8倍海参重量的去离子水，质量分数为1％的木瓜蛋白酶，52℃酶解8h，酶解液煮沸灭活，离心机离心得上清液，加95％乙醇溶液进行醇沉处理，使乙醇终浓度为65％(v/v)，静置12h，离心机离心得上清液，即为海参副产物。
[0084]
(2)海参皂苷粗品的提取：将原药材是梅花参的海参副产物，在温度为80℃，真空度≤-0.085mpa的条件下，减压浓缩至海参副产物浸膏密度为1.3g/ml，用海参副产物浸膏重量8倍的纯水溶解，离心15000rpm，取清液，经5kd中空纤维超滤柱超滤处理，超滤条件为：5kd中空纤维柱，回流压≤0.15mpa，超滤截留液体积至超滤前二分之一时，开始补去离子
水，补至超滤前的液体体积数；超滤行为持续至超滤截留液cl-为阴性；超滤透过液经60℃减压浓缩，即得海参皂苷粗品溶液；
[0085]
(3)海参皂苷粗品精制：取上述海参皂苷粗品溶液，均分成三份，分别命名为样16、样17和样18，处理如下：
[0086]
样16上已预处理好的hp-20型(非极性)大孔树脂柱，依次用5倍柱体积纯水和5倍柱体积20％乙醇溶液、5倍柱体积70％乙醇溶液、5倍柱体积95％乙醇溶液洗脱，洗脱流速控制在每小时1.5个柱床体积，收集70％乙醇洗脱液；
[0087]
样17上已预处理好的ab-8型(弱极性)大孔树脂柱，依次用5倍柱体积纯水和5倍柱体积20％乙醇溶液、5倍柱体积70％乙醇溶液、5倍柱体积95％乙醇溶液洗脱，洗脱流速控制在每小时1.5个柱床体积，收集70％乙醇洗脱液；
[0088]
样18上已预处理好的xad761型(极性)大孔树脂柱，依次用5倍柱体积纯水和5倍柱体积20％乙醇溶液、5倍柱体积70％乙醇溶液、5倍柱体积95％乙醇溶液洗脱，洗脱流速控制在每小时1.5个柱床体积，收集70％乙醇洗脱液；
[0089]
(4)分别将上述三个样品的乙醇洗脱液减压干燥，减压干燥条件为：温度80℃，真空度≤-0.08mpa，即得海参皂苷；样16的海参皂苷得率为0.170％，样17的海参皂苷得率为0.203％，样18的海参皂苷得率为0.252％。
[0090]
实施例8
[0091]
取上述实施例5、6和7的海参皂苷样品，采用紫外-可见分光光度法,以齐墩果酸为对照品建立标准曲线,5％香草醛-冰醋酸与高氯酸为显色剂,在560nm处检测测定总皂苷含量；三个实施例的海参皂苷得率及海参总皂苷含量如表2。
[0092]
表2：梅花参副产物中海参皂苷得率及海参总皂苷含量
[0093][0094]
由实验结果可知，不同大孔树脂纯化处理得到的海参皂苷的产率为xad761型(极性)大孔树脂柱﹥ab-8型(弱极性)大孔树脂柱﹥hp-20型(非极性)大孔树脂柱。且提取条件相同的情况下，梅花参副产物中提取得到海参总皂苷含量大于糙海参。
[0095]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的
一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。