一种葡聚寡糖的制备方法与流程

1.本发明涉及生物工程技术领域，涉及一种葡聚寡糖的制备方法，特别设计一种生物酶法降解可得然胶制备β-1,3-葡聚寡糖。


背景技术：

2.可得然胶是β-葡聚糖的一种，主要由微生物分泌而得。可得然胶由d-葡萄糖通过β-(1,3)-糖苷键连接而成，且无支链，分子量在4.4
×
104～1
×
105。可得然胶具有三股螺旋结构，不溶于水和乙醇等大多数的有机试剂，可在具有氢键破坏能力的溶液中溶解，比如ph＞12的强碱性溶液、甲酸、二甲基亚砜(dmso)等。同时，它还具备加热后冷却凝胶的特性。此外，结合可得然胶粉末无色无味的特性，其常常作为食品添加剂被应用于食品工业中。相比之下，β-1,3-葡聚寡糖则存在较好的生物活性，比如诱导植物产生防御响应、免疫活性等。
3.目前，基于水解可得然胶制备β-1,3-葡聚寡糖的方法主要是酸水解。然而，酸水解效率较低，水解效率仅为25％左右，且产物聚合度跨度大；同时还造成环境污染等问题。生物法水解可得然胶制备β-1,3-葡聚寡糖是一种行之有效的、且绿色无污染的方法之一。研究表明，商业化的α-淀粉酶可水解可得然胶制备聚合度为1-9的β-1,3-葡聚寡糖，然而，水解产物宽泛的聚合度对于其后续的分离纯化，应用造成了较大的难度。因此，构建高效，窄聚合度的水解过程对于可得然胶来源的β-1,3-葡聚寡糖应用至关重要。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种高效酶解可得然胶制备窄聚合度的β-1,3-葡聚寡糖的方法。采用一种新的、可水解可得然胶的β-葡聚糖酶，经突变后，得到一种高效降解可得然胶的β-葡聚糖酶，其水解效率为80％-85％，β-1,3-葡聚寡糖聚合度为5-7。
5.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
6.一种葡聚寡糖的制备方法，以可得然胶为原料，通过β-葡聚糖酶对其进行酶解制备葡聚寡糖。
7.所述的葡聚寡糖为β-1,3-葡聚寡糖，其聚合度为5-7。
8.所述的β-葡聚糖酶的反应条件为：1-8ml 1-30g/l可得然胶，1-4ml 1mpbs(ph 5.0-7.0)，0.01-2ml 0.1-5g/lβ-葡聚糖酶，添加去离子水至反应体系为10ml。反应液置于30-70℃水浴锅，反应1-24h。反应结束后测定水解率，为45％-50％。
9.进一步优选地，反应温度为20-40℃，更优选的，反应温度为40℃。
10.pbs溶液优选为ph 6.0；
11.进一步优选地，反应时间为1-12h。
12.所述的β-葡聚糖酶来源于novosphingobium sp.p6w，氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.3所示。
13.本发明以来源于novosphingobium sp.p6w的β-葡聚糖酶为模版，对其序列进行非定向进化，获得一种新型重组β-葡聚糖酶，其氨基酸序列如seq id no.2所示。突变后反应
更快，反应时间更短，水解效率更高。
14.所述β-葡聚糖酶的突变体(seq id no.2)是将seq id no.1所示的原始β-葡聚糖酶氨基酸序列第112位的脯氨酸置换为甘氨酸，第300位的亮氨酸置换为谷氨酸，第415位的异亮氨酸置换为酪氨酸。
15.一种β-葡聚糖酶的突变体，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
16.编码seq id no.2所示β-葡聚糖酶的突变体的核苷酸序列。
17.一种表达载体，它包含所述β-葡聚糖酶基因或者β-葡聚糖酶突变体的基因。
18.一种重组菌，通过利用上述的表达载体转化宿主细胞获得的。
19.所述的β-葡聚糖酶突变体的反应条件为：1-8ml 1-30g/l可得然胶，1-4ml1m pbs(ph 6.0-8.0)，0.01-2ml 0.5g/lβ-葡聚糖酶，添加去离子水至反应体系为10ml。反应液置于30-70℃水浴锅，反应1-24h。反应结束后测定水解率，为80％-85％。
20.优选地，可得然胶浓度为20g/l，β-葡聚糖酶溶液浓度为0.5g/l，pbs优选为ph 7.0。
21.进一步优选地，反应温度为30-60℃，更优选的，反应温度为40-50℃。
22.进一步优选地，反应时间为1-12h；更优选的，β-葡聚糖酶突变体的反应时间为1-4h。
23.本发明中，β-葡聚糖酶及其突变体能够高效酶解可得然胶制备窄聚合度(5-7)的β-1,3-葡聚寡糖，糖的分离在工业上是一个难点，通常需要上千万的模拟流动床设备，因此水解产物的组分越复杂，聚合度跨度越大，越不利于产品后续的分离纯化，本发明酶解所得β-1,3-葡聚寡糖聚合度窄，大大降低后续分离纯化的难度。
24.需要注意的是，“β-葡聚糖酶基因”还包括能编码具有与β-葡聚糖酶相同功能的蛋白的seq id no.3的突变形式，所述突变类型包括：确实、无义、插入、错义。本领域技术人员能够理解，作为遗传密码简并性的结果，许多不同的多核苷酸能够编码相同的多肽。另外，应当理解，本领域技术人员能够使用常规的技术进行核苷酸取代，所述取代不会影响本发明中所使用的多核苷酸编码的多肽序列。另外，还可以使用本领域中的已知的方法对多核苷酸进行修饰，以增强本发明多核苷酸在体内的活性或者存活期。
25.本领域技术人员可根据本发明提供的β-葡聚糖酶的氨基酸，根据密码子的简并性原则等自行调整其核苷酸序列以及功能等价体，这些经过调整的序列也在本发明请求保护的范围内。
26.有益效果：本发明提供了一种高效，绿色的降解可得然胶制备聚合度为5-7的β-1,3-葡聚寡糖的方法，水解率高。
附图说明
27.图1 β-葡聚糖酶野生型水解率测定；
28.图2 β-葡聚糖酶野生型水解可得然胶的水解产物分布；
29.图3 野生型与突变体的酶活测定；
30.图4 β-葡聚糖酶的最适ph测定；
31.图5 β-葡聚糖酶的最适温度测定；
32.图6 β-葡聚糖酶突变体水解率测定；
33.图7 β-葡聚糖酶突变体水解可得然胶的水解产物分布。
具体实施方式
34.为使本发明的目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域的技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.在以下实施例中，可得然胶的配置方法为：将20g可得然胶溶解于1l浓度为1m naoh溶液中，磁力过夜搅拌使其完全溶解。随后使用1m hcl将其ph调节至7，离心(6000g,20min)收集沉淀。沉淀经纯水洗涤三次后，向其加入纯水，使可得然胶终浓度为20g/l，随后匀浆，制备可得然胶悬浮液。
36.实施例1 β-葡聚糖酶的制备及其应用
37.β-葡聚糖酶的基因(序列如seq id no.3所示)由通用生物(安徽)股份有限公司合成所得，合成片段构建至pet-28a(+)载体中(酶切位点为：bamh i和ecor i)。随后将其转化至大肠杆菌bl21(de3)，获得的重组菌株通过培养，培养基为lb培养基(nacl 1％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％)，培养条件为37℃，200rpm培养2-3小时，至od
600
在0.6-0.8之间，添加终浓度为1mm的iptg进行诱导表达，诱导表达的条件为：30℃，200rpm，进一步培养16小时，高压匀浆破碎，低温离心后收集上清，即为β-葡聚糖酶粗酶液。
38.β-葡聚糖酶粗酶液通过高亲和ni-nta纯化介质(购买自南京金斯瑞生物科技有限公司)纯化后，再经透析袋过滤并冷冻干燥后，即得β-葡聚糖酶粉末。
39.将上述的β-葡聚糖酶粉末用去离子水定容至0.5g/l，按如下体系进行酶解反应：2.5ml 20g/l可得然胶，2ml 1m柠檬酸盐缓冲溶液(ph 5.0)，0.1ml0.5g/lβ-葡聚糖酶，额外添加5.4ml水。反应液置于40℃水浴锅，反应16h。每隔两小时取样一次(20ml)，测定可得然胶的含量，以及反应终点的寡糖组成及转化率。
40.其中，可得然胶的含量测定方法如下：取10ml样品加热煮沸5min，随后高速离心(20000g,20min)，收集沉淀，并烘干至很重，称量记录质量，为m1。此外，取10ml 0.5g/l的β-葡聚糖酶液，加热煮沸5min，随后高速离心(20000g,20min)，收集沉淀，并烘干至恒重，称量记录质量，为m2。
41.可得然胶的含量(％)＝(m
1-m2)/10
×
100
42.其中，寡糖组成的方法测定如下：以聚合度为2-10的壳寡糖为标准品，采用hplc对酶解寡糖组分的聚合度进行分析。色谱柱为shodex聚乙烯醇氨基柱(nh2p-50 4e)，检测器为蒸发光检测器，流动相为乙腈/水(0-15min：70％-60％乙腈；15-25min：60％-50％；乙腈；25-30min：50％-70％乙腈)，流速为1ml/min，柱温30℃。
43.结果如附图1和2所示，在酶解12h后趋于稳定，水解率为47.7％，此时，寡糖由葡聚5糖，葡聚6糖和葡聚7糖组成。
44.实施例2 β-葡聚糖酶突变体的筛选
45.使用genemorph ii random mutagenesis kit(安捷伦，美国)对目标片段进行随机突变。其中，使用的引物为gf(5
’‑
cagcaaatgggtcgcggatccgtgacgtcccccgatttcggc-3’)和gr(5
’‑
ttgtcgacggagctcgaattctcagttgccgtccggccacgcc-3’)。易错pcr体系为：重组质
粒2μl，引物gf和gr各1μl，mutazyme ii dna聚合酶1μl，dntps 1μl，10
×
mutazyme ii反应缓冲液5μl，用ddh2o补足至50μl。易错pcr反应条件为：95℃ 3min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1.8min(30个循环)；72℃ 5min。随后，通过柱回收后，通过in-fusion cloning连接至通过bamh i和ecor i双酶切的pet-28a(+)质粒，获得重组质粒。将重组质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)，用含卡那霉素的抗性平板进行筛选。
46.挑选所有的转化子至96深孔板(1ml lb)中，在37℃，200rpm培养2h后，用0.1m iptg进行诱导表达，随后在37℃，200rpm中继续培养8h。取100μl菌液至普通96孔板中，并额外加入50ml 10mm对-硝基苯-β-d-吡喃葡萄糖苷(pnpg)，50ml 0.2m柠檬酸盐缓冲(ph 5.0)。反应10min后，立即加入2％磷酸三钠溶液(ph 12)终止反应，检测其在400nm处的吸收波长。以不同浓度的pnpg溶液做标曲，计算反应液中pnpg含量。其中，酶活的定义为：每分钟在ph 5和40℃下将1μmpnpg底物水解所需要的酶的数量。
47.相对酶活力(％)＝β-葡聚糖酶突变体酶活
×
100/β-葡聚糖酶初始酶活
48.其中，最适ph的测试方法为，取100μl诱导表达的菌液至普通96孔板中，并额外加入50ml 10mm对-硝基苯-β-d-吡喃葡萄糖苷(pnpg)，50ml 0.2m柠檬酸盐或磷酸盐缓冲调节ph至4、5、6、7、8、9、10；30℃下反应10min后测定并计算酶活。
49.其中，最适温度的测试方法为，取100μl诱导表达的菌液至普通96孔板中，并额外加入50ml 10mm对-硝基苯-β-d-吡喃葡萄糖苷(pnpg)，50ml 0.2m柠檬酸盐缓冲(ph 6.0)；在20、30、40、50、60、70、80℃下反应10min后测定并计算酶活。
50.实验结果如附图3所示，突变体1-63，突变体3-75，突变体6-22的酶活显著提升。其中，突变体3-75的酶活提升效果最显著，为β-葡聚糖酶初始酶活的272％。通过对突变体3-75的最适ph和最适温度的研究发现，与初始β-葡聚糖酶相比，均得到了显著的提升(图4、图5)。
51.实施例3 β-葡聚糖酶突变体的制备与应用
52.将突变体3-75过夜培养后，使用fastpure plasmid mini kit(南京诺维赞生物科技股份有限公司)提取突变体3-75的质粒，并送至通用生物(安徽)股份有限公司进行测序，其翻译后的氨基酸序列如seq id no.2所示。经对比发现，seq id no.2是将seq id no.1所示的原始β-葡聚糖酶氨基酸序列第112位的脯氨酸置换为甘氨酸，第300位的亮氨酸置换为谷氨酸，第415位的异亮氨酸置换为酪氨酸。
53.突变体3-75通过iptg诱导表达，高压匀浆破碎，低温离心后收集上清，即为β-葡聚糖酶突变体粗酶液。β-葡聚糖酶突变体粗酶液通过高亲和ni-nta纯化介质纯化后，再经透析袋过滤并冷冻干燥后，即得β-葡聚糖酶突变体的粉末。
54.将上述的β-葡聚糖酶突变体粉末用去离子水定容至0.5g/l，按如下体系进行酶解反应：2.5ml 20g/l可得然胶，2ml 1m磷酸盐缓冲溶液(ph 7.0)，0.1ml 0.5g/lβ-葡聚糖酶，额外添加5.4ml水。反应液置于50℃水浴锅，反应8h。每隔两小时取样一次(20ml)，测定可得然胶的含量，以及反应终点的寡糖组成及转化率。可得然胶含量和寡糖的测定如实施例1所述。
55.实验结果如图6和图7所示，在酶解4h后趋于稳定，水解率为82.3％，此时，寡糖由葡聚5糖，葡聚6糖和葡聚7糖组成。