一种粉虱类胡萝卜素合成基因沉默方法

1.本发明涉及农业昆虫与害虫防治，具体是涉及一种粉虱类胡萝卜素合成基因沉默方法，即沉默烟粉虱类胡萝卜素合成基因影响烟粉虱趋黄性的方法。


背景技术：

2.烟粉虱为半翅目、粉虱科、小粉虱属的一类体型微小的昆虫。随着全球贸易的迅速发展，烟粉虱在全球范围内广泛传播，为害蔬菜、花卉等经济作物以及木薯、甘薯等粮食作物，烟粉虱在成虫期和若虫期均可危害寄主植物，在世界范围内造成重大的经济损失。
3.目前在生产实际中对于烟粉虱的防治主要依赖于化学药剂防控，但由于化学农药的滥用及使用不规范，粉虱的抗药性问题日趋严重，加大了粉虱的防治难度。同时化学农药的过度使用造成了许多不良后果，如对农产品使用者和消费者的健康构成风险及对非目标生物造成损害等。为解决化学药剂的大量使用对粉虱抗药性以及对生态环境的影响，需要进一步探索新型防治措施。
4.昆虫感受光的本质是视觉色素吸收光子，将吸收的光学信号转化为电信号后在昆虫体内传导。视觉色素分子包含视蛋白，是g蛋白的偶联受体，结构通常为11-顺式视黄醛（维生素a），类胡萝卜素是合成维生素a的前体物质，与昆虫的视觉能力存在密切关系。视觉信号在昆虫定位寄主植物，寻找配偶和产卵过程中起着至关重要的作用。因此，通过干扰昆虫的视觉能力，可为害虫的无公害防治提供理论基础，但目前还没有基于影响粉虱视觉能力对其进行防治的方法。


技术实现要素：

5.为探索新型防治方法，本发明的目的是提出一种粉虱类胡萝卜素合成基因沉默方法，沉默类胡萝卜素合成基因从而影响粉虱趋黄性，即通过病毒诱导的基因沉默（vigs）方法，沉默烟粉虱类胡萝卜素合成基因，干扰粉虱的视觉能力而达到防治粉虱的目的。
6.本方案目的是通过以下技术方案实现的：一种粉虱类胡萝卜素合成基因沉默方法，其技术要点是：包括以下步骤：（1）构建沉默表达载体
①ꢀ
获取粉虱基因靶标片段btggps1的pcr纯化产物；
②ꢀ
所述基因靶标片段btggps1的pcr纯化产物、2mdna1载体分别进行双酶切，获得含有bamhi和xbai两个粘性末端的靶标基因ggps1片段、2mdna1载体片段；
③
所述含有bamhi和xbai两个粘性末端的靶标基因ggps1片段与2mdna1载体片段连接，获得2mdna1-ggps1连接产物；
④ꢀ
所述2mdna1-ggps1连接产物热击转化克隆菌株大肠杆菌dh5α；热击处理后进行2mdna1特异性检测，获得2mdna1-ggps1重组沉默表达载体，浓度调整为30-40 ng/μl；
⑤ꢀ
所述2mdna1-ggps1重组沉默表达载体电击转化eha105农杆菌感受态细胞；获得含2mdna1-ggps1沉默表达载体的农杆菌；
（2）所述含2mdna1-ggps1沉默表达载体的农杆菌按照农杆菌侵染法接种健康植株后，通过2mdna1特异性检测，获得携带2mdna1沉默载体的vigs植株；（3）在携带2mdna1沉默载体的vigs植株上饲养粉虱；获得具有2mdna1-ggps1沉默表达载体的粉虱，所述2mdna1-ggps1沉默表达载体的粉虱的类胡萝卜素合成基因ggps1表达被抑制、类胡萝卜素含量降低。
7.进一步的，所述类胡萝卜素合成基因沉默方法用于降低粉虱趋黄性，影响粉虱视觉。
8.进一步的，所述粉虱类胡萝卜素基因沉默体系适用于烟粉虱、温室白粉虱。
9.进一步的，所述粉虱基因靶标片段btggps1具有seq id no：1所示的核苷酸序列；所述粉虱基因靶标片段btggps1获取的方法为：以粉虱cdna为模板，用引入了bamhi和xbai两个内切酶酶切位点靶标基因片段引物，扩增目的基因有效片段；所述bamhi和xbai两个内切酶酶切位点靶标基因片段引物为p-ggps1-f和p-ggps1-r，所述p-ggps1-f具有seq id no：2所示的核苷酸序列，所述p-ggps1-r具有seq id no：3所示的核苷酸序列；所述靶标基因片段长度为100-1000 bp，测序验证后用promega公司的纯化试剂盒纯化，获得靶标片段ggps1的pcr纯化产物。
10.进一步的，所述靶标片段ggps1的pcr纯化产物、2mdna1载体双酶切均采用takara 公司的quickcut限制性内切酶试剂盒；反应条件均为：30℃，1hour；37℃，1hour；70℃，10min使酶失活。
11.进一步的，所述含有bamhi和xbai粘性末端的ggps1靶标基因片段和2mdna1载体片段连接采用t4 dna ligase试剂盒，把靶标基因ggps1片段：2mdna1载体片段体积比为2.5 μl：0.5 μl，混匀后4℃过夜连接，获得2mdna1-ggps1连接产物。
12.进一步的，所述2mdna1特异性检测的引物为dna1f和dna1r ，所述dna1f具有seq id no：4所示的核苷酸序列，所述dna1r具有seq id no：5所示的核苷酸序列。
13.进一步的，所述步骤（3）中，所述粉虱为烟粉虱，所述vigs植株为vigs番茄植株；所述在携带2mdna1沉默载体的vigs植株上饲养粉虱的方法为：取羽化1d的烟粉虱，在vigs番茄植株上饲喂13 d，获得2mdna1
‑ꢀ
ggps1沉默表达载体的烟粉虱。
14.本发明的有益效果：本方法通过粉虱取食vigs植株后类胡萝卜素合成基因ggps1表达被抑制，其体内类胡萝卜素含量显著下降，影响了粉虱的视觉能力，趋黄性受到显著影响；同时粉虱死亡率显著上升，产卵量显著下降，种群数量被显著抑制，起到粉虱防治的作用。
附图说明
15.图1 为羽化1 d烟粉虱取食携带2mdna1沉默载体的vigs番茄13 d后类胡萝卜素合成基因表达情况，图中2mdna1-control为取食携带2mdna1空载体番茄的烟粉虱；所述2mdna1-ggps1为取食携带2mdna1-ggps1番茄的烟粉虱；图2为羽化1 d烟粉虱取食携带2mdna1沉默载体的vigs番茄13 d后类胡萝卜素含量变化，图中2mdna1-control为取食携带2mdna1空载体番茄的烟粉虱，所述2mdna1-ggps1为取食携带2mdna1-ggps1番茄的烟粉虱；
图3为实施例中2.3烟粉虱趋黄性测定；图4为羽化1 d烟粉虱取食携带2mdna1沉默载体的vigs番茄13 d后烟粉虱趋黄性结果，图中2mdna1-control为取食携带2mdna1空载体番茄的烟粉虱，所述2mdna1-ggps1为取食携带2mdna1-ggps1番茄的烟粉虱。
具体实施方式
16.烟粉虱沉默类胡萝卜素合成基因影响烟粉虱趋黄性方法：1．获得2mdna1沉默表达载体1.1 烟粉虱基因靶标片段的获取所述基因靶标片段btggps1具有seq id no：1所示的核苷酸序列：atggatgtga acggctgtgt ctacaaaagc aaaactggcg ataaggatca agatgaaattttactgcaac ccttcacgta catcctgcaa gttccaggaa agcaaatcag aggaaaattagcgcaggctt tcaatgtttg gctaaatatt ccagatgaga agttggccgt tgttggggatattgttttgt tgctgcacaa ctccagtttg ttaattgatg acattcaaga taactcaattttaaggagag gcatccctgt tgctcattct atctacggag tggccagcac catcaatgccgctaattatg ttctttttat tgcccttgaa agggtgctca gccttggtca tccagaggcaacgtctgtgt atacagaaca gctcttgaag ttgcaccgag gacagggcat ggaaatttattggcgagaca attatctatg tccttccgaa gaagaatacc gaactatgac tatgtgtaaaactggtggat tattcatgct tgctatcagg ttgatgcagc tctttagtga caataagtctgattttacga aactcacagg catacttgga ctctactttc aaatccgtga tgattattgtaatcttagtc tgaaggagta ttgtgaaaat aagagctatt gtgaagatct cacggaaggcaaattcagct tccctataat tcatgccatc aagagtcgac cagaagatcg acaagtcctaaacatcttgc ggcagcgaac gcaggatgtc gaagttaaac gctactgcgt caagctcttggaaaaatttg gttctttcca gtacacgcac gatgtactag tggaattgga cagacaagcacgagaggaga ttgagaaact gggtgggaat ccaaaaatga tgatgatttt agatgaactatataactgga accaagagac tgagtaa所述烟粉虱基因靶标片段获取的方法为：以烟粉虱cdna为模板，用引入了bamhi和xbai两个内切酶酶切位点靶标基因片段引物，扩增目的基因有效片段；所述bamhi和xbai两个内切酶酶切位点靶标基因片段引物为：p-ggps1-f（seq id no：2）:cgggatccatggatgtgaacggctgtg；p-ggps1-r（seq id no：3）:gctctagaatgcctgtgagtttcgt；所述靶标基因片段长度为100-1000 bp，测序验证后用promega公司的纯化试剂盒纯化，获得靶标片段ggps1的pcr纯化产物；参考文献：luan jb, chen w, hasegawa dk, et al. 2015. metabolic coevolution in the bacterial symbiosis of whiteflies and related plant sap-feeding insects. genome biology and evolotion, 7: 2635-2647.1.2 靶标片段pcr纯化产物与2mdna1载体双酶切
采用takara 公司的quickcut试剂盒；所述靶标片段pcr纯化产物与2mdna1载体反应条件：分别30℃，1hour；37℃，1hour；70℃，10min使酶失活；获得含有bamhi和xbai两个粘性末端的靶标基因ggps1片段和2mdna1载体片段；1.3 靶标基因ggps1片段与2mdna1载体片段连接使用t4 dna ligase（promega公司的酶）将含有bamhi和xbai粘性末端的ggps1靶标基因片段，和2mdna1载体片段按照t4 dna ligase配套的说明书，把靶标基因ggps1片段：2mdna1载体片段体积比为2.5 μl：0.5 μl，混匀后4℃过夜连接，获得2mdna1-ggps1连接产物；1.4 2mdna1-ggps1连接产物热击转化克隆菌株大肠杆菌dh5α具体操作步骤如下：（1）取一管-80℃冰箱保存的大肠杆菌dh5α感受态细胞（购买于takara公司），置冰上融化；（2）在超净工作台中，取一无菌的2ml离心管，加入10 μl2mdna1-ggps1连接产物、50 μl感受态细胞，轻弹混匀，冰浴10-30 min；（3）42 ℃热击60-90 s后迅速置冰上冷却5 min；（4）加入940 μl lb液体培养基（无抗生素），于37 ℃、200 rpm摇床中振荡培养1 h；（5）8,000 rpm离心1 min，留下200 μl沉淀，重悬菌液后分别取适量均匀涂布于lb-kana平板（x-gal（20 μl）、iptg（10 μl），37 ℃倒置培养过夜。
17.（6）用无菌小号枪头挑取白色单菌落于lb-kana液体培养基中，37 ℃条件下，摇床230 rpm培养8-10 h 后做相关检测。
18.参考文献：huang, c.j., xie, y., & zhou, x.p. (2010). efficient virus
‐
induced gene silencing in plants using a modified geminivirus dna1 component. plant biotechnol j, 7(3), 254-265.黄昌军. (2009). 双生病毒dna1分子诱导的基因沉默体系的建立及其应用.转化后大肠杆菌菌液pcr进行 2mdna1特异性检测，引物dna1f（seq id no：4）:gtatgagcctttaatggcc；引物dna1r（seq id no：5）:gagactcttcctcttgcc；验证正确的菌株即含有2mdna1-ggps1重组质粒，在大肠杆菌dh5α中大量培养复制，通过天根公司的质粒小提试剂盒提取菌体的重组质粒，即为2mdna1-ggps1重组沉默表达载体，将重组质粒的浓度调整到30-40 ng/μl；后用于下一步电击转化。
19.1.5 2mdna1-ggps1重组沉默表达载体电击转化农杆菌eha105步骤如下：（1）取上一步10 μl重组质粒加入到200 μl根癌农杆菌感受态细胞中，用无菌枪头抽吸几次轻轻混匀，转入事先清洗并预冷过的电击杯中，盖好盖子置于冰上10 min；（2）准备好电击装置（bio-rad），电压调至2400 v，电脉冲25 μf，电阻400 ω，用擦镜纸把电击杯表面擦干，尤其是电极的部分不能有水，将电击杯放入电转仪的卡槽里，按下电击按钮，直至提示电击结束，出现电击成功的光滑曲线；
（3）把电击杯取出放入超净工作台室温静置2 min，加入800 μl不含抗生素的yep液体培养基，反复抽吸几次，使菌均匀分布便于转移到无菌的2 ml离心管中，在28 ℃培养箱中静置1 h，待感受态农杆菌恢复活力后以200 rpm转速振荡培养3-4 h；（4）上述培养液可室温静置半天后再进行后续操作；（5）8000 rpm离心3 min，弃800 μl上清培养基，留下200 μl菌体，充分重悬混匀，根据yep固体培养基的湿润程度（每15 ml培养基含x-gal（20 μl）、iptg（10 μl、硫酸卡那霉素kana 终浓度100 μg/ml、利福平rif 终浓度50 μg/ml）进行蓝白斑筛选），取适量的菌液于yep-kana-rif平板上涂布均匀（涂布后平板表面尽可能比较干燥，便于长出来单克隆，如果未长出来单克隆，可适当降低抗生素浓度后再次重新涂布培养），在培养箱中28℃倒置避光培养48-72h。
20.（6）重组农杆菌相关检测参照1.4该步骤获得了含2mdna1-ggps1沉默表达载体和2mdna1空载体的农杆菌eha105菌株，成功构建了2mdna1-ggps1沉默表达载体。
21.2．2mdna1介导的烟粉虱基因沉默体系构建2.1 农杆菌侵染法获取vigs番茄通过农杆菌侵染法获取vigs番茄（番茄的品种l402），具体方法如下：（1）将1.5中含2mdna1-ggps1沉默表达载体和2mdna1空载体的农杆菌eha105菌株按照体积比1：100分别接种在10 ml含kana（100 μg/ml）和rif（50 μg/ml）的yep液体培养基中，在28 ℃、230 rpm摇床中培养约12-16 h至对数生长期;（2）8000 rpm离心5-10 min，弃去所有上清；（3）用乙酰丁香酮溶液重悬菌液至od600在1.0-1.5；（4）将菌液放置于28 ℃培养箱中静止3 h左右，2mdna1-ggps1与烟草曲茎病毒tbcsv相关菌液1：1混合均匀，2mdna1与tbcsv相关菌液体积1：1混合均匀，用于3-4片真叶的番茄接种；（5）接种时，用无菌的1 ml的一次性注射器，在距离供试番茄（3-4片真叶）茎基部进行韧皮部注射，同时在下部嫩叶背面用带有菌液的针头划数下在伤口处涂抹菌液，每株植物接种0.2-0.5 ml；（6）接种14 d后，取上部新长出的叶片提取dna，利用2mdna1特异性引物（dna1f和dna1r）进行普通pcr检测，检测到载体的植株（这些番茄可称作vigs番茄）可用于后续实验；检测后分别获得携带沉默载体的2mdna1-ggps1沉默表达载体的番茄植株和2mdna1的番茄植株。
22.参考文献：谢艳, 等. (2002). 粉虱传双生病毒的tas-elisa及pcr快速检测. 植物病理学报, 2: 87-91.李正和. (2005). 云南番茄双生病毒鉴定及烟草曲茎病毒致病分子机理研究. 浙江大学.2.2在携带2mdna1沉默载体的vigs番茄上饲养烟粉虱采用步骤2.1携带2mdna1-ggps1沉默表达载体的vigs番茄植株（处理组）和2mdna1的vigs番茄植株（对照组）分别饲养烟粉虱，具体方法为：取羽化1d的烟粉虱，在vigs番茄上
取食13d后检测烟粉虱基因表达，具体步骤如下：通过qrt-pcr以β-actin为内参，用2-δct
法分析数据。取羽化1d内的粉虱，在vigs番茄上取食若干天（对照组2mdna1-control，处理组2mdna1-ggps1），5头雌虫每个生物学重复提rna，对照处理分别用all-in-one cdna synthesis supermix（bimake，usa）反转录到相同的浓度，通过qrt-pcr检测其ggps1基因表达情况，引物为：qrt-ggps1-f（seq id no：6）： gcaacccttcacgtacatcc；qrt-ggps1-r（seq id no：7）：caacaacggccaacttctca；β-actin
ꢀ‑
f（seq id no：8）：tggagatggtgtttcccacac；β-actin
ꢀ‑
r（seq id no：9）：ccagccaagtccaaacgaag；取食携带2mdna1-ggps1沉默载体的vigs番茄的烟粉虱（处理组）较取食2mdna1载体的番茄的烟粉虱（对照组）类胡萝卜素合成基因ggps1表达被抑制，如图1。处理组较对照组ggps1基因表达极显著下调，下调了82%（p 《 0.01），即烟粉虱基因沉默。同时羽化1d的烟粉虱在vigs番茄上取食7d后，检测处理组烟粉虱死亡率为45%，较对照组显著升高（p 《 0.05），平均产卵量较对照组极显著下降40%（p 《 0.01），处理组种群总数较对照组烟粉虱极显著下降49%（p 《 0.01）。
23.2.3烟粉虱类胡萝卜素合成基因沉默后类胡萝卜素含量和趋黄性测定类胡萝卜素含量：取分别取食2mdna1-ggps1沉默表达载体的vigs番茄植株（处理组）和2mdna1的vigs番茄植株（对照组）13 d的烟粉虱，即基因沉默的烟粉虱，用试剂盒检测基因沉默烟粉虱体内类胡萝卜素含量，沉默烟粉虱ggps1基因后，烟粉虱的类胡萝卜素含量极显著下降（p《0.01）低至62%，见图2。
24.参考文献：ding by, niu j, shang f, et al. 2019. characterization of the geranylgeranyl diphosphate synthase gene in acyrthosiphon pisum (hemiptera: aphididae) and its association with carotenoid biosynthesis. frontiers in physiology, 10:1398.趋黄性检测：取分别取食2mdna1-ggps1沉默表达载体的vigs番茄植株（处理组）和2mdna1的vigs番茄植株（对照组）13 d的烟粉虱，即基因沉默的烟粉虱，放入趋黄性测定装置中，于人工气候室检测，趋黄性测定装置中央放置绿色植物，两侧放置与植物叶片面积相同的黄板和蓝板，见图3。检测用50头雌虫为一个生物学重复，对烟粉虱进行暗处理30分钟后将烟粉虱迅速放入小装置内，分别观察1分钟和放入5分钟后烟粉虱的趋色性，根据色板上虫子的数量计算出趋色比例。
25.在烟粉虱刚被放入装置1分钟时，处理组烟粉虱和对照组烟粉虱相较趋黄比例极显著下降（p《0.01）；在烟粉虱被放入装置5分钟后，处理组趋黄比例仍与对照组差异显著（p《0.05），见图4。
26.研究表明，烟粉虱类胡萝卜素合成基因被沉默后，烟粉虱的类胡萝卜素含量降低，烟粉虱的趋黄性受到影响。因此，烟粉虱类胡萝卜素基因沉默可作为影响烟粉虱视觉的重要手段，能对烟粉虱寻找、取食寄主植物、在叶片上交配、产卵等重要生理活动产生影响，有望成为烟粉虱生物防治的重要方法。此外，本方法适用于其它白粉虱等粉虱类昆虫。