一种水溶性联苯芳烃的合成及生物毒素解毒的应用

1.本发明涉及一种生物毒素解毒方法，具体涉及一种水溶性(拓展)联苯芳烃的合成及对生物毒素解毒的应用，属于超分子化学及生物医药领域。


背景技术：

2.随着人类活动的增加，生物毒素中毒已经成为一个严重的健康问题。生物毒素是由动物、植物和微生物等在一定条件下产生的对其它生物物种有毒害并不可复制的化学物质，是一大类生物活性物质的总称，也称为天然毒素。目前，临床应用的人工解毒的方法主要包括：血液透析、洗胃、口服活性炭和使用解毒剂等。就解毒剂而言，解毒机理主要有两种：药效学和药代动力学。药效学以身体为靶向，在体内作用部位调节或破坏生物毒素。而药代动力学旨在通过免疫疗法或者药物代谢实现外周阻滞使目标生物毒素的浓度低于其起效浓度。相比于药效学，药代动力学不需要了解毒素的作用机理，且只作用于毒素从而使其副作用降到最低。酶作为一种精细的催化剂能够精准有效降低生物毒素在体内的浓度，从而实现对生物毒素的解毒。但由于酶免疫原性强、稳定性差，其应用往往受到限制。
3.使用纳米尺寸的合成大环化合物解毒有望解决上述难题，将生物毒素分子包裹进入大环化合物的空腔，通过竞争络合阻碍生物毒素对细胞的破坏从而减缓生物毒素分子对身体造成的损害。利用该策略，部分大环化合物，例如环糊精、葫芦脲、杯芳烃、柱芳烃等已成功应用于生物毒素的解毒，但大环化合物往往只能包裹较小尺寸或者中等尺寸的生物毒素，不能对大的生物分子进行有效地络合，导致对部分生物毒素不能实现有效的解毒。因此，亟需开发新型大环化合物用于大分子生物毒素的解毒。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种水溶性联苯芳烃衍生物、其制备方法及其应用，本发明水溶性联苯芳烃衍生物还能为一种水溶性拓展联苯芳烃大环化合物，其中(拓展)联苯芳烃作为大环骨架具有纳米级的空腔结构且易于后修饰，可通过超分子作用高效识别生物毒素从而达到解毒的目的；修饰柔性侧链旨在延长空腔深度，扩大疏水相互作用的区域面积增强络合能力；末端引入阴离子结构单元则是为了提高化合物的水溶性和生物相容性，增添对阳离子客体静电作用位点。
5.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种水溶性联苯芳烃衍生物，其结构式具有如下式i所示结构：
[0007][0008]
其中，n为1-4；m为1-4；
[0009]
r结构通式为如下式ii所示：
[0010][0011]
其中，a为0-6；
[0012]
阴离子结构单元x为如下式iii所示中的至少一种：
[0013]
coonahpo3naso3na
[0014]
coonh4hpo3kso3k
[0015]
式iii。
[0016]
优选地，n为1或2；m为1或2；a为0或1；阴离子结构单元x为羧酸铵基团。最优的n为2；最优的m为2；最优的a为1。水溶性(拓展)联苯芳烃衍生物其药学上可接受的盐包括：铵盐、钠盐和钾盐，优选的为钠盐。
[0017]
优选地，所述水溶性联苯芳烃衍生物为2，2”，4，4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵，其结构式如下式iv所示：
[0018][0019]
一种本发明水溶性联苯芳烃衍生物的制备方法，包括如下步骤：
[0020]
(1)2,2”,4,4
”‑
乙氧羰基四联苯[4]芳烃的合成：
[0021]
在氮气保护下，将2,2”,4,4
”‑
全羟基四联苯[4]芳烃和无水k2co3按照10:255的摩尔比溶于至少丙酮溶液中，在不低于80℃下加热回流搅拌至少2小时，再滴加溴乙酸乙酯，按照质量百分比计算的溴乙酸乙酯的加入量不低于2,2”,4,4
”‑
全羟基四联苯[4]芳烃质量的177.5％，继续加热回流搅拌至少48小时；待反应完全后，冷却至室温，抽滤除去碳酸钾，用二氯甲烷润洗滤饼至少两次，合并有机相，减压蒸馏除掉溶剂，将所得固体加入少量二氯甲烷恰好使得固体溶解，接着加入大量的石油醚，随之有大量固体析出，抽滤得到淡黄色颗粒状产物，得到2,2”,4,4
”‑
乙氧羰基四联苯[4]芳烃；
[0022]
(2)2,2”,4,4
”‑
羧酸四联苯[4]芳烃的合成：
[0023]
氮气保护下，将2,2”,4,4
”‑
乙氧羰基四联苯[4]芳烃0.40g溶于至少50ml无水乙醇中，加入30ml的质量分数不低于20％的naoh溶液，在不低于85℃加热回流至少10小时；待反应完全后，冷却至室温，减压蒸馏除去乙醇，再加入至少25ml水，接着缓慢滴加质量百分比不低于36％的浓盐酸并搅拌，调节ph至2～3，该过程伴随固体颗粒析出，抽滤得黄色片状产物，得到2,2”,4,4
”‑
羧酸四联苯[4]芳烃；
[0024]
(3)2,2”,4,4
”‑
酰胺四联苯[4]芳烃的合成：
[0025]
将2,2”,4,4
”‑
羧酸四联苯[4]芳烃0.16mmol溶于至少5ml无水n,n-二甲基甲酰胺中，搅拌至固体完全溶解，接着加入hobt(1-羟基苯并三唑)至少3.22mmol、edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)至少3.22mmol，在常温搅拌至少1小时后，加入4-[2(叔丁氧羰基)乙基]-4-氨基戊烷二甲酸二叔丁酯至少1.93mmol，继续室温搅拌至少24小时；待反应完全后，用二氯甲烷/水萃取分离有机相，再用饱和nahco3水溶液萃取，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏浓缩，经柱层析分离纯化得产物，得到2,2”,4,4
”‑
酰胺四联苯
[4]芳烃；
[0026]
(4)2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵的合成：
[0027]
在氮气保护下，将2,2”,4,4
”‑
酰胺四联苯[4]芳烃0.059mmol溶于至少50ml无水乙醇中，加入至少30ml质量分数不低于20％的naoh溶液，在不低于85℃加热回流至少10小时；待反应完全后，冷却至室温，减压蒸馏除去乙醇，再加入至少25ml水，接着缓慢滴加质量百分比不低于36％的浓盐酸并搅拌，调节ph至2～3，该过程伴随固体颗粒析出，抽滤得黄褐色固体；接着向所得固体中加入至少6ml的质量百分比不低于28％的浓氨水，室温搅拌48小时；待反应完全后，减压蒸馏得黄色颗粒状产物，最终得到2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵产物。
[0028]
优选地，溶剂为水、缓冲溶液、甲醇、乙醇、异丙醇或者它们的至少两种的混合物。
[0029]
一种本发明水溶性联苯芳烃衍生物的应用，应用于在生物毒素解毒方面药物的制备。
[0030]
优选地，生物毒素为如下至少一种：蛇毒肽、蜂毒肽、蝎毒肽、蛛毒肽、黄曲霉毒素、镰刀菌毒素、赤霉菌毒素、霍乱毒素、大肠杆菌肠毒素、白喉毒素、河豚毒素、西加毒素、水母毒素、芋螺毒素、沙蚕毒素、鱼腥藻毒素、刀豆氨酸、β-氰基丙氨酸、相思子毒素、蓖麻毒素、蛋白酶抑制剂和植物凝集素、生氰单糖苷、生氰二糖苷。
[0031]
进一步优选地，生物毒素为如下至少一种：蛇毒肽、蜂毒肽、蝎毒肽、蛛毒肽。最优的为蛛毒肽lyetxi，其结构如下面的式v：
[0032][0033]
术语“超分子作用”指的是分子间的相互作用，包括静电作用、氢键、范德华力、π-π堆积和疏水作用等，是研究超分子化学的基础。
[0034]
术语“识别”指的是两个或两个以上的分子之间通过非共价键结合相互作用，产生某种特定功能的过程。
[0035]
本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
[0036]
1.本发明合成了一种水溶性2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵，反应条件温和高效，具有良好的水溶性及生物相容性，可用于多类生物毒素的解毒；
[0037]
2.本发明进一步扩充了超分子大环对大分子生物毒素识别的可能性，也为超分子治疗提供了一个新的方向；
[0038]
3.本发明化合物具有良好的溶解性和生物相容性，通过超分子作用络合能够和生物毒素形成稳定的主客体复合物，其在pbs缓冲溶液中有很高的结合力，且本发明中涉及的化合物能够有效降低生物毒素的细胞毒性和溶血毒性。
附图说明
[0039]
图1为2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵的1hnmr图谱。
[0040]
图2为2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵的
13
cnmr图谱。
[0041]
图3为10mm磷酸缓冲溶液中(ph＝7.4)罗丹明123与2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵竞争荧光滴定拟合图。
[0042]
图4为罗丹明123/2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵溶液中lyetxi与2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵竞争荧光滴定拟合图。
[0043]
图5为lyetxi及lyetxi/2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵复合物对人正常肾上表皮细胞的细胞毒性。
[0044]
图6为2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵对人正常肾上表皮细胞的细胞毒性。
[0045]
图7为lyetxi及lyetxi/2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵复合物对兔红细胞的溶血毒性。
[0046]
图8为2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵对兔红细胞的溶血毒性。
[0047]
图9为本发明水溶性联苯芳烃衍生物的分子结构。
具体实施方式
[0048]
下面详细描述本发明的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体条技术或条件的，按照本领域内文献所描述的常规技术或条件和制造商建议的技术或条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。其中2,2”,4,4
”‑
全羟基四联苯[4]芳烃的合成方法见专利201910382405.9。
[0049]
以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：
[0050]
实施例一：
[0051]
在本实施例中，2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵的合成：
[0052]
1、2,2”,4,4
”‑
乙氧羰基四联苯[4]芳烃的合成：
[0053][0054]
氮气保护下，将2,2”,4,4
”‑
全羟基四联苯[4]芳烃(0.40g,0.28mmol)和无水k2co3(2.16g,7.14mmol)溶于50ml丙酮溶液中，80℃下加热回流搅拌2小时，再滴加溴乙酸乙酯(0.71g,4.28mmol),继续加热回流搅拌48小时。待反应完全后，冷却至室温，抽滤除去碳酸
钾，用二氯甲烷润洗滤饼多次，合并有机相，减压蒸馏除掉溶剂，将所得固体加入少量二氯甲烷恰好使得固体溶解，接着加入大量的石油醚，随之有大量固体析出，抽滤得到淡黄色颗粒状产物(0.48g,0.23mmol,yield:82.0％)。
[0055]
2、2,2”,4,4
”‑
羧酸四联苯[4]芳烃的合成：
[0056][0057]
氮气保护下，将2,2”,4,4
”‑
乙氧羰基四联苯[4]芳烃(0.40g,0.19mmol)溶于50ml无水乙醇中，加入30mlnaoh溶液(质量分数20％)，85℃加热回流10小时。待反应完全后，冷却至室温，减压蒸馏除去乙醇，再加入25ml水，接着缓慢滴加质量百分比为36％的浓盐酸并搅拌，调节ph至2～3，该过程伴随固体颗粒析出，抽滤得黄色片状产物(0.27g,0.15mmol,yield:76.2％)。
[0058]
3、2,2”,4,4
”‑
酰胺四联苯[4]芳烃的合成：
[0059][0060]
把2,2”,4,4
”‑
羧酸四联苯[4]芳烃(0.30g,0.16mmol)溶于5ml无水n,n-二甲基甲酰胺中,搅拌至固体完全溶解，接着加入hobt(1-羟基苯并三唑)(0.62g,3.22mmol)、edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(0.43g,3.22mmol),常温搅拌1小时后，加入4-[2(叔丁氧羰基)乙基]-4-氨基戊烷二甲酸二叔丁酯(0.80g,1.93mmol)，继续室温搅拌24小时。待反应完全后，用二氯甲烷/水萃取分离有机相，再用饱和nahco3水溶液萃取，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏浓缩，经柱层析分离纯化得产物(0.44g,0.087mmol,yield:54.5％)。
[0061]
4、2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵的合成：
[0062][0063]
氮气保护下，将2,2”,4,4
”‑
酰胺四联苯[4]芳烃(0.30g,0.059mmol)溶于50ml无水乙醇中，加入30mlnaoh溶液(质量分数20％)，85℃加热回流10小时。待反应完全后，冷却至室温，减压蒸馏除去乙醇，再加入25ml水，接着缓慢滴加质量百分比为36％浓盐酸并搅拌，调节ph至2～3，该过程伴随固体颗粒析出，抽滤得黄褐色固体。接着向所得固体中加入质量百分比为28％的6ml浓氨水，室温搅拌48小时。待反应完全后，减压蒸馏得黄色颗粒状产物(0.13g,0.032mmol,yield:53.3％)，结果如图1和2所示。
[0064]
实施例二：
[0065]
本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：
[0066]
在本实施例中，2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵和生物碱类客体间络合常数的定量测定：
[0067]
1、实验样品
[0068]
本发明采用荧光竞争滴定的方法进行定量检测，所选用的荧光指示剂为罗丹明123。将2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵滴加到罗丹明123溶液中，其特征发射荧光会被淬灭；配制2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵和罗丹明123复合物溶液，滴加生物毒素竞争客体可观测到荧光恢复。2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵由实施例1合成得到，罗丹明123由美国阿拉丁工业公司购得。
[0069][0070]
2、实验方法
[0071]
配制10mmph7.4的磷酸缓冲溶液，之后用上述溶剂精准配制1μm的罗丹明123溶液，再用此罗丹明123液溶解一定量的2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵，向1μm的罗丹明123中滴加含有2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵的罗丹明123溶液，荧光光谱检测其荧光强度的变化，通过非线性拟合即可得到2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵和罗丹明123间的络合常数；配制1μm的罗丹明123和一定摩尔比例的2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵的溶液，并用此溶液溶解一定量的生物毒素类竞争客体，将后者溶液滴加到前者中，荧光光谱检测其荧光强度的变化，通过非线性拟合即可得到2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵和生物毒素类竞争客体间的络合常数。
[0072]
3、实验结果
[0073]
将2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵滴加到罗丹明123溶液中，其特征发射荧光明显降低，通过非线性拟合得到2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵和罗丹明123间的络合常数为(7.86
±
0.26)
×
106m-1
(ph＝7.4)。进一步将lyetxi竞争客体滴加到罗丹明123/2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵溶液中，罗丹明123的特征发射荧光又会恢复，通过非线性拟合得到2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵和lyetxi竞争客体间的络合常数ph7.4的磷酸缓冲液中的值为(7.01
±
0.18)
×
107m
–1，如图3和图4所示。结果表明2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵与lyetxi具有强的络合能力。
[0074]
实施例三：
[0075]
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
[0076]
在本实施例中，2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵缓解生物毒素细胞毒：
[0077]
1、实验样品
[0078]
2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵有实施例1合成得到，人正常肾上表皮细胞293t由北京中生奥邦生物科技有限公司购得，细胞增殖检测试剂盒cck-8由上海东仁化学科技有限公司购得。
[0079]
2、试验方法
[0080]
使用含有10％肽牛血清的，1％青霉素和1％链霉素的dmem培养基培养人正常肾上表皮细胞(293t)至稳定传代，取对数生长期的细胞接种到96孔板中(8000细胞/孔)，置于培养箱(5％co2,37℃)中培养24小时，之后每个孔更换新鲜培养基90μl和10μl不同浓度的2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵培养基溶液、生物毒素培养基溶液和生物毒素/2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵培养基溶液，其浓度均分别设为160、80、40、20、10、5和2.5μm，每个浓度平行5个复孔，同时设置对照组，混合均匀后置于培养箱中继续孵育。24小时后，配制10％的cck-8培养基溶液，更换含有上述三种培养基溶液置于孵育箱中再次培养0.5小时，然后在全自动酶标仪450nm处测定各副孔的od值。
[0081]
3、实验结果
[0082]
如图5～6所示。
[0083]
cck-8法考察2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵、lyetxi和lyetxi/2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵对人正常肾上表皮细胞293t的细胞毒性结果表明，在2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵相对高的浓度(160μm)下，293t细胞仍有较好的细胞活力(》90％)，表明2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵对293t细胞的毒性小。将160μmlyetxi和2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵共同与293t孵育下，细胞的存活率由5.01％上升到了90.67％，说明2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵的加入显著降低了lyetxi的细胞毒性。
[0084]
实施例四：
[0085]
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
[0086]
在本实施例中，2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵缓解生物毒素溶血：
[0087]
1、实验样品
[0088]
2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵有实施例1合成得到。
[0089]
2、试验方法
[0090]
溶血毒性使用兔血红细胞来进行评估，将新鲜血液1000r
·
min-1
低温离心5min，弃去上清并使用pbs润洗3次，最后使用pbs重悬得到5％(v/v)红细胞悬浮液。将2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵溶液、生物毒素溶液和生物毒素/2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵溶解于pbs并分别将浓度稀释至160、80、40、20、10、5和2.5μm，分别加入到上述细胞悬浮液中在37℃孵育12小时。孵育时间结束后将红细胞悬液1000r
·
min-1
低温离心5min，并将100μl的上清液转移到96孔板中，在酶标仪中测量405nm下的光密度值，每个样品平行测5遍。
[0091]
3、实验结果
[0092]
如图7～8所示。
[0093]
首先排除2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵的溶血毒性干扰，结果表明其几乎不具有溶血毒性。将游离的lyetxi与兔血红细胞共孵育12小时，可以观察到其具有明显的溶血毒性，在其160μm时，溶血率已经达到了(97.39
±
7.40)％。同样将lyetxi/2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵共孵育12小时，其溶血毒性发生明显改变，160μm时，溶血率已经下降至(14.26
±
6.31)％。该结果说明2,2”,4,4
”‑
四联苯[4]芳烃羧酸铵能够有效抑制lyetxi的溶血毒性。
[0094]
上述实施例水溶性(拓展)联苯芳烃的合成及对生物毒素解毒的应用。本发明中涉及的化合物具有良好的溶解性和生物相容性，通过超分子作用络合能够和生物毒素形成稳定的主客体复合物，其在pbs缓冲溶液中有很高的结合力，且上述实施例中涉及的化合物能
够有效降低生物毒素的细胞毒性和溶血毒性。上述实施例水溶性(拓展)联苯芳烃作为一种潜在的生物毒素解毒剂，有望改善对大分子生物毒素的临床解毒效果也为超分子在生物医学领域的应用提供了一个新的思路。
[0095]
上面结合附图对本发明实施例进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。