一种提高小麦光合作用的小分子蛋白及其应用

1.本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种提高小麦光合作用的小分子蛋白(epw，enhance photosynthesis of wheat)及其应用。


背景技术：

2.小麦是我国重要的粮食作物，提高小麦产量对保障我国粮食安全意义重大。科学合理的施肥和灌溉是实现作物高产稳产的关键，在大田生产中，合理施肥和灌溉，可促进小麦生长，提高小麦产量，但是随着肥料的大量施用，肥料利用率会显著下降，导致大量施用肥料残留在土壤中，并造成肥料流失，引起环境污染。提高作物养分吸收效率是增加作物产量，降低肥料污染的关键措施。叶片光合作用对小麦生长具有重要作用，其中旗叶对产量具有重要的作用，提高旗叶光合作用可显著提高小麦产量。小麦叶片是籽粒碳水化合物的主要来源，旗叶光合速率和旗叶面积与穗粒重和产量具有显著正相关关系。因此，提高旗叶光合速率或者延长旗叶光合作用时间对提高小麦产量具有重要的作用。
3.植物激素在植物生长发育、耐逆和养分吸收中起着重要的调控作用。最近，研究发现许多小分子物质也具有类似激素的功能。目前，已在动物和植物中发现了大量的小分子蛋白(多肽)，在调控动植物的抗病、耐逆和生长中起着非常重要的作用。因此，在充分研究小分子蛋白功能的基础上，开发新型的调控小麦体内离子转运的小分子蛋白，建立适宜的体外施用方法，提高小麦旗叶中养分含量，增强小麦光合作用，可为提高小麦产量，保障我国粮食安全提供技术支撑。


技术实现要素：

4.本发明利用生物信息学分析和研究，并对部分氨基酸进行了更换，通过反复筛选，最终找到了19个可显著提高小麦旗叶光合作用的小分子蛋白epw-1～epw-19。在适宜生育期，通过叶面喷施epw溶液的方法，可以增加小麦体内epw含量，进而提高小麦叶片光合作用能力，提高小麦产量。
5.本发明的技术方案是：一种提高小麦光合作用的小分子蛋白，其特征是，其为epw-1至epw-19中任一种或者两种以上的混合物，所述epw-1至epw-19的氨基酸序列如下：
6.epw-1：dvrptapghspsigh
7.epw-2：dvrptapghspsvgh
8.epw-3：dvrptapghspsagh
9.epw-4：dvrptapghspsmgh
10.epw-5：dvrptapghspgigh
11.epw-6：dvrptapghspsign
12.epw-7：dvrptapghspsvgn
13.epw-8：dvrptapghspsagn
14.epw-9：dvrptapghspsmgn
15.epw-10：dfrptapghspgign
16.epw-11：dfrptapghspsign
17.epw-12：dfrptapghspsvgn
18.epw-13：dfrptapghspsagn
19.epw-14：dfrptapghspsmgn
20.epw-15：dfrptapghspgigh
21.epw-16：dfrptapghspsigh
22.epw-17：dfrptapghspsvgh
23.epw-18：dfrptapghspsagh
24.epw-19：dfrptapghspsmgh
25.上述小分子蛋白epw-1至epw-19可以提高小麦光合作用(尤其是旗叶的光合作用)，进而提高小麦产量。
26.采用上述epw-1至epw-19提高小麦光合作用的方法为：在小麦扬花期叶面喷施epw溶液；所述epw溶液为含有silwet系列有机硅表面活性剂的epw的水溶液，大田使用时，每亩喷施10-15l。epw溶液中添加silwet系列有机硅表面活性剂可促进小分子蛋白进入小麦叶片，促进epw的作用发挥，更好提高产量。
27.上述epw溶液的工作浓度为：epw-1至epw-19中任一种或者两种以上的混合物的终浓度为0.1
±
0.05g/l(优选0.1g/l)，silwet系列有机硅表面活性剂的浓度为0.005-0.01％。
28.本发明的技术效果为：
29.1、现有技术主要通过育种方法提高小麦产量或通过增加施肥量或者多次施肥等栽培学方法提高小麦产量。但是，随着施肥量的增加，小麦的肥料利用率降低，施肥次数增多又会增加劳动成本。本发明方法克服了现有技术存在的问题，在小麦生殖生长关键时期，采用叶片喷施小分子蛋白，提高小麦旗叶光合作用，提高小麦产量。因此，使用该产品，可在不增加化肥用量前提下，提高小麦产量，不仅可以防止环境污染，又可以提高小麦产量，具有广阔的应用前景。
30.2、大田实验表明，小麦叶面喷施epw溶液后，可提高小麦旗叶光合作用，提高小麦千粒重，并能提高小麦产量。因此，本发明方法不仅具有提高小麦旗叶光合作用，还具有提高产量的功能，为小麦生产可持续高效发展提供了现实有效的产品和方法。
附图说明
31.图1为试验例一分别用epw-1至epw-19的溶液处理小麦，对小麦旗叶净光合速率的影响图；从图中看出：epw-1至epw-19溶液均能显著提高小麦旗叶净光合速率；
32.图2为试验例二分别用epw-1至epw-19的溶液处理小麦，对小麦千粒重的影响图；从图中看出：epw-1至epw-19溶液均能显著提高小麦千粒重；
33.图3为试验例三分别用epw-1至epw-19的溶液处理小麦，对小麦产量的影响图；从图中看出：epw-1至epw-19溶液均能显著提高小麦产量；
34.图4为试验例四分别用epw和zlc溶液处理小麦，对小麦旗叶净光合速率的的影响图；从图中看出：相比zlc溶液，epw溶液能显著提高小麦旗叶净光合速率；
35.其中，epw溶液：含silwet l-77表面活性剂的epw的水溶液；zlc溶液：含silwet l-77表面活性剂的zlc的水溶液；ck：含有相同浓度的silwet l-77表面活性剂的清水对照。
具体实施方式
36.下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果做进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。本发明所述方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。本发明所述试剂若无特殊说明均为市售试剂。
37.实施例1：小分子蛋白氨基酸序列的确定
38.(1)确定小分子蛋白氨基酸序列
39.本技术发明人根据禾本科小麦、大麦和燕麦等作物中的该蛋白序列，结合小麦中该蛋白基因的表达丰度，利用生物信息学进行了特异性等分析和研究，并对部分氨基酸进行了更换，从300多个小分子蛋白中，初步选择了78个小分子蛋白，测定了这78个小分子蛋白叶面喷施对小麦旗叶叶色和光合作用，最终发现了19个小分子蛋白可显著提高小麦旗叶光合作用。该19种小分子蛋白的第3至11位氨基酸是保守的，为：rptapghsp。将上述19种小分子蛋白序列分别命名为：epw-1至epw-19。
40.(2)小分子蛋白合成及保存
41.利用fmoc固相多肽合成方法合成小分子蛋白。合成步骤如下：
42.①
取fmoc-c端第一位氨基酸-王树脂0.3g，放入离心管，用dcm溶胀20分钟，抽滤掉dcm；加3倍树脂体积的20％哌啶/dmf溶液溶解，利用氮吹仪，吹氮气30分钟，使其干燥；添加2倍树脂体积的dmf，洗涤5次，离心倒掉液体。
43.②
取0.27mmol fmoc-c端第二位氨基酸-oh，0.54mmol dipea，0.26mmol hbtu，加入上述离心管，加入适量溶剂dmf反应30分钟，得到fmoc-c端第二位氨基酸-c端第一位氨基酸-王树脂。氨基酸：dipea:hbtu：树脂＝3：6：2.85：1(摩尔比)；然后用2倍树脂体积的dmf洗涤3次上一步骤的树脂；然后加3倍树脂体积的20％pip/dmf溶液，鼓氮气30分钟，抽干，脱除fmoc基团，得到h2n-第二位氨基酸-第一位氨基酸-王树脂；最后，用2倍树脂体积的dmf洗涤5次上一步骤的树脂。
44.③
重复步骤2，每重复一次步骤2可增加1个氨基酸，根据小分子蛋白序列要求进行重复，得到最终目标小分子多肽。
45.④
甲醇洗涤树脂3次，然后加6倍树脂体积的切割液(体积比；三氟乙酸：茴香硫醚：1,2-乙二硫醇：苯酚：水＝87.5％：5％：2.5％：2.5％：2.5％)，摇床摇晃2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小时，得到小分子蛋白粗品100mg。
46.⑤
通过hplc仪器纯化得到95％以上纯度的小分子蛋白：
47.首先用c18分析柱快梯度分析小分子蛋白粗品。流动相为：水相a：0.1％tfa/水；有机相b：0.1％tfa/乙腈；梯度：5％-70％，20分钟，粗品主峰在7min分钟左右。
48.其次，使用c18制备柱进行小分子蛋白分离，收集目标峰。测质谱，发现收集的目标峰的分子量和目标小分子蛋白分子量吻合，纯度在95％以上为初步合格。然后，将收集到的目标峰溶液先用液氮速冻，再放冻干机上真空干燥成粉末状，取冻干后的粉末状小分子蛋
白1mg，用水溶解，进行hplc和ms复测，纯度在95％以上，分子量没有变化为最终合格。
49.该类小分子蛋白可放置在-80℃保存2年左右，在-20℃保存半年左右。
50.实施例2：叶面肥epw配制及施用
51.分别取epw-1至epw-19以及上述19种小分子蛋白的等质量混合物10g，用1l去离子水溶解，制成100x母液，母液可在-20℃以下放置1-2周，如在室温需要现配现用。
52.在大田应用时，取epw母液100ml，用自来水进行稀释，最终稀释定容至10l，然后加入1ml silwet l-77表面活性剂，混合均匀，使其终浓度达到0.1g/l，epw工作液中含有1/10000的silwet l-77表面活性剂，将溶液用于下述的试验例。
53.在小麦扬花期进行叶面喷施，喷施量为10-15l/亩；选择上午10点以前或下午4点以后，并且1天内无雨时喷施。喷施时尽量让小麦叶片正反面都能均匀喷施上epw溶液。
54.试验例一、叶面喷施epw溶液对小麦光合作用的影响
55.选取饱满的济麦22号小麦种子，于2020年10月16日在山东曲阜播种于大田，小麦播种量为每亩25斤种子，等行距种植，行距20cm。设置19种喷施epw(epw-1至epw-19共19种类型)溶液的处理，以喷施含有相同浓度的silwet l-77表面活性剂的清水为对照，随机区组排列，重复3次。小区面积36m2，采用6行区。在小麦扬花期，选取无雨天气于下午4点后，每亩叶面喷施0.1g/l的epw溶液10l。喷施20天后测定小麦旗叶的光合速率。本试验中epw溶液为分别含epw-1至epw-19的19种小分子蛋白溶液(制备方法如实施例2所示)。
56.试验结果：测定小麦旗叶光合速率，发现与对照相比，喷施epw显著提高小麦旗叶光合速率(图1)。证实叶面喷施epw溶液可以显著提高小麦旗叶光合速率，且epw-1至epw-19溶液在提高小麦旗叶光合速率方面效果相差不大。
57.试验例二、叶面喷施epw溶液对对小麦千粒重的影响
58.选取饱满的济麦22号小麦种子，于2020年10月16日在山东曲阜播种于大田，小麦播种量为每亩25斤种子，等行距种植，行距20cm。设置19种喷施epw(epw-1至epw-19共19种类型)溶液的处理，以喷施含有相同浓度的silwet l-77表面活性剂的清水为对照，随机区组排列，重复3次。小区面积36m2，采用6行区。在小麦扬花期，选取无雨天气于下午4点后，每亩叶面喷施0.1g/l的epw溶液10l。小麦成熟后，每个小区单独收获，收获后测定小麦千粒重。本试验中epw溶液为分别含epw-1至epw-19的19种小分子蛋白溶液(制备方法如实施例2所示)，喷施时尽量让小麦叶片正反面都能均匀喷施上epw溶液。
59.试验结果：小麦收获后，测定小麦千粒重，发现与对照相比，喷施epw溶液显著提高小麦千粒重(图2)，且epw-1至epw-19溶液在提高小麦千粒重方面效果相差不大。
60.试验例三叶面喷施epw溶液对小麦产量的影响
61.选取饱满的济麦22号小麦种子，于2020年10月16日在山东曲阜播种于大田，小麦播种量为每亩25斤种子，等行距种植，行距20cm。设置19种喷施epw(epw-1至epw-19共19种类型)溶液的处理，以喷施含有相同浓度的silwet l-77表面活性剂的清水为对照，随机区组排列，重复3次。小区面积36m2，采用6行区。在小麦扬花期，选取无雨天气于下午4点后，每亩叶面喷施0.1g/l的epw溶液10l。小麦成熟后，进行收获，并测定小麦产量。本试验中epw溶液为分别含epw-1至epw-19的19种小分子蛋白溶液(制备方法如实施例2所示)，喷施时尽量让小麦叶片正反面都能均匀喷施上epw溶液。
62.试验结果：小麦收获后，测定小麦产量，发现与对照相比，喷施epw溶液显著提高小
麦产量(图3)，且epw-1至epw-19溶液在提高小麦千粒重方面效果相差不大。
63.试验例四、叶面喷施epw和zlc溶液对小麦光合作用的影响
64.申请人之前申请了1项发明专利，申请号为2021110799970，该专利申请的有效成分为zlc1至zlc20中的任一种或者两种以上的组合。采用zlc喷施棉花叶片，可以提高棉花产量和纤维品质。为了比较zlc与发明有效成分epw的功能差异，进行了如下实验：
65.选取饱满的济麦22号小麦种子，于2020年10月16日在山东曲阜播种于大田，小麦播种量为每亩25斤种子，等行距种植，行距20cm。设置喷施epw混合物溶液处理(epw混合物为epw-1至epw-19共19种类型小分子蛋白的等重量混合物的溶液，制备方法如实施例2所示)，喷施zlc混合物溶液处理(zlc混合物溶液zlc-1至zlc-20共20种类型小分子多肽的等重量混合物溶液，制备方法与申请号为2021110799970的专利相同)，以喷施含有相同浓度的silwet l-77表面活性剂的清水为对照，随机区组排列，重复3次。小区面积36m2，采用6行区。在小麦扬花期，选取无雨天气于下午4点后，每亩叶面喷施0.1g/l的epw混合物和zlc混合物溶液各10l。喷施20天后测定小麦旗叶的光合速率。
66.试验结果：测定小麦旗叶光合速率，发现与对照相比，喷施epw显著提高小麦旗叶光合速率，epw处理小麦光合速率比对照提高19.1％；喷施zlc也能稍微提高小麦旗叶光合速率，比对照提高7.2％；但是epw处理小麦旗叶的光合速率显著高于zlc处理，比zlc处理高11.9％(图4)。证实epw提高小麦旗叶光合速率的效果显著优于zlc。棉花是双子叶锦葵科植物，而小麦是单子叶禾本科植物，棉花和小麦亲缘关系很远，针对棉花研发的zlc不能高效提高小麦光合作用。