用于获得间充质干细胞及其外泌体的培养基及其制备方法与流程

1.本发明涉及间充质干细胞培养技术领域，尤其涉及用于获得间充质干细胞及其外泌体的培养基及其制备方法。


背景技术：

2.间充质干细胞是一种源于中胚层的多能干细胞，广泛存在于骨髓、脐带、胎盘、脂肪等组织和血液中，能够无限制自我更新，多向分化，在合适的条件下，能在体外或者体内定向分化为脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞等等，作为组织修复的种子细胞，间充质干细胞可以在体内或者体外培养扩增，并能够分泌大量的细胞因子，具有免疫调节、炎症抑制等功能，用于治疗免疫相关疾病，而且间充质干细胞基本不具备免疫原性，能够异体移植，总的来说，间充质干细胞具有不菲的临床医用价值。
3.首先，传统方法中，干细胞的培养体系主要应用含动物血清的培养基，但是动物血清所带来的异源性污染和已知或未知的病毒、支原体等病原体污染，在此种环境下生长的干细胞，其内部结构会发生何种变化尚未可知，其次，市场上的无血清培养基存在价格昂贵、细胞生长周期短、细胞增殖效果不佳以及细胞衰老快等缺点。


技术实现要素：

4.为了解决上述背景技术中所提到的技术问题，而提出的用于获得间充质干细胞及其外泌体的培养基及其制备方法。
5.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
6.用于获得间充质干细胞及其外泌体的培养基，以dmem/f12为基础培养基添加如下成分：10～22g/ml血清替代物、20～55ng/ml促生长因子、5～10ng/ml肌层细胞修复因子hcgf、5～16mm抗衰老因子、缓冲剂、0.5～3mg/l抗氧化剂、1～20mg/l维生素、抗生素、5～65mg/l微量元素、1～16μg/ml保护剂，所述缓冲剂与dmem/f12基础培养基的体积比为1％，所述抗生素与dmem/f12基础培养基的体积比为2％；
7.所述血清替代物包括10～20g/l人血白蛋白、5～20mg/l人转铁蛋白、1～10mg/l人胰岛素、1～5mg/l纤连蛋白和5～30μg/ml胆固醇；
8.所述促生长因子包括5～10ng/ml表皮生长因子egf、5～10ng/ml成纤细胞生长因子fgf、5～10ng/ml血小板来源团增质因子pdgf、5～10ng/ml生长激素释放抑制因子srih、5～10ng/ml角化细胞生长因子kgf；
9.所述抗衰老因子包括5～10mm烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性酶sirt1、1～3mm蛋白激酶b或者1～3mm 5
’‑
溴脱氧腺苷中的一种或者几种的混合物；
10.所述保护剂为1μg/ml乙醇胺和15μg/ml聚乙烯吡咯烷酮的混合物。
11.作为上述技术方案的进一步描述：
12.以dmem/f12为基础培养基添加的成分还包括重组干扰素γ10～50μg/l、细胞松弛素d 0.5～2.0μg/ml和600～1000μg/ml无机盐，所述无机盐包括400～600μg/ml的钾盐、0.6
～0.9μg/ml的果糖二磷酸钠和200～300μg/ml的组胺二盐酸盐，所述钾盐为氯化钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的一种或者几种的混合物。
13.作为上述技术方案的进一步描述：
14.所述缓冲剂包括碳酸氢钠或者n-取代的3-氨基-2-羟基丙磺酸的衍生物中的一种。
15.作为上述技术方案的进一步描述：
16.所述抗氧化剂包括1mg/l葡萄籽、1.5mg/lα-硫辛酸或者0.5mg/l甘氨酸脱羟酶p蛋白抗体中的一种或者几种的混合物。
17.作为上述技术方案的进一步描述：
18.所述维生素包括1mg/l维生素a、5mg/l l-抗坏血酸和10mg/l生育酚。
19.作为上述技术方案的进一步描述：
20.所述抗生素包括庆大霉素或者卡那霉素和两性霉素b或者曲古霉素的混合物。
21.作为上述技术方案的进一步描述：
22.所述微量元素包括20mg/l硫酸铜、15mg/l氯化镁、15mg/l硫酸锌和1μg/l亚硒酸钠。
23.作为上述技术方案的进一步描述：
24.所述人血白蛋白、人转铁蛋白、人胰岛素、纤连蛋白、表皮生长因子egf、成纤细胞生长因子fgf、血小板来源团增质因子pdgf、生长激素释放抑制因子srih、角化细胞生长因子kgf和肌层细胞修复因子hcgf为重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白、重组人胰岛素、重组人纤连蛋白、重组人表皮生长因子egf、重组人成纤细胞生长因子fgf、重组人血小板来源团增质因子pdgf、重组人生长激素释放抑制因子srih、重组人角化细胞生长因子kgf和重组人肌层细胞修复因子hcgf。
25.作为上述技术方案的进一步描述：
26.所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、脐血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或者胎盘间充质干细胞。
27.作为上述技术方案的进一步描述：
28.用于获得间充质干细胞及其外泌体的培养基的制备方法，包括以下步骤：
29.s1、将采用hbss溶液清洗后的含有间充质干细胞的组织剪碎，向剪碎后的组织中加入含有liberase酶的dmem/f12基础培养基，混匀后于37℃震荡消化；
30.s2、对步骤s1处理后的消化产物进行低温离心，离心后抛弃上清，得到沉淀物；
31.s3、将步骤s2得到的沉淀物用所述培养基进行重悬，得到细胞悬液，将细胞悬液置于培养皿中于37℃、饱和湿度、co2体积分数为5％的培养箱内培养2～6h，然后采用hbss溶液进行洗涤，洗去未贴壁的细胞，再向培养皿中加入权利要求1～8所述培养基进行培养；
32.s4、细胞在培养皿内长出，汇合度达到80％后，用胰酶或者胶原酶消化并收获细胞，以细胞密度8000个/cm2接种传代。
33.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
34.1、本发明中，间充质干细胞培养基成分确定，不含血清成分，质量可控，能够规模化生产，用其进行干细胞体外培养，干细胞能够正常生长，而且，本发明间充质干细胞培养基有利于干细胞的分裂增殖，极大地提高干细胞扩增速率，缩短干细胞的培养时间，同时，
采用本发明的培养基对干细胞进行多次传代次后，干细胞依然能够保持其原有的生物学特性和多向分化潜能。
35.2、本发明中，经过大量的研究筛选到了这些既快速扩增干细胞而又不影响其分化潜能的细胞生长因子，并对5种促生长因子进行配比，它们联合作用，能够促进干细胞分裂增殖，提高干细胞扩增速度，缩短干细胞培养时间，同时还能抑制干细胞分化但不影响干细胞的分化潜能，有利于干细胞的快速扩增，这些因子是天然存在的调节分子，能与细胞表面上的受体结合，来改变细胞的生化活性和生长，以及调节细胞的增殖速率，来影响细胞分化，从而刺激细胞和组织功能。
36.3、本发明中，首先，培养基中重组干扰素γ和细胞松弛素d的加入，使得外泌体的分泌量得到明显提高，其次，培养基中加入高浓度的钾盐、果糖二磷酸钠和组胺二盐酸盐，可以促使间充质干细胞如处于一个损伤组织环境中，并且高浓度的钾盐使得间充质干细胞以为外围已经很多细胞死亡，引起或激活干细胞的修复机制，促使干细胞自身增值加快，并大量分泌外泌体，从而使得外泌体的产量得到提高，实现利用间充质干细胞获取外泌体的大规模生产的目的。
具体实施方式
37.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
38.实施例一
39.本发明提供一种技术方案：用于获得间充质干细胞及其外泌体的培养基，以dmem/f12为基础培养基添加如下成分：10～22g/ml血清替代物、20～55ng/ml促生长因子、5～10ng/ml肌层细胞修复因子hcgf、5～16mm抗衰老因子、缓冲剂、0.5～3mg/l抗氧化剂、1～20mg/l维生素、抗生素、5～65mg/l微量元素、1～16μg/ml保护剂，缓冲剂与dmem/f12基础培养基的体积比为1％，抗生素与dmem/f12基础培养基的体积比为2％；
40.血清替代物包括10～20g/l人血白蛋白、5～20mg/l人转铁蛋白、1～10mg/l人胰岛素、1～5mg/l纤连蛋白和5～30μg/ml胆固醇；
41.促生长因子包括5～10ng/ml表皮生长因子egf、5～10ng/ml成纤细胞生长因子fgf、5～10ng/ml血小板来源团增质因子pdgf、5～10ng/ml生长激素释放抑制因子srih、5～10ng/ml角化细胞生长因子kgf；
42.其中，人血白蛋白、人转铁蛋白、人胰岛素、纤连蛋白、表皮生长因子egf、成纤细胞生长因子fgf、血小板来源团增质因子pdgf、生长激素释放抑制因子srih、角化细胞生长因子kgf和肌层细胞修复因子hcgf为重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白、重组人胰岛素、重组人纤连蛋白、重组人表皮生长因子egf、重组人成纤细胞生长因子fgf、重组人血小板来源团增质因子pdgf、重组人生长激素释放抑制因子srih、重组人角化细胞生长因子kgf和重组人肌层细胞修复因子hcgf；
43.具体的，重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白、重组人胰岛素、重组人纤连蛋白等成分能够在无血清环境中为间充质干细胞提供附着支撑，维持间充质干细胞的生长形态，增
强间充质干细胞对体外营养物质的反应，为间充质干细胞提供优良的成长环境；
44.抗衰老因子包括5～10mm烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性酶sirt1、1～3mm蛋白激酶b或者1～3mm 5
’‑
溴脱氧腺苷中的一种或者几种的混合物；
45.缓冲剂包括碳酸氢钠或者n-取代的3-氨基-2-羟基丙磺酸的衍生物中的一种；
46.抗氧化剂包括1mg/l葡萄籽、1.5mg/lα-硫辛酸或者0.5mg/l甘氨酸脱羟酶p蛋白抗体中的一种或者几种的混合物；
47.维生素包括1mg/l维生素a、5mg/l l-抗坏血酸和10mg/l生育酚；
48.抗生素包括庆大霉素或者卡那霉素和两性霉素b或者曲古霉素的混合物；
49.微量元素包括20mg/l硫酸铜、15mg/l氯化镁、15mg/l硫酸锌和1μg/l亚硒酸钠；
50.缓冲剂、抗氧化剂、维生素、抗生素和微量元素能够为干细胞生长提供细胞生长所需的基础营养物质，维持细胞生长环境，维持细胞活性；
51.保护剂为1μg/ml乙醇胺和15μg/ml聚乙烯吡咯烷酮的混合物，保护剂对于细胞冷冻保存时，保护细胞免受冷冻损伤；
52.间充质干细胞为脐带间充质干细胞、脐血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或者胎盘间充质干细胞。
53.用于获得间充质干细胞及其外泌体的培养基的制备方法，包括以下步骤：
54.s1、将采用hbss溶液清洗后的含有间充质干细胞的组织剪碎，向剪碎后的组织中加入含有liberase酶的dmem/f12基础培养基，混匀后于37℃震荡消化；
55.s2、对步骤s1处理后的消化产物进行低温离心，离心后抛弃上清，得到沉淀物；
56.s3、将步骤s2得到的沉淀物对培养基进行重悬，得到细胞悬液，将细胞悬液置于培养皿中于37℃、饱和湿度、co2体积分数为5％的培养箱内培养2～6h，然后采用hbss溶液进行洗涤，洗去未贴壁的细胞，再向培养皿中加入权利要求1～8培养基进行培养；
57.s4、细胞在培养皿内长出，汇合度达到80％后，用胰酶或者胶原酶消化并收获细胞，以细胞密度8000个/cm2接种传代。
58.按照以下表1中实施例1-7的培养基成分对间质干细胞进行细胞培养，以细胞密度8000个/cm2接种传代培养至p10代，显微镜下观察细胞形态，结果如表2所示：
59.表1不同培养基成分表
[0060][0061]
表2实施例1-6细胞形态结论
[0062][0063]
通过表1和表2可以看出：(1)促生长因子是获得间质干细胞的重要组成因素，缺少促生长因子的培养基，无法获得间质干细胞；(2)肌层细胞修复因子有利于细胞轮廓更加清晰；(3)抗衰老因子具有延缓细胞衰老的作用；(4)抗氧化剂有利于促进细胞增生；(5)抗生素具有避免细胞培养过程中受真菌或者细菌污染的作用；
[0064]
本发明的间充质干细胞培养基成分确定，不含血清成分，质量可控，能够规模化生产，用其进行干细胞体外培养，干细胞能够正常生长，而且，本发明间充质干细胞培养基有利于干细胞的分裂增殖，极大地提高干细胞扩增速率，缩短干细胞的培养时间，同时，采用本发明的培养基对干细胞进行多次传代次后，干细胞依然能够保持其原有的生物学特性和多向分化潜能。
[0065]
按照表3，对于实施例1中培养基中促生长因子对细胞生长速度的影响做进一步的对比实验，实验结果见表4：
[0066]
表3基于实施例1的不同实施例11-16中促生长因子成分添加表
[0067][0068]
表4实施例11-16细胞密度数据表
[0069][0070]
通过表2可以看出，促生长因子具有促进细胞生长的作用，通过表3和表4可以看出，不同促生长因子对于促进细胞生长的作用程度不同，本发明中，经过大量的研究筛选到了这些既快速扩增干细胞而又不影响其分化潜能的细胞生长因子，并对5种促生长因子进
行配比，它们联合作用，能够促进干细胞分裂增殖，提高干细胞扩增速度，缩短干细胞培养时间，同时还能抑制干细胞分化但不影响干细胞的分化潜能，有利于干细胞的快速扩增，这些因子是天然存在的调节分子，能与细胞表面上的受体结合，来改变细胞的生化活性和生长，以及调节细胞的增殖速率，来影响细胞分化，从而刺激细胞和组织功能。
[0071]
具体的，以dmem/f12为基础培养基添加的成分还包括重组干扰素γ10～50μg/l、细胞松弛素d 0.5～2.0μg/ml和600～1000μg/ml无机盐，无机盐包括400～600μg/ml的钾盐、0.6～0.9μg/ml的果糖二磷酸钠和200～300μg/ml的组胺二盐酸盐，钾盐为氯化钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的一种或者几种的混合物，间充质干细胞外泌体的制备方法为：按照步骤s1-s3对间充质干细胞进行培养，培养48h后，离心，取上清液，上清液中含有间充质干细胞外泌体。
[0072]
按照表5，对实施例1中培养基中的无机盐：钾盐、果糖二磷酸钠和组胺二盐酸盐对培养上清中外泌体含量进行检测，检测结果如以下表6所示：
[0073]
表5基于实施例1的不同实施例111-115中无机盐成分添加表
[0074][0075]
表6实施例111-115培养基上清液中外泌体含量
[0076]
实施例培养基上清液中外泌体含量(％)实施例11180实施例11235实施例11340实施例11445实施例11538
[0077]
通过表5和表6可以看出，加入高浓度的钾盐、果糖二磷酸钠和组胺二盐酸盐，可以促使间充质干细胞如处于一个损伤组织环境中，并且高浓度的钾盐使得间充质干细胞以为外围已经很多细胞死亡，引起或激活干细胞的修复机制，促使干细胞自身增值加快，并大量分泌外泌体，从而有利于获得高浓度的具有修复作用的间充质干细胞外泌体的培养基上清液。
[0078]
按照表7，通过外泌体蛋白质bca检测方法，对实施例1中培养基中的重组干扰素γ和细胞松弛素d对于单位体积内间充质干细胞获得得外泌体蛋白量进行检测，检测结果如以下表8所示：
[0079]
表7基于实施例1的不同实施例116-117中重组干扰素γ和细胞松弛素d添加成分表
[0080][0081]
表8实施例116-119培养基中单位体积的外泌体蛋白量
[0082]
实施例外泌体蛋白量(mg)实施例1166.88实施例1173.45实施例1184.24实施例1195.06
[0083]
通过表7和表8可以看出，培养基中重组干扰素γ和细胞松弛素d的加入，使得外泌体的分泌量得到明显提高，配合无机盐给培养基提供的损伤组织环境，从而使得外泌体的产量得到提高，实现利用间充质干细胞获取外泌体的大规模生产的目的。
[0084]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。