一株乳杆菌IMAU80584、发酵菌剂及其应用

一株乳杆菌imau80584、发酵菌剂及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株乳杆菌imau80584、发酵菌剂及其应用。


背景技术：

2.益生菌又称微生态调节剂、活菌制剂，是指能够促进宿主肠道菌群生态平衡，对宿主起有益作用的活的微生物制剂。人体肠道内存在大量微生物，分为有益菌、有害菌和中性菌。正常情况下，肠道菌群处于平衡状态，相互依赖又相互制约，与人体之间互利共存。肠道菌群失调会导致腹泻和感染等一系列生物功能紊乱。
3.大肠杆菌是革兰氏阴性短杆菌，在正常条件下是人和动物肠道的正常菌群，周生鞭毛，能运动，无芽孢。但有少部分特殊类型的大肠杆菌具有相当强的毒力，如肠产毒性大肠杆菌(etec)，肠出血性大肠杆菌(ehec)，肠致病性大肠杆菌(epec)等，一旦感染，尤其是对婴儿和幼畜(禽)，将引起严重的腹泻和败血症，甚至死亡，如人体感染ehec后，会发生严重的痉挛性腹痛和反复发作的出血性腹泻，同时伴有发热、呕吐等表现，某些严重感染者，肾脏受到损伤，易发生急性肾功能衰竭甚至死亡。
4.乳杆菌的产酸特性是筛选发酵乳品用发酵剂的重要特性。用于酸性奶油、发酵稀奶油、发酵奶制品和类似产品的发酵剂要求具有良好的产酸特性。但目前酸性制品多采用嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，但该复合菌种不耐受胃液、肠液和胆汁，在肠道中很难定植，存活率极低，很难发挥其益生功效。因此，筛序具有高效杀菌、产酸的乳杆菌具有十分重要的研究意义和价值。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一株乳杆菌imau80584，具有优异的产酸特性，有效抑制了致病细菌。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
7.本发明提供了一株乳杆菌imau80584，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc 1.2566。
8.优选地，所述乳杆菌imau80584的生长特性：生长温度为10～45℃，ph值为3.5～9.5，nacl溶液质量体积分数为0～6％。
9.优选地，所述乳杆菌imau80584的发酵底物为l-阿拉伯糖、d-核糖、 d-木糖、七叶灵柠檬酸铁、d-麦芽糖、d-蔗糖和d-松三糖中的一种或多种。
10.优选地，所述乳杆菌imau80584中的表达酶为白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、萘酚-as-bi-磷酸水解酶、β-半乳糖甙酶、β-糖醛酸甙酶和α-葡萄糖甙酶。
11.本发明提供了一种发酵菌剂，包括上述的乳杆菌imau80584。
12.优选地，所述乳杆菌imau80584的有效活菌浓度为 1
×
106～
×
108cfu/ml。
13.本发明还提供了一种上述任意一项乳杆菌imau80584或上述任意一项发酵菌剂在
制备发酵乳中的应用。
14.优选地，所述发酵乳包括发酵豆乳或牛乳。
15.本发明还提供了上述任意一项乳杆菌imau80584在制备防治致病细菌的产品中的应用。
16.优选地，所述致病细菌包括大肠杆菌。
17.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
18.本发明所述的乳杆菌imau80584，从甘肃省夏河县桑科乡赛池村的传统自然发酵乳制品酸牦牛奶中分离获得，经试验证明，本发明的乳杆菌 imau80584具有优异的产酸特性和良好的酸耐受性，发酵能力强，该乳杆菌imau80584对大肠杆菌具有很强的抑制作用，本发明筛选得到的乳杆菌 imau80584作为一株益生菌，在防治致病细菌和发酵食品等领域具有广泛的应用前景和巨大的经济价值。
19.保藏信息：
20.本发明提供的乳杆菌(lactobacillus sp.)imau80584，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称为gdmcc)，保藏地址：中国广州市先烈中路一百号省微生物所实验楼五楼，邮编510070，保藏编号：gdmcc 1.2566，保藏时间为2021年4月10日。
附图说明
21.图1为实施例1中乳杆菌(lactobacillus sp.)imau80584的菌落形态图；
22.图2为实施例1中乳杆菌(lactobacillus sp.)imau80584的革兰氏染色后镜检图；
23.图3为实施例1中乳杆菌(lactobacillus sp.)imau80584的菌体tem 电镜形态图；
24.图4为实施例1中乳杆菌(lactobacillus sp.)imau80584 api 50chl 碳水化合物的代谢检测结果；
25.图5为实施例1中乳杆菌(lactobacillus sp.)imau80584api-zym酶活检测结果；
26.图6为实施例1中乳杆菌(lactobacillus sp.)imau80584与近缘种内所有模式菌株基于两个管家基因(rpoa和phes)序列的系统发育树；
27.图7为实施例1中乳杆菌(lactobacillus sp.)imau80584与近缘种内所有模式菌株基于全基因组核心基因的系统发育树；
28.图8为实施例4中乳杆菌(lactobacillus sp.)imau80584混合菌液对大肠杆菌的牛津杯抑菌效果；
29.图9为实施例4中乳杆菌(lactobacillus sp.)imau80584无菌上清液对大肠杆菌的牛津杯抑菌效果。
具体实施方式
30.本发明提供了一株乳杆菌imau80584，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc 1.2566。
31.在本发明中，该乳杆菌分类命名为乳杆菌(lactobacillus sp.) imau80584，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称为gdmcc)，保藏地址：中国广州市先烈中路一百号省微生物所实验楼五楼，邮编510070，保藏编号：gdmcc 1.2566，保藏时间为2021年4月10日。
32.本发明所提供的乳杆菌imau80584来源于甘肃省夏河县桑科乡赛池村的传统自然
发酵乳制品酸牦牛奶，所述乳杆菌imau80584具有如下微生物学特征：
33.(1)菌落特征：单菌落直径为1～2mm，颜色呈米色、不透明，菌落表面光滑扁平，边缘略粗糙。
34.(2)形态特征：菌体呈现短杆状，长1.67～1.91μm，宽0.67～0.83μm，单杆排列，无鞭毛，不运动，革兰氏染色阳性；
35.(3)生长特征：乳杆菌imau80584的最低生长温度为10℃，最高生长温度为45℃，最适生长温度为30～37℃；最高生长ph为9.5，最低生长ph 为3.5；在质量体积分数为0～6％nacl溶液下均能观察到生长，但在质量体积分数为0～5％nacl溶液下生长最佳。
36.在本发明中，所述乳杆菌imau80584的发酵底物优选为l-阿拉伯糖、 d-核糖、d-木糖、七叶灵柠檬酸铁、d-麦芽糖、d-蔗糖和d-松三糖中的一种或多种。
37.在本发明中，所述乳杆菌imau80584中的表达酶优选为白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、萘酚-as-bi-磷酸水解酶、β-半乳糖甙酶、β-糖醛酸甙酶和α-葡萄糖甙酶。
38.本发明提供了一种发酵菌剂，包括上述的乳杆菌imau80584。
39.本发明中，所述乳杆菌imau80584的有效活菌浓度优选为 1
×
106～1
×
108cfu/ml，进一步优选为1
×
107cfu/ml。本发明的发酵菌剂还包括辅料，所述辅料在发酵菌剂中质量百分比为4～8％，所述辅料包括欧玉米淀粉、蔗糖、乳糖、谷氨酸钠、脱脂奶粉、水、甘油、麦芽糊精，大豆分离蛋白、抗坏血酸钠中的一种或多种。
40.本发明还提供了一种上述任意一项乳杆菌imau80584或上述任意一项发酵菌剂在制备发酵乳中的应用。
41.在本发明中，所述发酵乳优选地包括发酵豆乳或牛乳，进一步优选为发酵豆乳，本发明的乳杆菌imau80584具有高效的产酸能力，同时具有耐酸特性，对乳品业具有广阔的应用前景。
42.本发明还提供了上述任意一项乳杆菌imau80584在制备防治致病细菌的产品中的应用。
43.在本发明中，所述致病细菌优选地包括大肠杆菌。本发明的乳杆菌 imau80584对大肠杆菌具有很强的抑制作用，可改善机体内的微生态环境、提高免疫力。
44.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
45.实施例1
46.乳杆菌(lactobacillus sp.)imau80584的分离与鉴定
47.一、乳杆菌imau80584的分离
48.乳杆菌(lactobacillus sp.)imau80584分离自甘肃省夏河县桑科乡赛池村的传统自然发酵乳制品酸牦牛奶中，具体分离方法如下：
49.将酸牦牛奶样品进行10倍稀释，选择10-5
，10-6
和10-7
稀释液进行涂布。 37℃厌氧培养48h后，选择形态不同的菌落进行划线纯化，挑取单个菌落接种到mrs肉汤培养基中，37℃培养24h，将所有革兰氏染色阳性，过氧化氢酶阴性的菌株传三代培养，用脱脂乳冻菌，-80℃保藏，最终筛选出乳杆菌imau80584。
50.二、乳杆菌imau80584的菌落特征、形态特征、生理生化特征、酶活性检测的鉴定
51.将乳杆菌(lactobacillus sp.)imau80584接种至到mrs肉汤液体培养基，37℃培
养24h，继代培养3代，恢复菌株活力，对菌液进行10倍比稀释，得到10-1
～10-8
稀释梯度，分别吸取200μl 10-6
、10-7
、10-8
梯度稀释液，均匀涂布于mrs琼脂培养基平皿内，37℃厌氧培养48h。
52.所述mrs培养基的由如下重量组分组成：蛋白胨(10g)、牛肉膏(10g)、酵母粉(5g)、葡萄糖(20g)、吐温-80(1g)、磷酸氢二钾(2g)、醋酸钠(5g)、柠檬酸钠(2g)、七水硫酸镁(200mg)、五水硫酸锰(54mg)；将上述重量组分于121℃、15min灭菌，即得mrs培养基。
53.1)对乳杆菌imau80584在培养皿上的菌落形态，对形成菌落的大小、颜色、透明度、菌落表面状态以及菌落边缘状态进行观察与记录。
54.结果表明，该乳杆菌imua80584所得单菌落直径1～2mm，颜色呈米色、不透明，菌落表面光滑扁平，边缘略粗糙(见图1)。
55.2)对乳杆菌imua80584进行革兰氏染色，采用bx53光学显微镜观察菌体形态、采用透射电子显微镜观察该菌株阴性染色的细胞形态、使用3％ (v/v)h2o2溶液观察气泡产生来检查过氧化氢酶活性和在半固体培养基 (0.3％)中测试了细胞的运动性，其中半固体培养基为mrs琼脂半固体培养基。
56.结果表明，乳杆菌imua80584为革兰氏染色阳性，呈现短杆状，单杆排列，无鞭毛，不运动(见图2)；单个菌体细胞呈杆状，长1.67～1.91μm，宽0.67～0.83μm，为单杆状排列(见图3)；乳杆菌imua80584不产生气泡，为过氧化氢阴性，且无运动性。
57.3)生理生化特征的鉴定：
58.①
采用三线法，将乳杆菌imau80584的种子培养液在mrs琼脂培养基上划线，37℃培养48h，按照说明书，制备具有该过程中所需适当光密度的原料为悬浮液中的细胞接种物；其中，所述的mrs琼脂培养基(蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵[(nh4)2hc6h5o7]2.0g，葡萄糖(c6h
12
o6·
h2o)20.0g，吐温801.0ml，乙酸钠(ch3coona
·
3h2o)5.0g，磷酸氢二钾(k2hpo4·
3h2o)2.0g，硫酸镁(mgso4·
7h2o)0.50g，硫酸锰(mnso4·
h2o)0.25g，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml，ph 6.2～6.6)。
[0059]
②
将制备好的细胞接种物接种到生化鉴定管中，接种完成后37℃需氧培养24h和48h，分别记录反应结果，阳性和阴性测试根据原料药系统指示的颜色代码进行评估。
[0060]
表1乳杆菌imau80584与近缘乳杆菌api50 chl碳水化合物代谢检测结果
[0061]
[0062]
[0063][0064]
注：1.
“‑”
为阴性，“+”为阳性；2.a：乳杆菌imau80584，b： lentilactobacillus rapi dsm 19907t，c：lentilactobacillus kisonensis dsm19906t，d：lentilactobacillus diolivorans dsm 14421t。
[0065]
由表1和图4可知，乳杆菌imau80584能够利用l-阿拉伯糖、d-核糖、 d-木糖、七叶灵柠檬酸铁、d-麦芽糖、d-蔗糖和d-松三糖作为发酵底物。
[0066]
4)乳杆菌imau80584 api-zym酶活检测
[0067]
a、采用三线法，将乳杆菌imau80584的种子培养液在mrs琼脂培养基上划线，37℃培养48h，按照说明书，制备具有该过程中所需适当光密度的原料为悬浮液中的细胞接种物，所述mrs琼脂培养基(蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵[(nh4)2hc6h5o7]2.0g，葡萄糖 (c6h
12
o6·
h2o)20.0g，吐温801.0ml，乙酸钠(ch3coona
·
3h2o)5.0g，磷酸氢二钾(k2hpo4·
3h2o)2.0g，硫酸镁(mgso4·
7h2o)0.50g，硫酸锰(mnso4·
h2o)0.25g，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml，ph 6.2～6.6)。
[0068]
b、将制备好的细胞接种物接种到生化鉴定管中，接种完成后37℃需氧培养4h后(培养过程中试验条不可置于强光下)，加入zyma和zymb 各一滴，等待5分钟后观察试验条颜色变化，阳性和阴性测试根据原料药系统指示的颜色代码进行评估。
[0069]
结果如表2和图5可知，乳杆菌imau80584能够表达白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、萘酚-as-bi-磷酸水解酶、β-半乳糖甙酶、β-糖醛酸甙酶和α
‑ꢀ
葡萄糖甙酶。
[0070]
表2乳杆菌imau80584与近源乳杆菌api20 zym生化反应结果
rrna序列进行比对，imua80584菌株与lentilactobacillus 属的lentilactobacillus rapi dsm 19907t的16s rrna序列的同源性最高，与其他菌株的同源性较低，确定菌种类别为lentilactobacillus属。
[0076]
然后，从基因组序列获得了两个管家基因phes和rpoa的序列(分别编码苯丙氨酰-trna合酶α亚基和rna聚合酶α亚基)，使用邻接法和最大似然法构建乳杆菌imau80584和近缘种内所有模式菌株的两个管家基因phes 和rpoa的系统发育树(见图6)，使用mega 7.0软件基于1000个重复进行分析。
[0077]
综上，根据16s rrna和管家基因序列分析和系统发育树的构建表明，菌株imau80584是lentilactobacillus属中疑似新种。
[0078]
四、乳杆菌imau80584的的全基因组测序鉴定
[0079]
首先，将乳杆菌imau80584接种到mrs肉汤培养基中，37℃培养24h，继代培养3代获得该菌株的纯培养物后，送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行全基因组测序,基因组测序平台为illuminanovaseq6000，构建illuminape文库，对获得菌株的基因组测序数据进行质量评估，过滤后，使用软件包soapdenovo(v2.04)拼接和组装高质量读数，并选择适当的kmer值拼接和组装，并对过滤后的数据进行单碱基校正，以基因组大小、支架数量、 n50长度、n90长度和gc含量为指标，评价组装结果。
[0080]
然后，结合ncbi已公开lentilactobacillus属内所有模式菌株的88个核心基因构建了系统发育树，发现乳杆菌(lactobacillus sp.)imau80584和 lentilactobacillus rapi dsm 19907
t
聚成一簇，但独立形成一个亚分支(图7)，表明菌株imau80584为lentilactobacillus属内的新种。
[0081]
结果表明，乳杆菌imau80584与lentilactobacillus rapi dsm 19907
t
的 ani(平均核苷酸同一性)和ggdc(基因组间距离)值分别为93.14和52.8，均低于界定一个物种的阈值；由图7可知，乳杆菌imau80584和lentilactobacillus rapi dsm 19907
t
聚成一簇，但独立形成一个亚分支，表明菌株imau80584为lentilactobacillus属内的新种。
[0082]
实施例2
[0083]
乳杆菌imau80584生长特性的检测
[0084]
将乳杆菌imau80584接种到灭菌mrs肉汤培养基中，37℃厌氧培养 24h后取出备用。
[0085]
一、ph耐受性试验检测
[0086]
按2％的接种量将乳杆菌imau80584的种子培养液分别接种到ph为 2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5的mrs肉汤培养基中，37℃厌氧培养24h，测定0h和24h的吸光值(od600)，根据吸光值的增长量判断菌株生长情况。
[0087]
表3乳杆菌imau80584的ph耐受性
[0088][0089]
注：-：不长；+生长；w-弱
[0090]
表3结果表明，乳杆菌imau80584在ph为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5培养时生长较好，在ph为3.5和9.5培养时生长缓慢，在ph为2.5不生长。
[0091]
二、nacl耐受性试验检测
[0092]
按2％的接种量将乳杆菌imau80584的种子培养液分别接种到nacl浓度为2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％的mrs肉汤培养基中， 37℃厌氧培养24h，测定0h和24h的吸光值(od600)，根据吸光值的增长量判断菌株生长情况。
[0093]
表4乳杆菌imau80584的nacl耐受性
[0094][0095]
注：-：不长；+生长；w-弱
[0096]
表4结果显示，乳杆菌imau80584在含6％nacl的mrs肉汤培养基中生长较弱，在超过6％nacl的mrs肉汤培养基中基本不生长。
[0097]
三、温度耐受性试验检测
[0098]
按2％的接种量将乳杆菌imau80584的种子培养液分别接种到mrs肉汤培养基中，分别在4℃、10℃、20℃、30℃、37℃和45℃条件下厌氧培养24h。测定0h和24h的吸光值(od600)，根据吸光值的变化量判断菌株生长情况。
[0099]
表5乳杆菌imau80584的温度耐受性
[0100][0101]
注：-：不长；+生长；w-弱
[0102]
表5结果显示，乳杆菌imau80584在4℃培养时不生长，在10～45℃时生长。
[0103]
实施例3
[0104]
乳杆菌imau80584的发酵能力测定
[0105]
一、豆乳发酵
[0106]
1)、豆乳发酵液的制备方法
[0107]
用蛋白含量42％的豆粉配置成蛋白质含量5％的豆乳发酵液，添加6％的蔗糖，选择100ml的锥形瓶对豆乳发酵液进行均匀分装，每个锥形瓶中分装40ml，密封好后，121℃灭菌15min，急速冷却至40℃，备用。
[0108]
2)、乳杆菌imau80584发酵豆乳的方法
[0109]
将乳杆菌imau80584的种子培养液在mrs肉汤培养基中培养过夜，以豆乳体积的8％的接种量接种到上述制备好的豆乳发酵液中，37℃发酵24h。
[0110]
3)、乳杆菌imau80584发酵豆乳的产酸能力评价
[0111]
接种后，分别在0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h测定发酵不同时间豆乳的ph值。
[0112]
结果发现，发酵初始发酵豆乳的ph值为6.4，随着发酵时间的延长，发酵豆乳的ph逐渐降低，发酵时间在15h，发酵豆乳的ph值达到最低4.7，此后趋于稳定。
[0113]
二、牛乳发酵
[0114]
1)、牛乳发酵液的制备方法
[0115]
用脱脂乳粉配置成89％的牛乳发酵液，添加6％的蔗糖，选择100ml的锥形瓶对牛
乳发酵液进行均匀分装，每个锥形瓶中分装40ml，密封好后， 121℃灭菌15min，急速冷却至40℃，备用。
[0116]
2)、乳杆菌imau80584发酵牛乳的方法
[0117]
将上述乳杆菌imau80584的种子培养液在mrs肉汤培养基中培养过夜，以牛乳体积的8％的接种量接种到上述制备好的牛乳发酵液中，37℃发酵24h。
[0118]
3)、乳杆菌imau80584发酵牛乳的产酸能力评价
[0119]
接种后，分别在0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h测定发酵不同时间牛乳的ph值。
[0120]
结果发现，发酵初始发酵牛乳的ph值为6.1，随着发酵时间的延长，发酵牛乳的ph逐渐降低，发酵时间在15h，发酵牛乳的ph值达到最低4.6，此后趋于稳定。
[0121]
实施例4
[0122]
乳杆菌imau80584的抑菌能力检测
[0123]
病原指示菌选择大肠杆菌(escherichia coli)。
[0124]
实验方法依照国标gb/t 39101-2020进行，具体操作如下：
[0125]
1)、取乳杆菌imau80584的种子液以2％接种量接种于液体培养基中， 37℃培养24h后，取500微升的菌液，离心后取上清液，上清液使用0.22μm 微孔滤膜进行滤菌，剩余的菌体沉淀用同体积的无菌生理盐水混匀备用。
[0126]
2)、采用牛津杯抑菌法测定乳杆菌imau80584的抑菌活性
[0127]
将指示菌接种于5.0mlnb培养基的试管，37℃继代培养三代作为培养液，将配制的na(营养琼脂)培养基加热溶解，冷却至45℃～50℃，将制备的指示菌菌悬液稀释到10-4
梯度，按照7％的添加量加入na培养基中，充分混合均匀，倾倒入灭菌平皿，轻轻摇动平皿使之均匀铺平，待其凝固后备用，在含有指示菌的检测平板中等距离安放3个牛津杯，量取100μl乳杆菌imau80584混合菌液和无菌上清液，缓缓加入牛津杯中，每个处理重复 3次，一个平板3个平行。
[0128]
4、加入混合菌液的平板放入37℃恒温培养箱中，正置培养至抑菌圈清晰。采用抑菌圈测量仪测定抑菌圈直径，每个抑菌圈沿不同方向测量3次，并记录平均值。
[0129]
5、加入无菌上清液的平板移入4℃冰箱中预扩散8h，取出平板后放入 37℃恒温培养箱中，正置培养至抑菌圈清晰，采用抑菌圈测量仪测定抑菌圈直径，每个抑菌圈沿不同方向测量3次，并记录平均值，结果见表6。
[0130]
表6乳杆菌imau80584的抑菌结果
[0131]
样品抑菌圈大小原液11～12mm上清液14～15mm
[0132]
从图8、图9和表6的抑菌结果可以看出，本发明乳杆菌imau80584 菌株对大肠杆菌有较明显的抑菌作用。因此，本发明的乳杆菌imau80584 在制备防治病原细菌的产品有很好的开发潜力。
[0133]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。