一种耐高温漆酶及基因与菌株和应用

1.本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及一种耐高温漆酶及编码基因、重组表达载体、重组表达菌株，以及它们的制备方法和应用。该酶可用于黄曲霉毒素b1的降解、靛蓝等染料脱色等多个工业领域。


背景技术：

2.漆酶是一种多酚氧化酶，具有较强的氧化能力和广泛的底物。因此，漆酶有着非常广泛的应用。例如，在食品中，漆酶可以用来降解食品或饲料中的黄曲霉毒素，从而使食品脱毒并延长其储存时间。还可用于水解啤酒中的不良酚类，改善口感，延长储存时间；在纺织领域，它可以用来降解有机染料，其产品是清洁的水；在造纸领域，可用于木质素脱色和废水处理；在生物传感器领域，作为一种生物传感器，它可以检测吗啡、可待因和儿茶酚胺，判断果汁中的苯酚或其他酶，以及植物中的黄酮类化合物。
3.黄曲霉毒素b1是玉米、花生和其他谷物中常见的真菌毒素，是由黄曲霉和寄生曲霉产生的有毒次级代谢产物。它具有很强的毒性、致癌性和致畸性，污染多种经济作物，造成食品、饲料等安全问题，会导致肝癌、生长迟缓、生殖系统损害等疾病，对人畜健康构成极大威胁。由于粮食和饲料中真菌毒素的污染，迫切需要开发一种多功能酶来降解包括黄曲霉毒素b1在内的多种真菌毒素。
4.目前的脱毒方法主要包括物理、化学和生物方法。物理方法包括辐射法、热处理法和吸附法。辐射法本身就存在放射性污染的问题，被辐射的粮食产品也存在一些安全问题。热处理过程中的高温会破坏谷物的品质和风味，脱毒效果不完全。吸附法存在吸附剂用量大、吸附毒素种类有限等问题。化学方法采用碱处理和氧化处理来破坏分子结构以达到脱毒的目的，但这种方法也会破坏谷物的营养成分，并引入新的化学试剂。降解产物的安全性尚不清楚。生物降解是指利用微生物或其酶和制剂通过生物催化进行脱毒。脱毒条件温和有效。目前，大量的研究主要集中在微生物及其代谢产物降解的毒素的单一脱毒上。脱毒方法普遍性差，针对性强，整体性差。也有多种益生菌同时降解两种毒素的方法，但这种方法效率低，实验复杂，适用范围窄，不适用于天然有毒食品和谷物。
5.漆酶的工业应用不仅要求漆酶具有高活性，而且要求漆酶具有良好的热稳定性。例如，在纸浆漂洗中，纸浆漂洗和干燥需要高温。普通的不耐热漆酶在高温下容易失去活性。在服装制造领域，漆酶用于牛仔裤脱色过程需要高温环境。纸浆在高温环境下的脱色效率也有待提高。因此，耐高温漆酶具有广阔的工业应用前景。但现阶段漆酶的工业化应用亟待解决，包括但不限于以下几点：1)缺乏耐高温漆酶品种；2)活性和酶产量有限；3)经济成本高。
6.对于以上的问题，采用基因工程的方法改造漆酶是一个非常有效的方法，这种方法不仅能改良酶的特性，获得耐高温的漆酶，而且可以提高酶的产量，同时经济成本大大降低，满足工业化应用的要求。


技术实现要素：

7.针对目前如上所述漆酶的缺陷或不足进行改进，本发明的目的在于提供一种耐高温漆酶cotagold及其编码基因cotagold与应用，其中通过对关键的来自芽孢杆菌的原始漆酶cota其氨基酸序列、用于编码该漆酶基因cota的序列等进行改进，克服其耐热性不佳、产量偏低等问题。本发明可以实现该漆酶cotagold在工业中的应用，能够得到具有很好应用前景的漆酶的生产菌种，非常利于漆酶cotagold的推广应用。本发明得到的漆酶cotagold可应用于各个领域，是一种新的能够广泛应用于染料脱色、造纸、食品、饲料、纺织等工业领域的耐高温漆酶，尤其可以应用于黄曲霉毒素的降解和靛蓝、木质素等染料的脱色，大大降低了生产所需成本，提高了效率。
8.本发明的第一方面提供一种耐高温漆酶cotagold，所述漆酶cotagold的氨基酸序列如seq id no：1所示。
9.本发明的第二方面提供获取所述的漆酶cotagold的方法，包括对野生型漆酶cota进行改造：将113位的天冬氨酸d突变为脯氨酸p，将187位天冬氨酸d突变为甘氨酸g，将255位的异亮氨酸i突变为亮氨酸l。
10.本发明的第三方面提供一种耐高温漆酶基因cotagold，用于编码所述的漆酶，所述漆酶基因cotagold的碱基序列如seq id no：2所示。
11.通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，由于对原始漆酶cota其氨基酸序列、用于编码该漆酶基因cota的序列等进行改进，可有效解决现有漆酶耐热性不强、催化效率不高等问题。
12.本发明的第四方面提供一种重组表达载体，包括所述的漆酶基因cotagold。
13.本发明的第五方面提供所述的重组表达载体的构建方法，包括如下步骤：在所述的漆酶基因cotagold的两端分别引入限制性内切酶ndeⅰ和hindⅲ的酶切位点；将经ndeⅰ和hindⅲ双酶切的cotagold基因插入同样经ndeⅰ和hindⅲ双酶切的大肠杆菌表达载体pet21a，获得漆酶重组表达载体pet21a-cotagold。
14.本发明的第六方面提供一种重组表达菌株，包括所述的重组表达载体，所述重组表达菌株的宿主细胞为大肠杆菌。
15.根据本发明一种具体实施方式，所述重组表达菌株的制备方法包括如下步骤：用限制性内切酶bamhⅰ将重组表达载体pet21a-cotagold线性化；通过电转化的方式将线性化的重组表达载体pet21a-cotagold导入大肠杆菌中，并在含有氨苄霉素抗性的lb平板上筛选阳性克隆即获得重组表达菌株。
16.本发明的第七方面提供所述的重组表达菌株的制备方法，包括如下步骤：将漆酶重组表达载体导入宿主细胞中，获得重组表达菌株。
17.本发明的第八方面提供所述的耐高温漆酶的生产方法，培养所述的重组表达菌株，从培养物中获得漆酶。
18.具体包括以下步骤：
19.(1)以上述重组载体转化宿主细胞，获得重组菌株；
20.(2)发酵该重组菌株，获得表达的漆酶cotagold；
21.(3)收集并纯化所表达的漆酶cotagold。
22.根据本发明一种具体的实施方式，通过上述重组表达菌株制备漆酶的方法包括如
下步骤：挑取重组表达菌株单菌落接种至5ml lb液体培养基中，37℃，170rpm过夜培养作为种子液，再将2ml的种子液接到含0.1mg/ml的摇瓶中。培养条件为37℃，170rpm，培养2-3h，然后再加0.1mm iptg、1mm的铜离子，培养3h，进行离心收菌，置于-10℃冰箱保存。取发酵上清液测定漆酶的活性，利用bca法测定蛋白含量。
23.本发明的第九方面提供所述的漆酶的应用，将所述的漆酶与黄曲霉毒素b1接触，用于对其的降解。
24.本发明的第十方面提供所述的漆酶的另一种应用，将所述的漆酶与染料接触，优选的是应用于靛蓝降解。
25.本发明通过对关键的漆酶cota其氨基酸序列、用于编码该漆酶cota的基因cota序列进行改造，显著提高了其的耐高温特性和活性。在漆酶的制备过程中，其制备工艺简单且产量高，降低了漆酶的生产成本。所产生的漆酶耐高温特性突出，能用于黄曲霉毒素b1的降解，且对染料靛蓝降解能力强，可用于牛仔裤、纸浆等的漂洗。
26.本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
27.通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
28.图1为本发明实施例中野生型漆酶cota重组菌株和改造后漆酶cotagold重组菌株在摇瓶中的产漆酶情况和蛋白质分析的胶图。
29.图2为本发明实施例中耐高温漆酶cotagold和野生型漆酶cota在45-85℃处理5min后漆酶催化能力变化曲线。
30.图3为本发明实施例中耐高温漆酶cotagold和野生型漆酶cota在70℃对黄曲霉毒素降解率比对的曲线。
31.图4为本发明实施例中改造后漆酶cotagold分解靛蓝能力与野生型漆酶分解靛蓝能力的定性分析比较。
32.图5为本发明实施例中中耐高温漆酶cotagold和野生型漆酶cota在70℃对靛蓝降解率比对的曲线。
具体实施方式
33.下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
34.实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
35.实施例1
36.本实施例用于说明通过定点突变的方法将野生型漆酶cota改造成耐高温漆酶cotagold。具体改造过程包括：
37.通过对漆酶三维结构的分析，对野生型漆酶cota进行定点突变，共形成了3个突变位点(d113p、d187g、i255l)，使用pymol对突变位点进行分析。d113p(用脯氨酸替换天冬氨酸)后，能提高蛋白loop区的刚性，显著提高了蛋白的稳定性；d187g(用甘氨酸替换天冬氨
酸)，进行这个点突变是由于对蛋白二级结构的分析，发现此处的β转角过于刚性，导致折叠发生困难，影响蛋白的活性，突变后提高了区域的柔性；i255l，这项突变发生在蛋白的core pacing区域，能使得折叠内部的疏水相互作用提高，进而使得蛋白的稳定性和活性都得以提高。
38.所述定点突变技术为本领域常规的方法，其具体操作步骤为本领域技术人员公知。经改造后的漆酶cotagold的氨基酸序列如seq id no：1所示。野生型漆酶cota的氨基酸序列如seq id no：3所示。
39.实施例2
40.本实施例用于说明改造后的耐高温漆酶基因的序列特征。本实施例基于突变后的漆酶cotagold的氨基酸序列，重新设计了漆酶基因cotagold的核苷酸序列。具体包括采用高频率的密码子替代低频率的密码子；降低了基因编码的mrna的二级结构的复杂度和最小自由能。平衡基因中gc的含量及分布，移除基因中的重复序列和顺式作用元件。设计出了漆酶基因序列，通过人工合成的方法获得漆酶基因片段。
41.本实施例根据野生型漆酶cota的氨基酸序列，人工设计出一条全新的漆酶基因cota序列，并通过人工合成的方法获得所述漆酶基因片段。所述人工合成基因的技术为本领域常规的方法，其具体操作步骤为本领域技术人员公知。所述漆酶基因cotagold的碱基序列如seq id no：2所示，所述漆酶基因cota的碱基序列如seq id no：4所示。
42.实施例3
43.本实施例用于说明野生型漆酶cota和改造后的耐高温漆酶cotagold重组表达载体。
44.(1)在所设计的耐高温漆酶基因cotagold两端加上酶切位点nde i和hindⅲ，将该基因由nde i和hindⅲ酶切并收集酶切产物；将载体pet21a同时由nde i和hindⅲ酶切并收集酶切产物。其中，酶切体系为：20μl dna、1μl nde i、1μl hindⅲ、10μl的buffer，加水补齐至100μl体积，在37℃条件下酶切4小时。
45.(2)将上述漆酶基因cotagold的酶切产物和载体pet21a的酶切产物用t4 dna连接酶在16℃过夜连接。连接体系为：7μl的基因片段、1μl的pet21a片段、1μl的t4连接酶buffer、0.5μl的t4 dna连接酶、加水补齐至10μl。连接完成后得到重组表达载体pet21a-cotagold。
46.(3)采用上述方法构建野生型漆酶cota重组载体pet21a-cota。
47.本实施例构建了漆酶野生型漆酶基因cota、改造后的漆酶基因cotagold重组表达质粒。
48.实施例4
49.本实施例用于说明漆酶野生型漆酶cota和改造后的耐高温漆酶cotagold的重组菌株的获得及表达。
50.(1)将实施例3获得的重组表达载体pet21a-cotagold转化入大肠杆菌bl21(de3)中，电转化方法如下：(i)取1μl上述重组表达质粒线性化产物与90μl新鲜大肠杆菌感受态混合，放在冰盒上冰浴5min。(ii)打开电转仪，调节电击参数，电压1600v，电阻200ω，电容25μf。将冰浴的线性化产物与感受态细胞混合物转入冰上遇冷的电转杯进行电击。(iii)迅速向电转杯中加入1ml已在28℃预热的amp，将转入1.5ml无菌离心管中，静置于37℃培养箱
2小时。(iv)取100μl菌液涂布于含氨苄霉素抗性的lb平板，于37℃培养箱中静置培养3天。待长出单菌落后，即获得含cotagold基因的大肠杆菌重组菌株。
51.(2)按步骤(1)的方法构建漆酶野生型漆酶cota重组菌株。
52.(3)将上述重组菌株接种于5ml lb培养基中，在37℃恒温摇床内过夜培养。再接种至250ml lb培养基中，在37℃培养3小时，培养后转到16℃继续培养，并添加终浓度为0.1mm的iptg，1mm的cuso4诱导培养12-16h。接下来将培养后的菌液进行压力破碎，完成后再进行超声破碎。再将破碎后的菌液用低温冷冻离心机离心20min，8000r/min，收集一份作为总样。然后再进行ni-nta柱分离，将准备好的柱子移至50ml离心管中，盖紧离心管，用封口膜密封，再用摇架处理1h。然后将离心后的菌液加入到摇匀的柱子内，流出，收集ft。待样品流完后，再将lysis buffer倒至离心后装菌液的50ml离心管中，摇匀倒至柱子中流尽，重复三次。再在柱子内加入wash buffer流尽，收集wash样。再在柱子内加入elution buffer，流尽，收集流出样。然后收集蛋白质，每个蛋白质收集12管，每管1ml左右。并对收集到的12个样，进行考马斯亮蓝鉴定。然后将经过鉴定的样品，加入到超滤管中，5000r/min进行离心，离心至超滤管上部分只剩1.5ml左右，并对超滤管上部分和下部分分别进行考马斯亮蓝鉴定。最后对超滤后的样品进行透析处理。处理后即可分装。结果跑胶验证如图1。图1所示为野生型漆酶cota重组菌株和改造后漆酶cotagold重组菌株在摇瓶中的产漆酶情况和蛋白质分析的胶图。
53.(4)蛋白含量测定采用bca法，具体操作步骤如下：先配制bca工作液，配制方法是50体积的a液加上1体积的b液，充分混匀得到bca工作液。再绘制标准曲线，取0-20μl的蛋白质溶液加进反应体系，使得体系内蛋白质含量为0-200μg/ml，再在反应体系中添加200μl的bca工作液，在60℃的烘箱内反应30min，最后测试其a562的吸光度，绘制标准曲线。加设当体积的样品到96孔板的样品孔中，加水至20μl，再在反应体系中添加200μl的bca工作液，在60℃的烘箱内反应30min，最后测试其a562的吸光度，最后计算其蛋白质含量。
54.(5)漆酶活性的测定：在2ml ep管中加500μl ph 5.5的br buffer，加入10μl 0.1m abts，涡旋混匀，将实验组对照组都放在70℃金属浴上预热2分钟，然后在实验组中依次加入2μl纯化后的酶液，间隔时间相同，均为15s，然后在金属浴上反应5min，按照相同间隔时间依次加入500μl甲醇终止反应，涡旋混匀，对照组也加入500μl甲醇终止，涡旋混匀，将终止后的反应液取200μl加入96孔板中，在酶标仪上读od420的数值，根据实验组和对照组的od420数值计算其酶活。
55.其酶活计算公式为
56.δod：反应前后吸光度变化
57.ξ：36000m-1
·
cm-1
58.l：使用酶标仪测量，为0.58cm
59.t：时间单位：分钟
60.[e]：蛋白含量μg/ml
[0061]v酶
：酶的用量体积
[0062]v反应体系
：整个反应体系的体积
[0063]
依照本实施例所述的操作程序，本发明获得野生型漆酶cota和重新设计的漆酶cotagold重组菌株，并在摇瓶中进行了产酶发酵。
[0064]
实施例5
[0065]
本实施例用于对野生型漆酶cota和重新设计的漆酶cotagold的耐热性进行分析。
[0066]
(1)将漆酶野生型漆酶cota和优化后的漆酶cotagold分别置于45-85℃下保存30min，将处理后的样品进行酶活测定，设酶活最高的温度的酶活为100％，计算经过不同温度处理的样品酶活。
[0067]
(2)依照上述方法，本发明测定了野生型漆酶cota和优化后的漆酶cotagold的耐热性。结果如图2所示(左侧柱为cotagold平均酶活，右侧柱为cota平均酶活)，改造过的漆酶cotagold的耐高温特性明显优于野生型漆酶cota。在81.1℃放置处理30min，野生型漆酶cota的酶活力为未经81.1℃放置处理时的18.7％，优化后的漆酶cotagold的酶活力保持率则为23.3％。
[0068]
实施例6
[0069]
本实施例用于对野生型漆酶cota和重新设计的漆酶cotagold对于黄曲霉毒素的降解能力进行分析。
[0070]
(1)将漆酶野生型漆酶cota和优化后的漆酶cotagold置于70℃分别与50μg/ml的黄曲霉毒素b1接触，对其进行降解，每隔0.33h测定一次黄曲酶毒素的含量，同时使用不同浓度的酶用于降解，浓度如下表1。
[0071]
表1野生型漆酶与改造后漆酶降解黄曲霉毒素b1所使用的酶浓度
[0072][0073]
(2)依照上述方法，本发明测定了野生型漆酶cota和优化后的漆酶cotagold对于黄曲霉毒素b1的降解效率。结果如图3所示(横轴为时间min，左侧柱为cota的降解效率，右侧柱为cotagold的降解效率)，改造过的漆酶cotagold的降解黄曲霉毒素b1的能力明显优于野生型漆酶cota。野生型漆酶cota需要4h才能完全降解体系内的黄曲霉毒素b1，而改造过的漆酶cotagold仅仅需要1.67h就能将体系内的黄曲酶毒素b1完全降解。
[0074]
实施例7
[0075]
本实施例用于对野生型漆酶cota和重新设计的漆酶cotagold对于靛蓝染料的降解能力进行分析。
[0076]
(1)将漆酶野生型漆酶cota和优化后的漆酶cotagold置于70℃分别与1ng/ml的靛蓝接触，对其进行降解，每隔一段时间测定一次靛蓝的含量。反应12h后的定性结果如图4所示。
[0077]
(2)依照上述方法，本发明测定了野生型漆酶cota和优化后的漆酶cotagold对于靛蓝的降解效率。结果如图4所示(从左到右分别为：使用漆酶cotagold降解、使用cota降解、不加酶降解)，改造过的漆酶cotagold的降解靛蓝的能力明显优于野生型漆酶cota。如图5所示(左侧柱为cota的降解效率，右侧柱为cotagold的降解效率)，野生型漆酶cota需要6h才能达到降解的峰值，而改造过的漆酶cotagold仅仅需要2h就能达到峰值，且改造过的
漆酶cotagold的降解率能达到接近80％，而野生型漆酶cota的降解率仅能达到30％左右。
[0078]
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。