专利名称:一种控制家蚕蛹期发育的方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种转基因家蚕通过UAS/GAL4双元系统控制家蚕蛹期发育的方法。
背景技术：
家蚕丝蛋白质高效合成、发育与变态、免疫与抗性以及性别决定是家蚕最重要的四大性状。家蚕变态与发育的人为调控是蚕丝生产的重要内容，人为调节家蚕的变态与发育对蚕丝业的生产结构与整体生产效益有重大影响。家蚕是完全变态昆虫，蛹期很短，仅为2周，由于蛾口茧不适合于缫丝，生产上必需在蛹化蛾之前完成鲜茧的收购和烘干工作。由于鲜茧的收烘环节不能及时到位以及烘茧过程的高温对丝蛋白的破坏，导致原料茧的品质严重下降。人们希望通过人为调节家蚕的变态与发育，延长蛹期，减轻鲜茧收购和烘干的工 作压力及强度，甚至希望蛹期发育中止，实现鲜茧缫丝。这样，不仅可以止解决鲜茧收烘与蛹期过短之间的矛盾，使提高生丝品位成为可能，而且还可以大大节约烘茧所需的能源。目前，常规的方法也难以实现蛹期有较长时间的延长，因此，有必要从根本上探索延长蛹期经过、甚至中止蛹发育的新方法。有关方面的研究在优化蚕丝业的产业结构、改革现有蚕茧收烘现状、实现生丝加工工艺重大改革等方面具有重大意义。
家蚕属完全变态昆虫，一般认为昆虫的蜕皮与变态受激素调控，它所处的生长发育阶段取决于血淋巴中保幼激素和蜕皮激素这两类激素的相对滴度。已有许多研究结果显示，通过人为干预，改变昆虫的内分泌状态，可认为调节昆虫的发育与变态。从外部对家蚕施加保幼激素(JH)或保幼激素类似物(JHA)可以促进或抑制蜕皮，用JHA处理刚蜕皮的次末龄(4龄)幼虫，可增加I次眠和蜕皮，诱导出6龄幼虫；同样施加蜕皮激素(MH)也能改变家蚕的蜕皮次数，蚁蚕用含MH (100 mg/kg)的人工饲料饲养，可明显增加蜕皮次数，个别蚕可以蜕皮12次；对家蚕施加早熟素可以诱导3眠蚕出现；Dedos等用咪唑类化学物质KK-42处理4龄幼虫,能诱导早熟化蛹；对5龄129-132小时的家蚕施加苯氧威(fenoxycarb)可诱导产生永久蛹(参见Dedos SG, J Insect Physiol，2002，48 (9) :857-865)。上述方法都是通过施加某种化学物质干预家蚕发育变态的，没有涉及到通过基因操作改变蚕的发育变态。
已有较多的研究结果显示，杆状病毒对昆虫的就眠与变态有明显影响。用对家蚕非靶宿主的苜蓿丫纹夜蛾杆状病毒(AcNPV)接种4龄家蚕幼虫，能引起幼虫发育延缓，给化蛹2日的家蚕蛹注射AcNPV，可诱导人工滞育蛹的产生。Owain研究结果表明，杆状病毒基因的编码产物为脱皮留体尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(Ecdysone UDP- glucosyltransferase, EGT),该酶能催化昆虫体内的尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucosyl)中的葡萄糖基转移到MH上，形成蜕皮激素22-0-3 -D-吡喃葡萄糖，使宿主昆虫分泌的MH失活，从而阻止幼虫的变态，延长幼虫的取食时间，促使蛹提早成熟(参见Owain PE, 0’ Reilly DR,Biochem J,1998,330: 1265-1270)。
从激素调控昆虫变态的机理推测，调节蚕的MH水平可以控制蚕的发育，但是，如何通过分子生物学的方法，对蚕的MH水平进行控制，以延缓幼虫或蛹的发育，改善生产性状，是需要研究解决的问题。
公开号为CN 101418302的中国发明申请公布说明书公开了一种发育可控的家蚕的构建方法及发育控制方法，该方法是用家蚕热激蛋白启动子控制家蚕杆状病毒^基因，构建转基因家蚕，通过对转基因家蚕用4f43°C热诱导0. 5^2小时延长家蚕发育，但该方法要求严格控制诱导的时的温度和时间，稍有不慎将导致不良影响。
蝎毒(Scorpion venom)是储存于蝎子尾刺毒囊的毒，是蝎子捕食御敌的武器，也可用来治疗肿瘤、血栓等疾病。从蝎毒中分离得到的抗昆虫神经毒素，由于多数能专一作用于昆虫，并具有对哺乳动物无害或毒性很小的特点，因而引起了国内外学者的关注。抗昆虫蝎毒素有二大类，一类为长链毒素，由60 70个氨基酸组成，特异性地作用于Na+通道，含有3 4对二硫键；另一类为短链毒素，特异性阻断K+通道。从东亚钳蝎(Chinese ScorpionButhus martensii Karsch,BmK)至少存在3类毒素基因，S卩a I申经毒素基因，疫挛型昆虫毒素基因和软瘫型昆虫毒素基因。BmKIT/是东亚钳蝎抑制型昆虫毒素基因的一种，该基因 表达的蝎毒素具有对昆虫专一选择性的神经麻痹致死作用，注射微量的重组BmKIT/能引起家蚕神经麻痹、导致家蚕软瘫，且这种软瘫家蚕不易腐烂。因此,及 r/r3K可以作为中止蚕蛹发育的候选基因，通过转基因技术，将基因导入家蚕，在蛹期诱导表达，有可能引起蚕蛹自身神经麻痹，中止蚕蛹发育，延长蛹期。
但是，如何确保基因在蚕的蛹期特异性表达，仍是一个未解决的问题，未见相关方面的研究报道。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种控制家蚕蛹期发育的方法，延长家蚕蛹期的时间，解决鲜茧收烘与蛹期过短之间的矛盾、增加生产的灵活性。
为达到上述发明目的，本发明的基本思路是通过GAL4/UAS双元系统，在家蚕的Fl代蛹期特异表达基因，导致蛹体MH水平下调，或使家蚕的Fl代蛹期特异表达^
基因导致蚕蛹中毒麻痹发育阻滞，从而自动延长蛹期，并对家蚕的幼虫期的发育不影响。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是一种控制家蚕蛹期发育的方法，其特征在于，包括以下步骤
(I)通过基因工程操作将家蚕茧蛋白酶基因启动子/ °控制下的0Z4基因克隆进转座子载体pigA3GFP，构建重组转基因载体A，与辅助质粒混合，导入初产卵，孵化后的蚁蚕通过常规筛选获得带有荧光蛋白报告基因的家蚕，检测到^/^和^^4基因，育种制成转基因家蚕TOP(2)将育种制成的转基因家蚕rop由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点
I.本发明通过GAL4/UAS双元系统，在Fl代蛹期特异表达從(基因，导致蛹体MH水平下调，或Fl代蛹期特异表基因导致蚕蛹中毒麻痹发育阻滞，从而自动延长蛹期，并对家蚕的幼虫期的发育不影响。
2.本发明通过在Fl代蛹期特异性表达基因或基因，蛹期显著延长，增加了蚕茧收购和缫丝工艺的灵活性。
图I是实施例一步骤2中piggyA3GFP-ie-neo-UAS-IT3R-polyA载体的鉴定结果图；
图2是实施例一步骤3中pigA3GFP-ie-neo-PDP-Gal4-PA载体的鉴定结果图；
图3是实施例一步骤4中的荧光蚕幼虫；
图4是实施例一步骤4中UAS-BmKIT/系统的鉴定结果；
图5是实施例一步骤5中的荧光蚕蛹；
图6是实施例一步骤5中PDP-GAL4系统的中的例°鉴定；M DNA maker ;泳道I —5 :不同转基因家蚕个体的PCR产物；
图7是实施例二步骤4中的荧光蚕蛹；
图8是实施例二步骤4中的UAS-egt系统中的egt鉴定结果图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述
实施例一家蚕茧蛋白酶基因启动子(/ /7)控制G4L4、CA 控制J/1/转基因双元系统的构建
I.及基因的人工合成
根据已公开的蝎毒基因的序列，参考家蚕对密码子的偏爱性，合成了包含起始密码子ATG和终止密码子TGA在内的长度为189 nt的BmHTM纖，具体核苷酸序列和对应的氨基酸序列分别如SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示。将合成的序列克隆进PUCm-T (上海申能博彩生物科技有限公司产品)，获重组质粒pUCm-IT3R，测序证实与设计的
序列完全一致。
2.效应转基因载体 piggyA3GFP-ie-neo-UAS-IT3R_polyA 的构建
(I )pSK_UAS质粒构建以 pUAST质粒 DNA(参见Brand and Perimon, Development,1993,118 :401-415)为模板，以 UAS-1 (SEQ ID No. 3 ctR aat tcR cat gcc tgc agg tcg,下划线为 AcoR I 位点)和 UAS-2 (SEQ ID No. 4 ttg_ata__tcc aat tcc cta ttc aga g,下划线为V位点)为引物，PCR扩增出片段(约350 bp),。I /EcoR V双酶切后克隆进pBluescript II SK (+)质粒(Stratagene公司产品)的及 01 I /EcoR V位点，获pSK-UAS 质粒。
(2)pSK_IT3R_polyA 质粒的构建以 IT3R_1(SEQ ID No. 5 cac_tcg_aga tgg acgget ata ttc gc,下划线为I 位点)和 IT3R_2(SEQ ID No. 6 cag ggc cct caa ccg catgta ttg c，下划线为如a I位点)为引物，以pUCm-IT3R为模版，PCR得到基因片段，Xho I和如a I酶切后克隆到pSK的相同酶切位点，得到pSK-IT3R质粒；以YCFib-PA-l(SEQID No. 7 ggg ata tea aat tgt gtt tgc gtt agg,下划线为 V位点)和 YCFib-PA-2(SEQ ID No. 8 gcg gat ccg gta ccc act gtc caa tcc acc gtc,下划线为I、Kpn I位点)为引物，从家蚕基因组中扩增得到家蚕丝素轻链基因poly(A)加尾信号序列，&oR V和命/ I酶切后克隆到PSK-IT3R的如a I和命/ I位点，得到pSK_IT3R-polyA质粒。
(3) pSK-UAS-IT3R-polyA 质粒的构建从 pSK_IT3R-polyA 质粒中用通o I 和Kpn I切出IT3R-polyA片段，克隆进同样酶切的pSK_UAS质粒，获pSK-UAS_IT3R-polyA。
(4)piggyA3GFP-UAS-IT3R_polyA 的构建pSK-UAS-IT3R-polyA 质粒用 ^boR I /Kpn I双酶切切出UAS-IT3R-polyA片段后，克隆进同样酶切的piggyA3GFP载体(参见CaryLC et al. ,Virology，1989，172:156(5 )piggyA3GFP-ie-neo-UAS-IT3R-poIyA 的构建将用 ^boR I 从 pSK-IE-Neo (参 见周文林，等.蚕业科学，2007，33 (I): 30piggyA3GFP-ie-neo-UAS_IT3R-polyA 载体分别用 ]^[Ii coRV，i coR I 和Xho I ,Xho I和命/7 I双酶切鉴定，结果图如图I所示，其中，M A /HindUl标准分子量；泳道2 :用I和V酶切；泳道3 -.Eco^ I和沿o I双酶切；泳道4 -.Xho I和命/ I酶切；图I可知酶切产生的条带数目、分子量大小与理论值一致。
3.激活转基因载体 pigA3GFP-ie-neo-PDP-Gal4_PA 的构建
(I )pSK-Fib_L-polyA 质粒的构建以 TPFib-L_3(SEQ ID No. 9 ggc__tcg_agc aaattg tgt ttg egt tag g,下划线为％0 I 位点)，TPFib-L-4 (SEQ ID No. 10 rcr Rta cccact gtc caa tcc acc gtc,下划线为治7/ I位点)为引物，以家蚕基因组为模板，PCR扩增出约290 bp的片段，经经沿o I和命I双酶切后，克隆进同样酶切的pBluescript II SK(+)的载体获pSK-Fib-L-polyA质粒。
(2)pSK_Gal4_PA 的构建设计引物 GAL4_1(SEQ ID No. 11 agg_ata__tca tga agetac tgt ctt cta tcg,下划线为及 01 V 酶切位点)和 GAL4_2(SEQ ID No. 12 gca_agc__ttgcac agt tga agt gaa ctt gcg g,下划线为/ZifldIII酶切位点)，以 pBGTl(参照 LukacsovichT et al. , Arch Insect Biochem Physiol, 2008,69 (4): 168-175)为模板，PCR 扩增出全长d4基因；以&01 V和历/ (1111双酶切？0 产物并克隆进？51(4让-1^0174载体的
V和 HinA III的位点获 pSK-Gal4-PA 质粒。
(3) pSK-PDP-Gal4-PA质粒的构建以家蚕基因组DNA为模板，以PDPl (SEQ IDNo. 13 ttR Rat ccR aat tct aca tcc ata acc ctg g，下划线为I 和及 01 I 酶切位点)和 F*DP2 (SEQ ID No. 14 ttR ata tct tea gtt tcg ate egg eg,下划线为 V酶切位点)为引物PCR扩增出茧蛋白酶基因启动子(/ °),经及IV双酶切后克隆进 pSK-Gal4-PA 的 I /&0R V位点，获 pSK-PDP_Gal4_PA 质粒。
(4)pigA3GFP-PDP-Gal4-PA 质粒的构建用 ^boR I 和I 从 pSK-PDP_Gal4_PA质粒切出PDP-Gal4-PA片段，克隆进piggyA3GFP的I和Kpn I位点获pigA3GFP-PDP-Gal4-PA 质粒。
(5)pigA3GFP-ie-neo-PDP-Gal4_PA 的构建将用 ^boR I 从 pSK-IE-Neo(参见周文林，等.蚕业科学，2007，33(1) : 30图2是步骤3中pigA3GFP-ie-neo-PDP-Gal4_PA载体的鉴定结果图，其中，M 入/Hindm标准分子量；泳道2和泳道3 pigA3GFP-ie-neo-PDP-Gal4-PA载体用I和历/7dm双酶切；泳道4 :pigA3GFP-ie-neo-PDP-Gal4-PA载体用&oR I和汝7 II酶切；酶切产生的条带数目、分子量大小与理论值一致。
4. UAS-BmKIT/系统的构建与鉴定
(I) UAS-BmKIT/ 系统的构建piggyA3GFP-ie-neo-UAS_IT3R-polyA 及辅助质粒(参见 Tamura T et al. , Nature Biotechnology, 2000, 18: 81-84)按 1:1 混合(混合浓度2 118/111)，用毛细管玻璃针以1.5 2.0 ML/只注入处女蛾交尾囊，正常交配，产卵，孵化后 的蚁蚕(Gtl)连续添食10 000 Ug/mL的G418至4龄眠，结合荧光倒置显微镜检测，筛选出抗G418、带有荧光蛋白报告基因的家蚕，保留具有明显荧光显示的家蚕(转基因家蚕，参见图3)，进行分子检测和常规家蚕育种。
(2) UAS-BmKIT/系统的鉴定提取转基因家蚕基因组DNA，以DEGFP-I (SEQ IDNo. 15 tgg aat tea tgg tga gca agg gcg agg,下划线示I 位点)和 DEGFP-2 (SEQID No. 16 ttg gat cct tac ttg tac age tcg tcc atg,下划线分别示I 位点)为引物进行PCR扩增，可特异性扩增出的特异性条带；以IT3R-1 (SEQ ID No. 5)和IT3R-2(SEQ ID No. 6)为引物也可从转基因家蚕基因组中扩增出及基因。
鉴定结果如图4，图4是步骤4中UAS-BmKIT/系统的鉴定结果，其中，M=DNAmaker ;泳道I ..BmKITl PCR产物；泳道2 'GFP PCR产物；结果表明确为转基因家蚕。
5. PDP-GAL4系统的构建与鉴定
(I) PDP-GAL4 系统的构建pigA3GFP-ie-neo-PDP-Gal4_PA 及辅助质粒按 I: I 混合(混合浓度2iig/iiL)，用毛细管玻璃针以I. 5 2.0 ML/只注入处女蛾交尾囊，正常交配，产卵，孵化后的蚁蚕(Gtl)连续添食10 000 u g/mL的G418至4龄眠，结合荧光倒置显微镜检测，筛选出抗G418、带有荧光蛋白报告基因的家蚕，保留具有明显荧光显示的家蚕(转基因家蚕，参见图5)，进行分子检测和常规家蚕育种。
(2 ) PDP-GAL4系统的鉴定提取转基因家蚕基因组DNA，以DEGFP-I (SEQ IDNo. 15)和DEGFP-2 (SEQ ID No. 16)为引物进行PCR扩增，可特异性扩增出GFP的特异性条带；以GAL4-1 (SEQ ID No. 11)和GAL4-2 (SEQ ID No. 12)为引物也可从转基因家蚕基因组中扩增出GAL4基因。鉴定结果如图6，图6是步骤5中TOP-GAL4系统的中的GFP鉴定结果，其中，M DNA maker ;泳道I 一 5 :不同转基因家蚕个体的PCR产物；结果表明确为转基因家蚕。
6. PDP实施例二 家蚕茧蛋白酶基因启动子(PDP)控制GAL4、UAS控制egt转基因双元系统的构建
技术操作过程如下[0054]I.激活转基因载体pigA3GFP-ie-neo-PDP-Gal4-PA的构建同实施例一的步骤3。
2. PDP-GAL4系统的构建与鉴定同实施例一的步骤5。
3.效应转基因载体 pigA3GFP-ie-neo-UAS-EGT 的构建
(I) pSK-UAS-egt载体的构建家蚕杆状病毒(BmNPV)基因组DNA抽提按常规方法进行。依照已公布BmNPV-T3株基因组全序列(GenBank登记号L33180)设计PCR上下游引物 Egt-1 (SEQ ID No. 17 cgc tcg aga tga cta ttc ttt get ggc,下划线示I位点)和 Egt_2b (SEQ ID No. 18 cgg gta cct tgg ttg cta ctg gca cat aag cgc,下划転Kpn I位点)；以BmNPV基因组为模板，进行PCR扩增，回收I. 7 kb的基因片段。Kpnl/Xhol双酶切后，克隆进实施例一步骤2的pSK-UAS-IT3R-polyA的治wl/XhoI位点获pSK-UAS-egto
(2)pigA3GFP-ie_neo 载体的构建用 I 从 pSK-IE-Neo(参见周文林,等.蚕 业科学，2007 33(1) : 30(3) pigA3GFP-ie-neo-UAS_egt 的构建双酶切 pSK-UAS-egt载体，回UAS-egt片段，克隆进pigA3GFP-ie-neo的Bglll和Kpnl位点获pigA3GFP-ie-neo-USA_egt0
4. UAS-egt系统的构建与鉴定
(l)UAS-egt 系统的构建pigA3GFP-ie-neo-USA_egt 及辅助质粒按 I: I 混合(混合浓度g/y L)，用毛细管玻璃针以I. 5^2. 0 ML/只注入处女蛾交尾囊，正常交配，产卵，孵化后的蚁蚕(Gtl)连续添食10 000 u g/mL的G418至4龄眠，结合荧光倒置显微镜检测，筛选出抗G418、带有荧光蛋白报告基因的家蚕，保留具有明显荧光显示的家蚕(转基因家蚕，参见图7)，进行分子检测和常规家蚕育种。
(2) UAS-egt系统的鉴定提取转基因家蚕基因组DNA，以DEGFP-1 (SEQ IDNo. 15)和DEGFP-2 (SEQ ID No. 16)为引物进行PCR扩增，可特异性扩增出的特异性条带；以Egt-I (SEQ ID No. 17)和Egt-2b (SEQ ID No. 18)为为引物也可从转基因家蚕基因组中扩增出egt基因，鉴定结果如图8所示，图8是实施例二步骤4中的UAS-egt系统中的egt鉴定，其中，M DNA maker ;泳道I — 3 :不同转基因家蚕个体的從力PCR产物。结果表明确为转基因家蚕。
5. PDP权利要求
1.一种控制家蚕蛹期发育的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)通过基因工程操作将家蚕茧蛋白酶基因启动子/ °控制下的GAL4基因克隆进辟；转座子载体pigA3GFP，构建重组转基因载体A，与辅助质粒混合，导入初产卵，孵化后的蚁蚕通过常规筛选获得带有荧光蛋白报告基因的家蚕，检测到GFP和G4M基因，育种制成转基因家蚕PDP — GAL4系统；通过基因工程操作将ひA 启动子控制下的家蚕杆状病毒egt基因或蝎毒素み 基因克隆进辟；7^^转座子载体pigA3GFP，构建重组转基因载体B，与辅助质粒混合，导入初产卵，孵化后的蚁蚕通过常规筛选获得带有荧光蛋白报告基因的家蚕，检测到外源基因，育种制成转基因家蚕UAS — egt或转基因家蚕UAS — BmKIT3K系统； 其中，所述家蚕茧蛋白酶基因启动子/ °是以家蚕基因组DNA为模板，以ropi和TOP2为引物PCR扩增获得；所述F1DPl 为 SEQ ID No. 13 ttg gat ccg aat tct aca tcc ata accctg g，下划线为I 和I 酶切位点，所述F1DPZ 为 SEQ ID No. 14 ttg ata tct teagtt tcg ate egg eg,下划线为V酶切位点； (2)将育种制成的转基因家蚕PDP— GAL4系统与转基因家蚕UAS — egt系统或转基因家蚕UAS — BmKIT/系统杂交，获得家蚕的Fl代幼虫，所得家蚕的Fl代幼虫期发育正常，蛹期延长7 — 10天。
2.根据权利要求
I所述控制家蚕蛹期发育的方法，其特征在于，所述重组转基因载体A为 pigA3GFP-ie-neo-PDP-Gal4-PA。
3.根据权利要求
I所述控制家蚕蛹期发育的方法，其特征在于，所述重组转基因载体B为 piggyA3GFP-ie-neo-UAS_IT3R-polyA 或 pigA3GFP-ie-neo-UAS_egt。
专利摘要
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种转基因家蚕通过UAS/GAL4双元系统控制家蚕蛹期发育的方法以piggyBAC转座子载体pigA3GFP为基础载体，通过基因工程操作构建家蚕茧蛋白酶基因启动子(PDP)控制GAL4基因表达的转基因家蚕PDP－GAL4系统；通过基因工程操作构建UAS启动子控制家蚕杆状病毒egt基因或蝎毒素BmKIT3R基因表达的转基因家蚕UAS－egt或UAS－BmKIT3R系统；PDP－GAL4系统与UAS－egt系统或UAS－BmKIT3R系统杂交，F1代幼虫期发育正常、蛹期延长7－10天。本发明方法通过GAL4/UAS双元系统实现了利用家蚕杆状病毒egt基因和BmKIT3R延长F1代蚕蛹蛹期，增加了蚕茧收购和缫丝工艺的灵活性，具有重要的实施价值。
文档编号A01K67/04GKCN102250932 B发布类型授权 专利申请号CN 201110175284
公开日2012年10月31日 申请日期2011年6月27日
发明者曹广力, 潘中华, 薛仁宇, 贡成良, 郑小坚 申请人:苏州大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (4),