用于重组布氏白僵菌蛋白酶k常温保存的缓冲液及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种蛋白酶K缓冲液，尤其涉及的是用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常 温保存的缓冲液及其应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白酶K(ProteinaseK)，又名肽链内切酶K、腐生真菌碱性蛋白酶、白色念球 菌丝氨酸蛋白酶、白色念球菌蛋白酶K，是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。该蛋白可通 过切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键降解天然角蛋白，并因此而得名。由于蛋 白酶K在盐酸胍（3M)、尿素（4M)和SDS(0.5-1%)中均可以稳定存在并具有降解蛋白质的 能力，因而被广泛应用于脉冲电泳用染色体DNA制备、蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制品 中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作浓度是50?100yg/ml，且在较广的pH范围内（pH4? 12)均有活性。
[0003] 蛋白酶K有两个Ca2+结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无 直接关系。然而，如果从该酶中除去Ca2+，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80%左 右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染核酸制品的蛋白质。所以，蛋白酶K消 化过程中通常加入EDTA(以抑制依赖于Mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化对蛋白 酶K具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有lmmol/1的Ca2+而不含EDTA 的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EDTA(pH8.0)至终浓度为2mmol/l，以鳌合 Ca2+。
[0004] 蛋白酶K最早于1974年从林伯氏白色念球菌（tritirachiumalbumlimber)中纯 化得到。但一直以来天然菌株培养困难、产量过低的问题严重阻碍了蛋白酶K的实际应用。 1985年测定其天然氨基酸序列后，多个国家的研究者及相关公司投入了很大精力尝试实现 该蛋白的大规模重组表达，于2000年前后实现该蛋白在大肠杆菌系统中的重组表达，但此 方法只能得到包涵体蛋白，变复性过程导致生产成本增高、产量损失严重；直到2008年左 右才实现了该蛋白的毕赤酵母系统分泌表达，至此，林伯氏白色念球菌蛋白酶K的生产和 应用进入了一个快速发展的时期。与此同时，林伯氏白色念球菌蛋白酶K野生型及各种突 变体的表达纯化专利在很短时间内被各大国际制药公司垄断（PatentNo. :W0 02/072634 A2,US7368274B2)，做为后入者的中国企业很难绕开相关专利保护加入到该酶的研发、生 广和销售过程中去。
[0005] 重组布氏白僵菌蛋白酶K来源于布氏白僵菌的重组表达，现已在我国实现了工 业化生产，其催化活力显著优于现有林伯氏白色念球菌蛋白酶K。重组布氏白僵菌蛋白酶 K产品作为一种蛋白质，其活性和稳定性受到温度、pH值、保存时间等因素的影响，为维持 其正常活性，该产品通常需要以干粉形式低温保存（〇?4°C)，或者溶液状态下冷冻保存 (-20°C)，且保存时间均不超过一年。这给重组布氏白僵菌蛋白酶K的运输和应用带来了很 大不便，研究如何降低其保存条件并延长其保存时间非常有必要。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常 温保存的缓冲液及其应用，以解决重组布氏白僵菌蛋白酶K无法常温保存，且保存时间短 的技术问题。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的： 本发明提供了一种用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液，所述缓冲液的组 分包括： 三羟甲基氨基甲烷Tris，其摩尔浓度为10?500mmol/L; 可溶性纳盐，所述纳盐中Na+的摩尔浓度为：20mmol/L?500mmol/L; 可溶性f丐盐，所述f丐盐中Ca2+的摩尔浓度为：2mmol/L?50mmol/L; 用HC1调节pH值至7. 5?8. 4 ; 甘油，其30 %?60 %的体积百分比； 余量为水。
[0008] 优选地，所述缓冲液的组分包括： 三羟甲基氨基甲烷Tris，其摩尔浓度为25mmol/L; 可溶性纳盐，所述纳盐中Na+的摩尔浓度为：200mmol/L; 可溶性钙盐，所述钙盐中Ca2+的摩尔浓度为：10mmol/L; 用HC1调节pH值至7. 8 ; 甘油，其体积百分比为50%; 余量为水。
[0009] 优选地，所述可溶性钠盐为NaCl。
[0010] 优选地，所述可溶性钙盐为CaCl2*CaSO4。
[0011] 本发明进一步提供了上述用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液的制 备方法，包括下列步骤： (1) 按照配比，将Tris、可溶性钠盐、可溶性钙盐加入水中溶解，并用HC1调节pH值至 7. 5?8. 4,获得混合液； (2) 将甘油按照30%?60%的体积百分比加入步骤（1)的混合液中混匀，即为所述缓 冲液。
[0012] 本发明还进一步提供了上述用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液的 应用，将重组布氏白僵菌蛋白酶K溶解于所述缓冲液中，其溶解浓度为2?10mg/mL，然后置 于常温中保存即可，保存时间在一年以上无明显降解。
[0013] 本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种用于重组布氏白僵菌蛋白 酶K常温保存的缓冲液及其应用，该缓冲液能够显著增强重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保 存的时间且不降解其催化效率，在该缓冲液中，重组布氏白僵菌蛋白酶K可以在常温运输 和存放超过一年时间而活性不受显著影响；同时，采用本发明的方法保存的重组布氏白僵 菌蛋白酶K可无需处理，直接应用，如用于核酸抽提等；本发明相比于现有技术，显著降低 了布氏白僵菌蛋白酶K的运输、保存和使用成本，具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0014] 图1是重组布氏白僵菌蛋白酶K的BSA消化电泳检测图； 图2是利用重组布氏白僵菌蛋白酶K抽提所得的DNA的琼脂糖凝胶电泳检测图。
【具体实施方式】
[0015] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。
[0016] 实施例1 本实施例的用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液的制备方法，包括以下步 骤： (1)分别准确称取〇.303g三羟甲基氨基甲烷（Tris-base)、0.147g二水合氯化钙CaCl2 和1. 17g氯化钠NaCl，然后加入40ml纯水，充分混匀后用盐酸将其pH调至7.8,用量筒定 容至50ml，获得混合液。
[0017] (2)准确量取50mL甘油，加入上述混合液中混匀，即获得所述缓冲液。
[0018] 将上述缓冲液用于重组布氏白僵菌蛋白酶K的常温保存，并测定其保护效果，具 体如下： A、BSA消化试验 a、反应底物BSA的预处理 将5mg的牛血清白蛋白BSA溶于6mol/L的盐酸胍、50mmol/L的Tris-Cl (pH8. 0)、5mmol/L的二硫苏糖醇DTT，终体积为lmL ;95°C水浴20min ;降至室温后，加入50mmol/L的 Tris-Cl (pH 7. 5)及5mmol/L的CaCl2，使盐酸胍的终浓度降至2mol/L以下，获得BSA溶 液。
[0019] b、不同缓冲液条件下重组布氏白僵菌蛋白酶K的BSA消化实验 将重组布氏白僵菌蛋白酶K用本实施例制备获得的缓冲液配制成10mg/ml的酶溶液， 分别选取新鲜配制的该酶溶液，室温保存半年的酶溶液，以及室温保存一年的酶溶液作为 测定组，并用普通缓冲液溶解重组布氏白僵菌蛋白酶K的酶溶液作为对照组，进行后续的 BSA消化反应。
[0020] 所述BSA消化反应的反应体系（10i!L)为由4i!L的BSA溶液和6i!L的酶溶液组 成。
[0021] 混合反应液在37°C反应15min后金属浴高温加热停止反应，获得消化后的酶解 液。
[0022] c、SDS_PAGE检测 对酶解液进行SDS-PAGE检测，步骤包括： 步骤一：制备质量比为12%的分离胶和质量比为5%的浓缩胶，其配方为：
【主权项】
1. 一种用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液，其特征在于，所述缓冲液的 组分包括： 三羟甲基氨基甲烷Tris，其摩尔浓度为10?500mmol/L ; 可溶性纳盐，所述纳盐中Na+的摩尔浓度为：20mmol/L?500mmol/L ; 可溶性f丐盐，所述f丐盐中Ca2+的摩尔浓度为：2mmol/L?50mmol/L ; 甘油，其30 %?60 %的体积百分比； 用HC1调节pH值至7. 5?8. 4 ; 余量为水。
2. 根据权利要求1所述的一种用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液，其特 征在于，所述缓冲液的组分包括： 三羟甲基氨基甲烷Tris，其摩尔浓度为25mmol/L ; 可溶性纳盐，所述纳盐中Na+的摩尔浓度为：200mmol/L ; 可溶性钙盐，所述钙盐中Ca2+的摩尔浓度为：10mmol/L ; 甘油，其体积百分比为50%; 用HC1调节pH值至7. 8 ; 余量为水。
3. 根据权利要求1、2任一所述的一种用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲 液，其特征在于，所述可溶性钠盐为NaCl。
4. 根据权利要求1、2任一所述的一种用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲 液，其特征在于，所述可溶性钙盐为CaCl2* CaSO 4。
5. -种如权利要求1所述的用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液的制备方 法，包括下列步骤： (1) 按照配比，将Tris、可溶性钠盐、可溶性钙盐加入水中溶解，并用HC1调节pH值至 7. 5?8. 4,获得混合液； (2) 将甘油按照30%?60%的体积百分比加入步骤（1)的混合液中混匀，即为所述缓 冲液。
6. -种如权利要求1所述的用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液的应用。
7. 根据权利要求6所述的一种用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液的应 用，其特征在于，将重组布氏白僵菌蛋白酶K溶解于所述缓冲液中，其溶解浓度为2?10mg/ mL，然后置于常温中保存。
【专利摘要】本发明公开了一种用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液及其应用，所述缓冲液的组分包括：三羟甲基氨基甲烷Tris，可溶性纳盐，可溶性钙盐，甘油， pH值至7.5～8.4；余量为水；本发明相比于现有技术，能够显著增强重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的时间且不降解其催化效率，同时，采用本发明的缓冲液保存的重组布氏白僵菌蛋白酶K可无需处理，直接应用，如用于核酸抽提等，显著降低了布氏白僵菌蛋白酶K的运输、保存和使用成本，具有广泛的应用前景。
【IPC分类】C12N9-96, C12N9-58
【公开号】CN104531660
【申请号】CN201410791642
【发明人】李旭, 滕脉坤
【申请人】合肥巅峰生物科技有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月19日