一种用于鉴定少棘巨蜈蚣的引物对及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及一种用于鉴定少棘巨蜈蚣的引物对及其应用。
【背景技术】
[0002] 据《中国药典》（2010)年版一部记载，蜈蚣来源为蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣 ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch的干燥体。蜈蚁是我国传统名贵中药材，具有 熄风镇痉、通络止痛、攻毒散结的功效，用于肝风内动、痉挛抽搐、小儿惊风、半身不遂、破伤 风、风湿顽痹、偏正头痛、疮疡、瘰疬、蛇虫咬伤等，主产于我国湖南、湖北、广西以及云南等 地（王克勤，方红，叶卯祥，等.蜈蚣药源调查及商品鉴定，中药材，1997, 20 (9) : 450)。
[0003] 近年来，蜈蚣养殖在我国逐渐兴起，然而由于现在大部分蜈蚣产业的从业人员 素质参差不齐，养殖户对自己所养蜈蚣只知其俗称，不知其具体品种（陈金印.我国蜈 蚣产业发展的现状与思考，江西中医学院学报，2013, 25(1) :82)。导致一些蜈蚣混伪 品涌入药材市场，如多棘蜈蚁S.multidensNewport、哈式蜈蚁S.subspinipesdehaani Brandt、赤娱虫公S.morsitansLinnaeus、日本娱虫公S.subspinipesjaponicaL.Koch等， 其中多棘蜈蚣最为常见（杨成俊，周伟庆.蜈蚣及其混伪品的鉴别研宄，安徽农业科 学，2011，39(25) : 15402)。药典中收载的少棘巨蜈蚣与混伪品的形态学特征相似，在日常用 药中，因其混伪品也具有一定的药效，常与正品少棘巨蜈蚣混淆用药，但其药用功效与正品 有很大差别。为确保药材市场中蜈蚣的质量及其临床疗效，需建立更加快速、准确的方法来 鉴定蜈蚣与其混伪品。
[0004] 随着分子鉴定技术的发展，DNA条形码技术被应用于少棘巨蜈蚣与多棘蜈蚣的 PCR鉴定（张红印，陈俊，贾静，等.中药材蜈蚣及其混伪品DNA条形码鉴别研宄，中国中药 杂志，2014, 39 (12) : 2208)，但由于DNA条形码方法用时较长，而且需要测序，无法适应当前 中药分子鉴定技术现场运用的需要。而对少棘巨蜈蚣与多棘蜈蚣之间的分子特异性鉴别还 尚未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定少棘巨蜈蚣的引物对。
[0006] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定少棘巨蜈蚣的引物对，具体为由序列表中序 列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。
[0007] 所述引物对中，两条单链DNA分子既可以分别单独包装，也可以按照摩尔比为1:1 的比例混合后包装在一起。
[0008] 本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定少棘巨蜈蚣的试剂盒。
[0009] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定少棘巨蜈蚣的试剂盒，具体可含有所述引物 对、dNTP和DNA聚合酶。
[0010] 根据需要，所述试剂盒中还可含有荧光染料SYBRGreenI。
[0011] 制备所述引物对的方法也属于本发明的保护范围。
[0012] 制备所述引物对的方法，具体可包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别 单独包装的步骤。
[0013] 制备所述试剂盒的方法也属于本发明的保护范围。
[0014] 制备所述试剂盒的方法，具体可包括如下A)或B)的步骤：
[0015] A)将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的 dNTP和DNA聚合酶包装于同一个试剂盒内：
[0016] B)将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的 dNTP、DNA聚合酶和SYBRGreenI包装于同一个试剂盒内。
[0017] 所述引物对，或所述试剂盒，在鉴定或辅助鉴定少棘巨蜈蚣中的应用也属于本发 明的保护范围。
[0018] 本发明的第三个目的是提供一种利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定 待测样品中是否含有少棘巨蜈蚣的方法。
[0019] 本发明所提供的利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测样品中是否 含有少棘巨蜈蚣的方法，具体可包括如下步骤：
[0020] (a)从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对（序列1和序列2) 进行PCR扩增；
[0021] (b)为如下（bl)或（b2):
[0022] (bl)根据步骤（a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定待测样品中是否含 有少棘巨蜈蚣：若PCR产物中含有大小为250-500bp(如400-500bp)的DNA片段，则所 述待测样品中含有或候选含有少棘巨蜈蚣；若PCR产物中不含有大小为250-500bp(如 400-500bp)的DNA片段，则所述待测样品中不含有或候选不含有少棘巨蜈蚣；
[0023] (b2)向步骤（a)扩增后的反应体系中加入荧光染料SYBRGreenI，得到含有荧光 染料的体系，按照如下方法确定待测样品中是否含有少棘巨蜈蚣：若观察到所述含有荧光 染料的体系产生绿色荧光，则所述待测样品中含有或候选含有少棘巨蜈蚣；若观察不到所 述含有荧光染料的体系产生绿色荧光，则所述待测样品不含有或候选不含有少棘巨蜈蚣。
[0024] 在上述方法中，所述少棘巨蜈蚣可为整个少棘巨蜈蚣，也可为来自于少棘巨蜈蚣 的中药材蜈蚣。相应的，所述待测样品可为少棘巨蜈蚣或其他品种蜈蚣，如多棘蜈蚣的中药 材。
[0025] 本发明的第四个目的是提供一种利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定 待测蜈蚣为少棘巨蜈蚣还是多棘蜈蚣的方法。
[0026] 本发明所提供的利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测蜈蚣为少棘 巨蜈蚣还是多棘蜈蚣的方法，具体可包括如下步骤：
[0027] (a)从待测蜈蚣中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对（序列1和序列2) 进行PCR扩增；
[0028] (b)为如下（bl)或（b2):
[0029] (bl)根据步骤（a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测蜈蚣为少 棘巨蜈蚣还是多棘蜈蚣：若PCR产物中含有大小为250-500bp(如400-500bp)的DNA片 段，则所述待测蜈蚣为或候选为少棘巨蜈蚣；若PCR产物中不含有大小为250-500bp(如 400-500bp)的DNA片段，则所述待测蜈蚣为或候选为多棘蜈蚣；
[0030] (b2)向步骤（a)扩增后的反应体系中加入荧光染料SYBRGreenI，得到含有荧光 染料的体系，按照如下方法确定所述待测蜈蚣为少棘巨蜈蚣还是多棘蜈蚣：若观察到所述 含有荧光染料的体系产生绿色荧光，则所述待测蜈蚣为或候选为少棘巨蜈蚣；若观察不到 所述含有荧光染料的体系产生绿色荧光，则所述待测蜈蚣为或候选为多棘蜈蚣；
[0031] 所述待测蜈蚣为少棘巨蜈蚣或多棘蜈蚣。
[0032] 在上述两种方法的步骤（a)中，进行所述PCR扩增时采用的退火温度均可为58°C。
[0033] 在本发明中，进行所述PCR扩增时采用的具体反应条件如下：88°Clmin;88°Cls， 58°C5s，28 个循环。
[0034] 在上述两种方法的步骤（a)中，在进行所述PCR扩增的反应体