一种抗昆虫毒素及其编码序列以及重组毒素的制备与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种抗昆虫毒素及其编码序列以及重组毒素的制备与应用。本发明通过构建cDNA文库，从中国江苏少棘蜈蚣毒腺中克隆得到蜈蚣抗昆虫毒素基因。并通过将密码子优化后全合成的重组蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2与载体pSUMO-Mutant连接得到重组表达载体pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2，将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3)，筛选得到高效表达菌株。表达产物经亲和层析，得到具有生物学活性的多肽——rScolotoxin-Ssm2b。本发明提供的多肽rScolotoxin-Ssm2b具有昆虫神经毒性和昆虫致死作用，可用于制备神经生物学研究的工具试剂和生物杀虫剂，也可用于蜈蚣神经毒素空间结构及药理学活性等研究。
【专利说明】—种抗昆虫毒素及其编码序列以及重组毒素的制备与应用
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及一种抗昆虫毒素及其编码序列以及重组毒素的制备与应用，更为具体的说是涉及一种中国江苏少棘蜈蚣抗昆虫毒素基因SC0l0t0Xin-Ssm2.2及其编码的多肽Scolotoxin-Ssm2b和该多肽的重组制备技术，以及该毒素在神经生物学研究和杀虫药物开发中的应用。
[0003]
【背景技术】 [0004]蜈蚁(centipede)是节肢动物门Arthropoda唇足纲Chilopoda动物的总称，全世界约有 3300 种(Edgecombe, G.D., Giribet, G., Ann.Rev.Entomo1.2007.52,151-170.)。蜈蚣科蜈蚣(以下所称蜈蚣皆指此类)为其中最凶猛的捕食者，主要以昆虫和小型无脊椎动物为食，大型蜈蚣也能捕食蟾蜍、蛇、以至蝙蝠和大鼠等脊椎动物。蜈蚣通过向猎物注入毒液，直接杀死或麻痹猎物而捕食之。与蜘蛛、蝎等捕食性节肢动物一样，在长期的进化过程中，蜈蚣毒液系统发展出了一系列结构独特、性能高效且特异的毒素。然而，与对蜘蛛和蝎各近百种抗昆虫毒素的深入研究相比，人们对蜈蚣抗昆虫毒素的研究相当薄弱(E.F.Schwartz等,Pept Sc1.2012.98 (4): 385 - 405.),迄今仅见一例蜈虫公抗昆虫毒素基因的重组表达(中国专利CN 103088030A)。
[0005]最新的研究揭示，蜈蚣毒液中不仅含有高丰度的新型高分子量毒液蛋白/酶类，也含有分子骨架显著不同于已知毒素的多肽类毒素(E.A.B.Undheim等，Toxicon.57 (2011) 512 - 524),包括多种离子通道毒素(Yang 等，Mol Cell Proteomics.2012; 11 (9):640-50.;Liu 等，J Proteome Res.2012; 11 (12):6197-212.)，因而被学界视作“新型生物活性分子的丰富来源”。从蜈蚣毒腺中分离获得新的高效、特异的昆虫神经毒素基因及其多肽，进而重组表达或通过转基因技术进入相应的受体，在开发新的神经生物学研究试剂和农业与环境害虫的生物防治中，具有广阔的应用前景。
[0006]
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种全新的一种抗昆虫毒素及其编码序列以及重组毒素的制备与应用，并进一步得到可以应用于神经毒性类制剂，特别是杀虫剂的多肽产物重组蜈蚣抗昆虫毒素rSC0l0t0Xin-Ssm2b。在这一过程中，我们还同时得到了一种重组表达载体pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2。
[0008]本发明通过构建cDNA文库和测序的方法，从中国江苏少棘蜈蚣毒腺中分离获得了新的蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm〗.2及其编码的抗昆虫毒肽SC0l0t0Xin-Ssm2.2b。通过密码子优化合成了重组蜈蚣抗昆虫毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2，在大肠杆菌中表达、纯化得到重组蜈蚣抗昆虫毒素rSC0l0t0Xin-Ssm2b。进而检测验证了该重组蜈蚣抗昆虫毒素的昆虫神经毒性及其在制备神经毒性类制剂与杀虫剂中的应用可能，从而达到了本发明的发明目的。
[0009]本发明所选择的蜈蚁属于少棘蜈蚁(5: subspinipes,采自江苏省南京市。
[0010]本发明包括以下技术方案:
一种蜈蚣抗昆虫毒素多肽，具有SEQ ID NOl的氨基酸序列的多肽、或者其保守性变异多肽、或其活性衍生物。
[0011]该抗昆虫毒素多肽选自以下组之一:
(a)由SEQID NOl所示的氨基酸序列组成的多肽；
(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、添加或修饰而形成的具有相同功能的由(a)衍生的多肽。
[0012]一种多核苷酸，该多核苷酸包含有选自以下组之一的核苷酸序列:
(a)编码2中的多肽的多核苷酸；也就是说编码SEQID NOl中的氨基酸序列的核苷酸序列，以及编码与SEQ ID NOl所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NOl衍生的多肽；
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
[0013]所述多核苷酸具有如SEQ ID N02所示的核苷酸序列。
[0014]一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2，具有如SEQ ID N03所示的核苷酸序列。
[0015]一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2的表达纯化方法，包括如下步骤:
A，构建含有重组蜈蚣抗昆虫毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2或含有重组蜈蚣抗昆虫毒素基因 rScolotoxin_Ssm2.2 突变体基因的重组质粒 pSUM0-M-Scolotoxin_Ssm2.2;
B，将重组质粒pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2转化至宿主细胞中，得到含有重组质粒的工程菌株；
C，上述工程菌株经IPTG诱导，获得含有重组蜈蚣抗昆虫毒素的菌体；
D，将上述菌体清洗、离心、超声破碎，收集上清液；
D，将上清液反复通过Ni2+-1DA亲和层析柱纯化，得到融合蛋白；
E,上述融合蛋白经`过SUMO蛋白酶酶切，得到重组蜈蚣抗昆虫毒素多肽rScolotoxin-Ssm2b。
[0016]本发明还特别公开了重组表达载体pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2的具体合成方法:
首先，按照大肠杆菌的密码子偏好将蜈蚁毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2的cDNA序列优化，在该基因的5’端和3’端分别加入限制性内切酶Stu I和Xho I的酶切位点，采用化学合成法合成了全长的Scolotoxin-Ssm2.2成熟肽结构基因，经DNA测序证实合成的基因与设计的完全一致。
[0017]其次，通过限制性内切酶Stu I和Xho I双酶切法对载体pSUMO-Mutant进行酶切后得到线性化的载体pSUMO-Mutant。[0018]最后，利用DNA连接酶连接上述优化改造过的蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin_Ssm2.2和线性化的载体pSUMO-Mutant,得到重组表达载体pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2。
[0019]本发明同时还公开了上述步骤C的具体步骤为:将含重组质粒的工程菌株接种到LB培养液中，当工程菌培养液浓度OD6tltl达到0.6^1.0时，加入IPTG至终浓度0.5mol/L,于18°C表达6小时，获得含有重组蜈蚣抗昆虫毒素的菌体。
[0020]本发明进一步公开了步骤B中所述的宿主细胞是大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0021]采用这一宿主细胞后，本发明所公开的多肽的表达方法可以描述为:
(1)将重组表达质粒pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2转化大肠杆菌BL21 (DE3)；
(2)培养转化后的大肠杆菌BL21(DE3)；
(3)对培养后的大肠杆菌BL21(DE3)进行超声裂解，收集上清；上清液经Ni2+-1DA亲和层析柱层析纯化，得到重组融合蛋白；
(4)重组融合蛋白经SUMO蛋白酶酶切，得到目的多肽rScolotoxin-Ssm2b与标签SUMO蛋白的混合物；
(5)目的多肽rScolotoxin-Ssm2b与标签SUMO蛋白的混合物再次经Ni2+-1DA亲和柱层析纯化，得到重组毒肽rScolotoxin-Ssm2b。
[0022]上述多肽的表达方法使用重组表达载体pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2作为表达质粒，表达效率较高， 且优化了培养条件和纯化分离方式，有效提高了多肽rScolotoxin-Ssm2b 的表达量。
[0023]本发明通过鳞翅目、直翅目和蜚蠊目昆虫注射实验发现，一定浓度的多肽rScolotoxin- Ssm2b具有明显的昆虫神经毒性和杀虫效果。因此，多肽rScolotoxin_Ssm2b可应用于制备神经生物学研究的工具试剂和生物杀虫剂。
[0024]具体说:重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b在制备神经毒性类制剂中的应用；特别是重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b在制备杀虫剂中的应用。
[0025]进一步地，本发明限定了所述重组蜈蚣抗昆虫毒素rSC0l0t0Xin-Ssm2b中优选含有两对正确连接的共价二硫键。
[0026]在本发明中，“重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b”与“重组蜈蚣抗昆虫毒素”或者“重组蜈蚣抗昆虫多肽”可以互相替换使用。
[0027]在本发明中，所用的多肽片段、衍生物或者是类似物等属于是指基本保持本发明重组蜈蚣抗昆虫毒素生物学功能或者活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(I)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(2)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(3)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽，或(4)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列)。根据本文所述，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0028]本发明多核苷酸可以是DNA形式或者是RNA形式。
[0029]“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括你附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。[0030]本发明所公开的抗昆虫毒素是一个全新的多肽，同时其在杀虫剂以及神经毒性制剂中的用途具有极大的应用前景，可以用于制备神经生物学研究的工具试剂或生物杀虫剂，也可用于蜈蚣神经毒素空间结构及药理学活性等研究。
[0031]【专利附图】
【附图说明】
图1少棘蜈蚁抗昆虫毒素基因Scolotoxin_Ssm2.2的DNA序列测定图谱。
[0032]图2 重组蜈蚣抗昆虫毒素合成基因Scolotoxin-Ssm2.2与天然Scolotoxin-Ssm2.2基因及其编码的氨基酸序列比对图；其中
第一行为少棘蜈蚣天然毒素基因Sc0l0t0Xin-Ssm2.2的DNA序列，为了方便标示，仅给出与人工设计序列不同的碱基，其余未标出部分与第二行中的碱基相同；第二行为重组蜈蚣抗昆虫毒素合成基因rScolotoxin-Ssm2.2的DNA序列；第三行为对应的重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin_Ssm2b的多妝序列。
[0033]图3重组蜈蚁抗昆虫毒素合成基因rScolotoxin_Ssm2.2的DNA序列测定图谱。
[0034]图4表达载体pSUMO-Mutant的物理图谱和多克隆位点示意图。
[0035]图5重组表达载体pSUM0-M-Scolotoxin_Ssm2.2的构建流程。
[0036]图6重组表达载体pSUM0-M-Scolotoxin_Ssm2.2的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图。
[0037]图中M:分子量标记；1:重组质粒Xhol/Xbal酶切结果。
[0038]图7经过IPTG诱导的工程菌表达融合蛋白的SDS-PAGE分析图谱
图中M:分子量标记；1:未诱导菌总蛋白；2、3:诱导菌总蛋白；4:诱导菌超声沉淀；5:诱导菌超声上清。
`[0039]图8重组融合蛋白与目标多肽rScolotoxin_Ssm2b分离的SDS-PAGE分析图谱 图中M:分子量标记；1:超声上清；2:镍柱纯化上样流出液；3:镍柱纯化洗脱液；4:酶
切混合液；5:酶切液再过柱的流出液(目标肽)；6:酶切液再过柱的洗脱液(标签蛋白)。
[0040]
【具体实施方式】
[0041]以下结合具体实施例，进一步说明本发明的技术方案。应理解，以下实施例只用于说明本发明而不以任何形式限制本发明。
[0042]实施例1:蜈蚣毒腺总RNA的提取与毒素cDNA克隆及序列测定
活体解剖分离蜈蚣毒腺并立即投入液氮中。于液氮中磨碎毒腺后，用Trizol Reagent(Invitrogen)试剂盒提取总 RNA,按 SMART? cDNA Library Construction Kit 说明书操作进行cDNA第一链合成，LD- PCR扩增合成第二链，蛋白酶K消化、SfiI酶切和柱回收cDNA,与载体λ TriplEx2连接、包装。带有插入片断的载体通过电转化导入万.co7i DHlOB感受态细胞，SOC培养基37°C IhlOOrpm恢复，涂于带有诱导剂IPTG和X-Gal显色剂的琼脂培养基上培养过夜。挑取白斑，PCR快速鉴定插入片断大小。检验合格的cDNA文库大规模培养，标准碱裂解法提取模板，ABI 3730测序仪测序，获得中国江苏少棘蜈蚣毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2cDNA序列，测序结果参见附图1。
[0043]实施例组2
实施例2-1重组表达载体pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2的构建 (I) Scolotoxin-Ssm2.2基因的优化与合成按照大肠杆菌的密码子偏好将蜈蚣毒素基因Sc0l0t0Xin-Ssm2.2的cDNA序列优化，并在该基因的5’端和3’端分别加上限制性内切酶Stu I和Xho I的酶切位点，合成出全长的Scolotoxin-Ssm〗.2成熟肽结构基因，其核苷酸序列与天然毒素的核苷酸序列比对参见附图2。
[0044](2)重组表达载体 pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2 的构建:
将合成的Scolotoxin-Ssm2.2DNA经限制酶Stu 1、XhoI双酶切后连接到表达载体pSUMO- Mutant中，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，测序。结果正确，说明克隆成功，得到重组 表达载体pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2，重组基因序列参见附图3。
[0045]实施例2-2重组蜈蚁抗昆虫毒素rScolotoxin_Ssm2b的高效原核表达
(I)重组蜈蚣抗昆虫毒素融合蛋白的表达
制备大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，将测序正确的重组表达载体pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2利用热休克法(42°C热激45秒)转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，得到含有重组质粒的工程菌株，其构建基础及构建流程参考图4与图5，构建结果检测参见图6。
[0046]挑取工程菌株单菌落接种于Kan + LB液体丰富培养基中，37°C振荡培养过夜。次日取该过夜菌按1: 100体积比接种于新鲜的Kan+LB丰富培养基中，37°C剧烈振荡放大培养至OD6c?约为0.6，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，于18°C诱导表达6h。诱导结束后，4°C、10, OOOrpm 离心 IOmin,收菌。
[0047]所得菌体用预冷的PBS缓冲液(pH7.4)洗涤菌体一次，离心，再用预冷的LysisBuffer (50mmol/L NaH2P04，300mmol/LNaCl，10mmol/L 咪唑，pH 8.0)以 1: 10 的比例重悬。以200W功率在冰浴中超声20 min破碎细菌细胞。超声结束后，用4°C、12，OOOg离心20min,收集含重组融合蛋白的上清。含空载质粒pSUMO-M的对照菌株BL21 (DE3)同样处理，收集含标签蛋白的上清。SDS-PAGE电泳检测到该基因的表达产物占全菌蛋白的27.66%，电泳结果见附图7。
[0048](2)重组蜈!I公抗昆虫毒素rScolotoxin_Ssm2b的制备 (2.1)重组蜈蚣抗昆虫毒素融合蛋白的亲和层析
采用Biologic LP层析系统将上清液以0.5 ml/min流速上样至Ni2+-1DA BindingBuffer (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 5 mM imidazole, 6 M guanidine-HCl, pH8.0)预平衡的 Ni2+-1DA Sepharose CL-6B 亲和层析柱(0.8 cmX 2 cm);用 Ni2+-1DA BindingBuffer以0.5 ml/min流速冲洗，至流出液OD28tl值到达基线，收样留以电泳，参看附图8 中的第一泳道；用 Ni2+-1DA Washing Buffer (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 20 mMimidazole, pH8.0)以0.5 ml/min流速冲洗,至流出液OD28c!值到达基线，收样留以电泳，参看附图 8 中的第二泳道；用 Ni2+-1DA Elution Buffer (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl,250 mM imidazole, pH8.0)以0.5 ml/min流速冲洗,至流出液OD28c!值到达基线，收样。通过上述亲和层析步骤对上述重组融合蛋白作进一步纯化，收集，多次纯化后产品参看附图8中的第三泳道。对照样品同样处理获得纯化后的标签蛋白——SUMO蛋白。
[0049](2.2)重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b的制备
取上述收集的重组融合蛋白按20:1 (V/V)比例加入SUMO蛋白酶，30°C切割半小时，混合液参看附图8中第四泳道，获得目标多肽一重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin- Ssm2b多肽(附图8中的第五泳道)及SUMO标签蛋白的混合物(见附图8中的第六泳道)。对照样品同样处理，仅含标签SUMO蛋白。
[0050]实施例3重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b对鳞翅目模式昆虫家蚕的毒性鉴定
基本方案:体腔注射法。本实施例中通过对鳞翅目模式昆虫家蚕幼虫的体腔注射实验鉴定由蜈蚁抗昆虫毒素基因Scolotoxin_Ssm2.2编码的多肽rScolotoxin_Ssm2b的昆虫神
经毒性。
[0051]实验步骤:实验对象为鳞翅目模式昆虫家蚕多化性品种大造(由中国农业科学院蚕业研究所张国政研究员提供)的五龄幼虫，每组30头，重复3次。待测药品为过滤除菌的rScolotoxin_Ssm2b多肽与SUMO标签蛋白的混合物,其中的多肽rScolotoxin_Ssm2b的工作浓度为10 ug/ml，对照试剂为同样处理的SUMO标签蛋白。从蚕体第8和第9腹节右侧的节间膜处注入试药10 μ I后，观察并记载虫体的活动状况，统计死亡数量，计算死亡率。
[0052]结果分析:注入毒液后10秒内，蚕体即剧烈扭转、痉挛，迅速吐液，持续数分钟后，家蚕头胸伸出、躯体收缩、肛门拖粪、腹足失去抓握力而侧翻倒地、软瘫至死。其中的多数个体于2小时内中毒死亡；24小时3个给药组的死亡率皆达100% (表1)。而注射SUMO标签蛋白的对照组家蚕仅在注射后数分钟内静伏，I小时后全部恢复正常爬动，无任何中毒症状；24小时内也无一死亡。由此可得，多肽rScolotoxin_Ssm2b对鳞翅目模式昆虫家蚕具有显著的神经毒性及致死作用，可用于制备神经生物学研究的工具试剂及生物杀虫剂。
[0053]表1 rScolotoxin_Ssm2b对家蚕幼虫的神经毒性与致死性
【权利要求】
1.一种抗昆虫毒素多肽，其特征是:具有SEQ ID NOl的氨基酸序列的多肽、或者其保守性变异多肽、或其活性衍生物。
2.根据权利要求1所述的抗昆虫毒素多肽，其特征在于:该抗昆虫毒素多肽选自以下组之一: (a)由SEQID NOl所示的氨基酸序列组成的多肽； (b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、添加或修饰而形成的具有相同功能的由(a)衍生的多肽。
3.—种多核苷酸,该多核苷酸包含有选自以下组之一的核苷酸序列: Ca)编码权利要求2的多肽的多核苷酸； (b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征是所述多核苷酸具有如SEQID N02所示的核苷酸序列。
5.一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2，其特征是具有如SEQ ID N03所示的核苷酸序列。
6.一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2的表达纯化方法，其特征是包括如下步骤: A，构建含有重组蜈蚣抗昆虫毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2或含有重组蜈蚣抗昆虫毒素基因 rScolotoxin_Ssm2.2 突变体基因的重组质粒 pSUMO-M-Scolotoxin- Ssm2.2; B，将重组质粒pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2转化至宿主细胞中，得到含有重组质粒的工程菌株； C，上述工程菌株经IPTG诱导，获得含有重组蜈蚣抗昆虫毒素的菌体； D，将上述菌体清洗、离心、超声破碎，收集上清液； D，将上清液反复通过Ni2+-1DA亲和层析柱纯化，得到融合蛋白； E,上述融合蛋白经过SUMO蛋白酶酶切，得到重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b0
7.根据权利要求6所述的重组蜈蚣抗昆虫毒素基因rScolotoxin-Ssm〗.2的表达纯化方法，其特征是选自以下任一或任意几个优选条件: (1)所述步骤C的具体步骤为:将重组质粒的工程菌株接种到LB培养液中，当工程菌培养液浓度OD6tltl达到0.6^1.0时，加入IPTG至终浓度0.5mol/L,于18°C表达6小时，获得含有重组蜈蚣抗昆虫毒素的菌体； (2)步骤B中所述的宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。
8.根据权利要求6至7中任意一项所述的重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2.2基因的表达纯化方法得到的重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b。
9.重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b在制备神经毒性类制剂中的应用；特别是重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b在制备杀虫剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b在制备神经毒性类制剂中的应用，其特征是所述重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b中含有两对正确连接的共价二硫键。
【文档编号】A01N47/44GK103724411SQ201310443624
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年9月26日 优先权日:2013年6月21日
【发明者】华卫建 申请人:江苏教育学院