少棘蜈蚣抑瘤肽scolopept及其cDNA和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及少棘蜈蚣抗肿瘤多肽scolopept及其cDNA和重组应用，属于生物基因工程领域。少棘蜈蚣抑瘤肽scolopept具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。其克隆方法如下：根据从少棘蜈蚣毒液中分离纯化的抑瘤肽scolopept氨基酸序列设计兼并引物；从少棘蜈蚣毒腺提取总RNA；通过RT-PCR方法，一步扩增出全长cDNA序列，克隆入pMDPmd18-T载体，挑取阳性克隆进行测序。所述少棘蜈蚣抑瘤肽scolopept的cDNA可通过现有基因工程方法，生产重组scolopept，开发新型抗癌药物。
【专利说明】少棘暢蚁抑瘤化scolopept及其cDNA和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物基因工程领域，具体设及少棘蚊蚁抑肿瘤肤cDNA及其克隆、表达 技术。
【背景技术】
[0002] 目前癌症治疗一般采用化学疗法和放射疗法，可W有效清除残留肿瘤细胞，防止 肿瘤的复发与转移，但其本身存在严重的毒副作用，在杀伤肿瘤细胞的同时，对人体正常细 胞伤害较大，并且可能使祀细胞产生不敏感性和耐药性。而一些多肤类作用于肿瘤细胞的 机制不同，可W特异性杀伤肿瘤细胞，对正常细胞无毒副作用或作用较小，而且未发现耐药 性。所W寻找作用于肿瘤细胞不同祀点的肤类，开发新一代抗癌药物，是目前癌症治疗研究 的热点。
[0003] 到目前为止，国外已有36种多肤类抗癌药物上市，我国临床上利用尿酸多肤治疗 乳腺癌，胸腺五肤辅助治疗急性白血病、晚期非小细胞肺癌和肾癌等，胸腺肤a 1治疗非霍 奇金淋己瘤、晚期非小细胞肺癌和白血病等多种癌症，但后两者药物主要是作为免疫增强 剂使用，并非专口抑制肿瘤细胞增殖或者促进其调亡的祀向性药物。
[0004] 本发明从少棘蚊蚁毒液中分离纯化出一种抑制肿瘤细胞增殖并促进其调亡的多 肤，命名为抑瘤肤scolop巧t，并测定其氨基酸序列。检索SWISS-PROT、TrEMBL、PIR、MIPS 和ExPASy等国际蛋白质一级序列数据库，均未收录此肤序列；检索GenBank、EM化和孤BJ 等S大核酸序列数据库可知，少棘蚊蚁抑瘤肤scolopept的cDNA全长序列未被克隆，关于 少棘蚊蚁抑制肿瘤肤基因研究在国内外尚属空白。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种从少棘蚊蚁毒腺提取的抑瘤肤，并提供少棘蚊蚁抑瘤肤 scolopept的cDNA的克隆方法及重组技术。
[0006] 本发明从少棘蚊蚁毒液中纯化所得抑瘤肤scolopept,它具有SEQ ID NO. 1所示的 氨基酸序列；从少棘蚊蚁毒腺中克隆到scolop巧t cDNA，它具有SEQ ID NO. 2所示的序列。
[0007] 本发明少棘蚊蚁抑瘤肤scolopept的纯化分离方法如下；
[0008] 电刺激蚊蚁获得毒液粗品，用VIVASPIN 0. 5ml CONCENTRATOR VIVASCIENCE〇3etter life science by design, Sartorius AG，Germany)浓缩并截留 3, 000-5, 000化的多肤及蛋白组分；阴离子交换层析，收集21. 436min峰；凝胶过滤层析，收 集 17. 221min 峰；反相 HPLC，只见一个峰 21. 920min，冻干保存；MALDI-TOF-MS 炬RUKER 公 司，REFLEXTM III)测定分子量为3016D ;E血an降解和串联质谱结合测定氨基酸序列（岛 津PPSQ-31A蛋白自动测序仪）。
[0009] 本发明少棘蚊蚁抑瘤肤scolop巧t的cDNA的克隆方法如下；
[0010] (1)根据纯化所得scolopept氨基酸序列设计引物：
[OCm]正义寡核巧酸兼并引物 pSCOl ;5' -AAA(/G)ATT(/C/A)CTAAAA(/G)CTATTT(/C) CAT(/C)ATGAGAGGTGTT-3'
[0012] 反义寡核巧酸兼并引物 pSC02 ;5' -ATGACCC(/T)CTTAGAGTC(/T)TTAGAC(/T) CTCATCTTCTTAGT-3^
[0013] (2)从少棘蚊蚁毒腺提取总RNA。
[0014] (3)应用上述引物pSCOl和pSC02,进行RT-PCR扩增，扩增产物克隆入pMDlS-T载 体，挑取阳性克隆进行碱基序列测定。
[0015] (4)根据测序结果，分析氨基酸序列，序列与scolopept匹配的克隆作为特异性扩 增的模板。
[0016] 妨根据上述模板的cDNA序列，设计含有SUMO酶切位点的首尾引物；
[0017] SCI ;5' -TAAGATACTAAAACTATTTCA-3'(斜体部分为 Stu I 酶切位点）
[0018] SC2 ;5' -CCCAAGCTTTCAATGACCTCTT-3'(斜体部分为 Hind III酶切位点）
[0019] PCR扩增SUMO-scolopept cDNA序列，克隆入PMD18-T载体，挑取阳性克隆进行碱 基序列测定。
[0020] 上述SUMO-scolopept cDNA的克隆方法具体操作如下；
[0021] (1)根据纯化所得scolopept氨基酸序列，设计克隆的正义寡核巧酸兼并引物 pSCOl ;5 ' -AAA (/G) ATT (/C/A) CTAAAA (/G) CTATTT (/〇 CAT (/〇 ATGAGAGGTGTT-3 ' 和反义寡核 巧酸兼并引物 pSC02 ; 5 ' -ATGACCC (/T) CTTAGAGTC (/T) TTAGAC (/T)
[0022] CTCATCTTCTTAGT-3> ;
[002引 似利用RNA抽提试剂TRIzoUinvitrogen公司），按照操作手册，提取少棘蚊蚁 毒腺总RNA。
[0024] (3)应用RT-PCR方法，应用上述引物pSCOl和PSC02为特异性引物，扩增出cDNA的 序列，克隆入PMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定。RT-PCR的反应条件为；W总RNA为 模板，在50 y 1反应体系中，加入5 X RT-PCR反应缓冲液10 y 1、25mM M拆〇42 y 1、lOmMdNTP 混合物lyl、20uM的上下游引物各2. 5yl、AMV逆转录酶（Takara公司）lyl、TflDNA聚 合酶lyl及RNA模板2yl，补水至50yl。RT-PCR循环参数为；50°C 30min反转录反应， 94°C 2min 变性，30 个 PCR 循环（94°C变性 30s，53°C退火 30s，72°C延伸 Imin)，最后 72°C解 育lOmin。RT-PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离后，用胶回收试剂盒回收基因片段， 置4°C保存。
[0025] (4)根据测序结果，分析氨基酸序列，与从少棘蚊蚁毒液中分离纯化的scolopept 氨基酸序列匹配的克隆作为特异性扩增的模板。
[0026] (5)根据上述模板的cDNA序列，设计含有SUMO酶切位点的首尾引物；SCI ;
[0027] 5' -TAAGATACTAAAACTATTTCA-3'(斜体部分为 Stu I 酶切位点）和 SC2 ;
[0028] 5' -CCCAAGCTTTCAATGACCTCTT-3'(斜体部分为 Hind III酶切位点），PCR 扩增
[0029] SUMO-scolopept cDNA序列，反应条件为；W上述scolop巧t克隆为模板，在50 反应体系中，加入10XPCR反应缓冲液5yl、25mM MgS〇42yl、10mM dNTP混合物4yl、20yM 的上下游引物各2yl、P化DM聚合酶0. 5yl及模板2yl，补水至50yl。PCR循环参数 为；50°C 30min反转录反应，94°C 5min变性，30个PCR循环巧4°C变性30s，50°C退火30s， 72°C延伸20s)，最后72°C解育7min。克隆入PMD18-T载体，挑取阳性克隆进行碱基序列测 定，并构建SUMO-scolopept重组质粒，转化大肠杆菌化21。
[0030] 对该基因的进一步研究表明：该基因的重组融合蛋白具有抑制白血病细胞K562 和肝癌细胞化pG2增殖，促进该些细胞调亡的高活性功能，并且对于正常组织细胞无毒副 作用。
[0031] 本发明还公开了少棘蚊蚁抑瘤肤scolopept或其cDNA在制备治疗白血病和肝癌 的药物中的应用。
[0032] 上述少棘蚊蚁抑瘤肤scolop巧t的cDNA的重组应用，通过现有基因工程方法，生 产重组抑瘤肤，可W开发新型抗癌药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1(a)是少棘蚊蚁抑瘤肤scolop巧t全长cDNA碱基序列，全长cDNA共72bp ;化） 是少棘蚊蚁抑瘤肤scolopept氨基酸序列，共25Aa。
[0034] 图 2 是 MALDI-TOF-MS 测定抑瘤肤 scolopept 分子量为 3016D。
[0035] 图3是融合蛋白SUMO-scolopept经过诱导表达纯化后，使用SUMO特异性蛋白酶 进行切割，Tricine/SDS - PAGE检测，获得3邸scolopept和SUMO标签，经Ni柱层析，纯化 得到SUMO-scolopept重组蛋白。（a)是SUMO蛋白酶酶切融合蛋白；化）是亲和层析获得重 组目的scolop巧to
[0036] 图4是使用MIT细胞活性检测方法对本发明克隆的基因表达产物对白血病细胞 K562和肝癌细胞化pG2作用结果。实验中，scolopept对两种细胞都表现出浓度依赖抑制 增殖作用，scolopept处理K562细胞，IC50为25 y M ;在HepG2细胞中，IC50为50 y M。
[0037] 图5是流式检测scolopept对K562和化pG2细胞调亡的作用。使用流式细胞仪检 测J scolopept抑制细胞增殖的方式，通过Annexin V和舰化丙晚（PI)双染发现，scolopept 是通过调亡作用抑制细胞增殖的。40 uM scolopept可W明显的引起21.4%的K562细胞 调亡。在化pG2细胞中，存在相似作用。
[003引图6所示scolop巧t的溶血作用及对肝、肾及血管内皮细胞的毒性作用。在实验 用量范围内，无溶血性，当scolopept浓度加大至远高于IC50的120 yM时，出现30%溶血。 用scolopept对原代小鼠肝细胞、人胚肾细胞肥K293进行MTT实验，在120 y M时对原代小 鼠肝细胞仅有20%的杀伤率；对人胚肾细胞肥K293也仅有18%，说明对肝和肾仅有很小 的毒副作用。scolopept具有选择性杀伤肿瘤细胞的作用，其作用于正常细胞的浓度要远 小于其作用于恶性肿瘤细胞的浓度。加入scolopept后，人厮静脉内皮细胞（HUVECs)存活 率的变化。scolopept在40 y M时对内皮细胞造成74%的杀伤率，与对照相比，有显著性差 异（P<0. 05)，说明scolop巧t能够抑制血管生成，并且随着浓度的增加，抑制效果越明显， scolopept通过抑制血管内皮细胞的增殖，减少对肿瘤细胞的血液供给，从而达到抑瘤的目 的。
【具体实施方式】
[0039] 本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理 解的含义。
[0040] 下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发 明。应理解，该些实施例只是为了举例说明本发明，而非W任何方式限制本发明的范围。
[0041] 在W下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均W首次标明的内容相同。
[0042] 实施例1 ;
[004引 少棘蚊蚁（Scolopen化a subspinipes mutilans)，人工饲养。
[0044] 电刺激蚊蚁获得毒液粗品，用VIVASPIN 0. 5ml CONCENTRATOR VIVASCIENCE〇3etter life science by design, Sartorius AG，Germany)浓缩并截留 3, 000-5, 000化的多肤及蛋白组分，此组分依次进行柱层析分离：阴离子交换层析，收集 21. 436min峰；凝胶过滤层析，收集17. 221min峰；反相HPLC，获得一个峰21. 920min，冻干 保存；MALDI-TOF-MS炬RUKER公司，R邸LEXTM III)测定分子量为3016D(图2) ;E血an降解 和串联质谱结合测定氨基酸序列（岛津PPSQ-31A蛋白自动测序仪）；该多肤的氨基酸序列 如SEQ ID NO. 1所示，将该多肤命名为抑瘤肤scolop巧t (图1化)）。
[0045] 实施例2 ;
[0046] 克隆抑瘤肤scolopept的cDNA序列；
[0047] (1)引物设计；根据实施例1纯化所得scolopept氨基酸序列，设计克隆的 正义寡核巧酸兼并引物 pSCOl ;5 ' -AAA (/G) ATT (/C/A) CTAAAA (/G) CTATTT (/〇 CAT (/〇 ATGAGAGGTGTT-3'（SEQ ID NO. 3)和反义寡核巧酸兼并引物 pSC02 ;5' -ATGACCC(/T) CTTAGAGTC(/T)TTAGAC(/T)CTCATCTTCTTAGT-3'（SEQ ID NO. 4)。
[0048] 似提取总RNA ;利用RNA抽提试剂TRIzoUinvitrogen公司）按照操作手册提取 出约少棘蚊蚁毒腺的总RNA，并通过甲醒变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，紫外分光 光度计测定其浓度。
[0049] (3)应用RT-PCR方法，W上述pSCOl和PSC02为特异性引物，扩增出少棘蚊蚁抑瘤 肤scolopept cDNA序列，克隆入pMDlS-T载体（Takara公司），并对其碱基序列进行测定。 RT-PCR的反应条件为；W总RNA为模板，在50 y 1反应体系中，加入5 X RT-PCR反应缓冲液 10 y l、25mM MgS〇42 y l、10mM dNTP 混合物 1 y 1、20 y M 的上下游引物各 2. 5 y 1、AMV逆转录 酶（Takara公司）1 y 1、Tf IDNA聚合酶1 y 1及RNA模板2 y 1，补水至50 y 1。RT-PCR循环 参数为；50°C 30min反转录反应，94°C 2min变性，30个PCR循环（94°C变性30s，53°C退火 30s，72°C延伸Imin)，最后72°C解育lOmin。RT-PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离 后，用胶回收试剂盒回收基因片段，置4°C保存。
[0化0] (4)根据挑选不同克隆测序结果，分析氨基酸序列，与从毒腺中分离纯化的天然 scolopept氨基酸相匹配的克隆即为本发明所得scolop巧t cDNA序列，如SEQ ID NO. 2(图 1(a)) 〇
[0化1] 实施例3 ;原核表达抑瘤肤scolopept ;
[0化2] (1)可溶性SUMO-scolopept重组载体的构建；
[0化3] W上述得到的scolop巧t cDNA作为特异性扩增的模板。根据上述模板的cDNA序 列，设计含有 SUMO 酶切位点的首尾引物；SCI ;5' -TAAGATACTAAAACTATTTCA-3' (SEQ ID NO. 5)(斜体部分为 Stu I 酶切位点）和 SC2 ;5' -CCCAAGCTTTCAATGACCTCTT-3' (SEQ ID NO. 6)(斜体部分为化nd III酶切位点）。PCR扩增SUMO-scolopept cDNA序列，反应条件为； W上述scolop巧t克隆为模板，在50 y 1反应体系中，加入10XPCR反应缓冲液5 y l、25mM MgS〇42yl、10mM dNTP混合物4yl、20yM的上下游引物各2yl、Pfu DM聚合酶0.5yl及 模板2y 1，补水至50y 1。PCR循环参数为；50°C 30min反转录反应，94°C 5min变性，30个 PCR循环（94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸20s)，最后72°C解育7min。克隆入pMDlS-T 载体，挑取阳性克隆进行碱基序列测定。
[0054] 将pSUMO的空质粒菌D册a接种于3mL液体LB中（含卡纳霉素终浓度为50ug/ mL)，37°C振荡，并过夜培养；用AxyGEN质粒提取试剂盒，提取并纯化pSUMO质粒；StuI和 Hindlll分别双酶切PCR产物和pSUMO ;载体去磯酸化和目的基因磯酸化；反应体系于37°C 水浴30nim之后，70°C水浴lOmin灭活。反应后，1%琼脂糖胶电泳检测，确定连接比例；在 16°C水浴条件下连接过夜。
[0化5] (2)在大肠杆菌中的诱导表达：
[0056] 取100 y L感受态细胞畑5 a、10 y L的上述连接产物混合，在冰上放置30min后， 42°C水浴90s，快速放冰上5min，加入900 y L LB培养基（经37°C预热的），振荡培养1小 时后，离屯、、浓缩至lOOyL左右，涂布于固体LB平板上（50yg/ml卡那霉素），37°C倒置培 养16小时。将菌落PCR鉴定为阳性克隆的SUMO-scolop巧t/D册a菌株进行测序。
[0化7] 将测序正确的SUMO-scolopept重组质粒0. 5 y 1加入100 y 1的大肠杆菌化21感 受态细胞，轻轻混匀后，在冰上静置30min。化21感受态细胞在42°C热激90S后，立即于冰 上2min。加入37°C预热的LB培养基890 y 1，37°C摇比。8000巧m离屯、Imin，吸取800 y 1 的上清液，其他一起混匀。吸取混悬液200 y 1于平板上，均匀涂布，置于37°C培养箱16h。 挑取单菌落，溶于3ml LB，再加入3yl 50mg/ml的卡纳抗生素后，37°C培养4-8小时，进行 菌落PCR W确定阳性克隆。
[0化引 （3)重组目的蛋白SUMO-scolopept的Ni+亲和纯化；
[0化9] 将IPTG诱导含有目的重组蛋白的大肠杆菌培养液。于12000g室温离屯、lOmin， 弃上清。取沉淀，用20ml平衡液1 (0. 5M化C1，20mM Tris，20mM咪挫）重悬，冰上超声破 碎（工作10s，暂停10s，共99次）表达菌体，4°C，13,000 Xg，20min离屯、超声破碎液后，弃 沉淀，收集上清，待过镶柱。简要过程是；3体积binding buffer平衡镶柱，洗脱液1 (0. 5M 化C1，20mM Tris，lOOmM 咪挫）洗脱，接着洗脱液 2 (0. 5M 化C1，20mM Tris，250mM 咪挫）洗 脱。用20mM Tris(p服.0)透析蛋白液，-70°C保存。
[0060] 将上述纯化后的SUMO-scolopept蛋白与SUMO蛋白酶W l:l〇〇(v/v)比例加入 1. 5ml的离屯、管，30°C的水浴锅中水浴1小时；将酶切混合物按照W上纯化步骤，再进行一 次Ni柱亲和层析，收集流出液；W SDS-PAGE及毛细管电泳分析纯度并W紫外分光光度计检 测蛋白浓度，如图3所示，纯化得到纯度达95%的活性目的蛋白。
[0061] (4)对肿瘤细胞增殖的抑制作用和促进调亡作用实验
[0062] 在含10%胎牛血清的1640培养基中培养K562细胞，含10%胎牛DMEM培养基中 培养化pG2细胞；细胞达到80%饱和度时，收集细胞，用1 %血清培养基稀释到105浓度， 种96孔板，0. 2ml/孔；化后，加入不同浓度的scolop巧t，于37°C培养24小时。每孔加 入20 y LMTT巧mg/ml)，继续培养化，1000巧m离屯、lOmin ;小屯、弃掉上清，每孔加入150M1 DMS0,振荡，直到紫色结晶充分溶解；用酶联免疫检测仪在490nm下检测个孔的吸光值。实 验结果如图4所示，scolopept对两种细胞都表现出浓度依赖抑制增殖作用，scolopept处 理K562细胞，IC50为25 y M ;在化pG2细胞中，IC50为50 y M。
[006引通过Annexin V和舰化丙晚（PI)双染发现，scolopept是通过调亡作用抑制细胞 增殖的。如图5,40yM scolopept可W明显的引起21.4%的K562细胞调亡。在化pG2细 胞中，存在相似作用。
[0064] (5)对人体正常细胞和血管内皮细胞增殖的影响
[00化]如图6所示，在实验用量范围内，scolopept无溶血性，当浓度加大至远高于IC50 的120^1时，出现30%溶血。用8(：〇1〇口6口*对原代小鼠肝细胞、人胚肾细胞肥1(293进行 MIT实验，在120 y M时对原代小鼠肝细胞仅有20 %的杀伤率；对人胚肾细胞肥K293也仅有 18%，说明对肝和肾仅有很小的毒副作用。scolopept在40 y M时对内皮细胞造成74%的 杀伤率，与对照相比，有显著性差异（P<〇. 05)，说明scolopept能够通过抑制血管内皮细胞 的增殖，减少对肿瘤细胞的血液供给，从而达到抑瘤的目的。
[0066] 实施例4 ;
[0067] 将实施例2获得的蚊蚁抑瘤肤scolopept的cDNA通过现有基因工程方法，生产重 组scolop巧t，作为抗癌药物开发利用。
[0068] 按照本发明的方法可W通过现有基因工程技术，修饰蚊蚁抑瘤肤scolopept基因 并用于所述研究和生成。
【权利要求】
1.少棘蜈蚁抑瘤肽scolopept，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。 2?少棘蜈蚣抑瘤肽scolop印t的cDNA，其特征在于，是SEQ ID NO. 1所示的序列。
3.权利要求1所述的少棘蜈蚣抑瘤肽scolopept在制备治疗白血病及肝癌的药物中的 应用。 4?权利要求2所述少棘蜈蚁抑瘤肽scolopept的cDNA的重组应用，其特征在于，通过 基因工程方法生产重组少棘蜈蚣抑瘤肽scolop印t，用于制备治疗白血病及肝癌的多肽类 药物。
【文档编号】C12N15/12GK104447972SQ201410666057
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月19日 优先权日:2014年11月19日
【发明者】任文华, 张双全 申请人:南京师范大学