隆 接种到LB液体培养基（SOyg/ml卡那霉素、lOyg/ml四环素、7yg/ml庆大霉素）， 250rpm，37°C培养过夜，收集并提取含植酸酶aPPA基因与多角体蛋白共表达的重组质粒 Bacmid-polyhedrin-aPPA ；
[0037] 根据 Cellfectin 转染试剂说明书，将 2 μ g 重组质粒 Bacmid-polyhedrin-aPPA、 2 μ I CelIfectin转染试剂与100 μ 1不含抗生素无血清昆虫细胞培养基（Gibco sf-900II SFM)混勾，室温下孵育45min，转染处于对数生长期的sf9细胞，置28°C培养5h后吸去转染 混合物，加入含抗性（青霉素0. 008g/100ml，链霉素终浓度0. 01g/100ml)和血清的昆虫细 胞培养基中继续培养72h以上，出现病变后，即细胞内充满颗粒，细胞附着力减弱，开始脱 壁上浮并个别细胞解体成颗粒状物散落细胞培养液中，观察细胞内多角体的产生以及荧光 下观察多角体内的aPPA的包裹情况并计数，并收集细胞上清为Pl代病毒液。以此为毒种， 再去感染sf9细胞以扩增病毒，收获病毒液为P2代病毒。
[0038] 经包装后的重组杆状病毒感染72h后，观察感染细胞内有多角体产生情况（如图1 至图 3 所不）；其获得的 Bacmid-polyhedrin-aPPA 病毒和 Bacmid-polyhedrin-EGFP-aPPA 病毒在细胞内产生大量的多角体颗粒，而正常细胞没有发现多角体颗粒。
[0039] D、多角体提取纯化
[0040] Sf9细胞培养24h后，用经包装后的重组杆状病毒Bacmid-polyhedrin-aPPA、包装 后的重组杆状病毒Bacmid-polyhedrin-EGFP-aPPA和未经过包装的重组杆状病毒Bacmid 分别感染，120h后以500r/min离心收集感染细胞；用约5?10倍感染细胞的体积量的 PBS (20mmol/L NaH2PO4, 20mmol/L Na2HPO4,150mmol/L NaCl ;ρΗ7· 2)悬浮后超声波破碎 3 ? 5min，1000r/min离心5min，收集上清；再用10000r/min离心收集多角体。
[0041] 将 Percoll (Pharmacia 公司）与 PBS 按 9:1 的体积比混合，调 pH 至 7. 2,12000r/ min离心20min收集纯净的多角体。
[0042] 将纯化的多角体悬浮于含0. 1% SDS的PBS缓冲液中，室温放置5min，然后用PBS 洗涤2次得到最终纯化的多角体，即得到多角体蛋白包裹型植酸酶。
[0043] 抽提纯化后多角体，涂片进行显微镜拍照观察，观察多角体内的蛋白被包裹情况 (如图4至图6所示）；Bacmid-polyhedrin-EGFP-aPPA感染的细胞，用上述方法分离提取 纯化，发现大量的多角体颗粒，也能观察到焚光；Bacmid-polyhedrin-aPPA感染的细胞中 也能发现大量的多角体颗粒，表明植酸酶在细胞产生大量的多角体颗粒并且可以高效率包 裹。
[0044] E、多角体中融合蛋白表达分析
[0045] 以未经过包装的重组杆状病毒Bacmid感染的细胞为阴性对照，用包装后的重组 杆状病毒 Bacmid-polyhedrin-aPPA 和重组杆状病毒 Bacmid-polyhedrin-EGFP-aPPA 感染 昆虫细胞Sf9。培养96h后，收获感染的细胞。SDS-PAGE检测发现，Sf9细胞经重组杆状病 毒感染后，要比未经过包装的重组杆状病毒Bacmid病毒感染后多两条蛋白质条带（如图7 所示），其中一条带是相同大小，另一条在重组杆状病毒Bacmid-polyhedrin-EGFP-aPPA中 约72KD，比在重组杆状病毒Bacmid-polyhedrin-aPPA中条带约45KD要大。
[0046] F、植酸酶的酶活性分析
[0047] I、植酸酶的酶活测定
[0048] 利用植酸酶可以水解植酸钠释放出无机磷的原理，通过加入酸性钼-钒试剂使水 解反应停止，同时与水解释放出的无机磷产生颜色反应，形成黄色的钒钼络合物，在415nm 波长测定磷的含量。以标准磷为参照物，计算被测样品中植酸酶的含量。植酸酶的含量以 酶活性单位表示，在温度37°C、pH5. 5的条件下，每分钟从浓度为5. Ommol/L植酸钠溶液中 释放I μ mol无机磷，即为1个植酸酶活性单位，以U表示。
[0049] 用经提取纯化获得的多角体颗粒为样品，按国家标准GB/T18634-2009《饲用植酸 酶活性的测定分光光度法》方法，测定多角体包裹植酸酶的多角体颗粒酶活，活性达到U/ (5*105)颗粒，也就是5万个包裹植酸酶的多角体颗粒的酶活相当国际通用1个植酸酶活性 单位的酶效。
[0050] 2、热稳定性的测定
[0051] 将多角体包裹植酸酶的多角体颗粒和植酸酶（EKEAR CAS号：9001-89-2 ;纯 度：50units/mg solid)分别在 60°C、70°C、80°C下保温 30min 或者是在 85°C、90°C下保温 IOmin后在37°C、pH5. 5测定酶活性，以不进行热处理的多角体颗粒的酶活性为100%，其他 条件下的酶活占最高酶活的百分数即为该酶在此温度条件下的相对酶活。每个反应设3次 重复，以植酸酶相对活性（％)为纵坐标，不同的反应温度为横坐标绘制曲线。如图8所 示，植酸酶appA在70°C处理30min的条件下，酶活力仅仅降低6%。随着处理温度的不断 升高残余的酶活力不断下降。在90°C处理IOmin后酶活保留在90%，说明多角体包裹的植 酸酶appA有很好的耐热性。
[0052] 3、pH耐受性的测定
[0053] 用不同pH(l. 0-8. 5)的缓冲液在37°C下分别处理包裹植酸酶颗粒和植酸酶 (EKEAR CAS 号：9001-89-2;纯度：50units/mg solid)60min，然后调回到 ρΗ5·5,在常规条 件下测定酶活。以剩余最高酶活为100%，其他条件下的酶活占最高酶活的百分数即为该酶 在此PH条件的相对酶活，不同pH值为横坐标，植酸酶相对活性（％)为纵坐标，绘制pH-酶 活曲线。如图9所示，从图中可以看出在PH2. 0-6. 5相对酶活均在85%以上，表明多角体包 裹的植酸酶appA的pH耐受性良好。
[0054] 4、胃蛋白酶和胰蛋白酶对植酸酶活性的影响
[0055] 将包裹植酸酶颗粒和植酸酶（EKEAR CAS号：9001-89-2 ;纯度：50units/mg solid)分别与0· 5mg/mL的胃蛋白酶（用pH为2· 5,浓度为0· Imol的缓冲液配制）和胰蛋 白酶（用PH为7.0,浓度为0. Imol的缓冲液配制）按一定比例混合，然后在37°C分别处理 30min、60min、120min后，在37°C，pH5. 5测定酶活，每个反应设3次重复。以未处理的酶 活为100%，，在其他条件的酶活占最高酶活的百分数即为该酶在此条件的相对酶活。绘 制酶活-时间柱形图，如图10至图11所示，从图中可以看出随着处理时间的延长植酸酶活 力逐渐下降，植酸酶appA用胃蛋白酶处理120min后残留酶活为87. 3%，用胰蛋白酶处理 120min后残留酶活为79. 5%。说明多角体包裹的植酸酶appA对胃蛋白酶和胰蛋白酶均有 着较强的耐受性。
[0056] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，任何熟悉本技术 领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发 明的保护范围的内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。
【主权项】
1. 一种多角体蛋白包裹型植酸酶，其特征在于，由植酸酶aPPA分子和包裹层组成，所 述包裹层为昆虫质型多角体蛋白，所述植酸酶aPPA分子以固态分子的形式被包裹于所述 昆虫质型多角体蛋白内；所述多角体蛋白包裹型植酸酶的颗粒大小为〇. 1?I ym，植酸酶 蛋白浓度占比为10%?70%。
2. 根据权利要求1所述的多角体蛋白包裹型植酸酶，其特征在于，所述多角体蛋白包 裹型植酸酶是通过如下方法制成，具体步骤如下： Α、利用病毒基因组所展现的密码子偏倚性，选取植酸酶的密码子，合成植酸酶aPPA基 因，所述植酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示； B、 将步骤A的所述植酸酶aPPA基因构建到pFastBacTMDual载体的plO启动子下，并 在所述植酸酶aPPA基因前引入SP引导基因，构建含有植酸酶aPPA基因及多角体基因的重 组杆状病毒载体，所述SP引导基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，所述多角体基因的 核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示； C、 将步骤B中的所述重组杆状病毒载体与杆状病毒骨架重组，获得重组杆状病毒； D、 用步骤C中的所述重组杆状病毒感染昆虫细胞，分离纯化多角体颗粒，即得到多角 体蛋白包裹型植酸酶。
3. 根据权利要求2所述的多角体蛋白包裹型植酸酶，其特征在于，步骤D中所述昆虫细 胞为Sf9昆虫细胞或Sf21昆虫细胞。
4. 根据权利要求1或2或3所述的多角体蛋白包裹型植酸酶，其特征在于，所述多角体 蛋白包裹型植酸酶中植酸酶蛋白浓度占比为45%?55%。
【专利摘要】本发明公开了一种多角体蛋白包裹型植酸酶，利用杆状病毒表达系统，同时将质型多角体蛋白基因和植酸酶基因分别构建到pFastBac?Dual载体的PH与p10启动子下，并在植酸酶基因前引入SP引导基因，通过与病毒骨架重组，获得重组杆状病毒。通过该单一病毒感染Sf9或Sf21昆虫细胞，直接可以在细胞内产生所需要的多角体蛋白包裹型植酸酶颗粒，并且这种重组型的病毒也同样可以获得扩增，被多角体蛋白包裹的植酸酶为0.1～1μm颗粒，具有耐酸、抗高温、持久缓释等特点。
【IPC分类】C12N11-04, C12N9-16, C12N15-866
【公开号】CN104560934
【申请号】CN201510079969
【发明人】袁林, 郭建军, 曾静, 靳亮, 邱小忠, 杨一兵, 魏国汶
【申请人】江西省科学院微生物研究所
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年2月13日