磷酸二甘油酯作为添加剂在pcr中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提高PCR添加剂，尤其是磷酸二甘油酯作为添加剂用来提高PCR效果。
【背景技术】
[0002]聚合酶链式反应(简称PCR)是一种分子生物学技术，用于生物体外酶促合成DNA，由高温变性、低温退火及适度延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，在短时间内能使目的DNA迅速扩增。具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病诊断或任何有DNA、RNA的地方。由美国科学家Dr.Mullis发明，由于PCR技术在理论和应用上的跨时代意义，因此Mullis获得了1993年诺贝尔化学奖。
[0003]近年来，人们发现，向PCR反应体系中加入一定量的添加剂可以提高PCR扩增效率和专一性，减少或消除副反应的产生。常见的添加剂有:DMS0、牛血清蛋白(BSA)、甘油、聚乙二醇、吐温-20等。但是，这些添加剂各有其局限性。开发新的PCR扩增添加剂是一项非常重要的工作，以适用于多种复杂环境的片段扩增。
[0004]磷酸二甘油酯(diglycerol phosphate, DP)是嗜热菌体内蓄积的一种溶质,主要发现存在于嗜热菌和超嗜热古菌中。其主要作用为具有高温下保护蛋白、核酸、细胞膜、酶等生物大分子的功能，从而达到协助嗜热菌抵御外界高温的侵害。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种PCR添加剂，以提高PCR扩增效果，效果显著，用量少，成本低，操作方便，使用安全。
[0006]实现本发明目的的是一种磷酸二甘油酯PCR添加剂，在PCR反应体系中加入磷酸二甘油酯。
[0007]所述磷酸二甘油酯在PCR反应体系中的终浓度为3_5mg/ml。
[0008]本发明的一种PCR增效剂的有益效果如下:
通过在PCR反应体系中添加磷酸二甘油酯，提高了聚合酶对温的耐受程度，从而使PCR反应在高温下能更稳定的进行，从而提高了 PCR的效果。
利用磷酸二甘油酯作为添加剂的提高PCR效果的增效剂有以下功能:(I)通过在PCR反应体系中中添加磷酸二甘油酯，确实提高了 PCR效果，且成本低。(2)磷酸二甘油酯对后续操作无影响。(3)本发明提供的磷酸二甘油酯提高PCR扩增效果的方法操作简单，易于实行。
【具体实施方式】
[0009]本发明结合附图通过以下实施例进行详述，但不限于下述实施例。
[0010]本发明涉及PCR优化的方法是向PCR反应体系中添加磷酸二甘油酯来实现，具体步骤如下:
1.配置磷酸二甘油酯水溶液:称取市售磷酸二甘油酯3-6mg，置于已灭菌的1.5ml离心管中，加入灭菌水使其溶解，最后定容至1ml，所得溶液进行12rC，20min灭菌。
[0011]2.PCR反应体系的配置:待扩增的DNA片段不同，PCR反应体系中dNTP、Mg2+、模板的加入量不同；在上述反应体系中加入适量的磷酸二甘油酯溶液，双蒸水的添加量应根据磷酸二甘油酯溶液的加入作相应扣减。
[0012]3.PCR反应运行:预变性、变性、退火温度及时间应根据模板来选择，延伸时间根据所要扩增的目的片段的长度来选择。
[0013]4.PCR扩增产物的检测:用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0014]实施例1:磷酸二甘油酯对9kb的DNA片段的优化扩增
1.配置4mg/ml磷酸二甘油酯水溶液。
2.PCR反应体系的配置:
10XPCR Buffer2.5ul
dNTP (2.5mM)5ul
引物 I (2.0uM)Iul
引物 2(2.0uM)Iul
Mg2+ (25mM)1.5ul
配置好上述反应体系后，分别加入14ul磷酸二甘油酯水溶液添加剂，附图中1，2分别表示对照组和加入磷酸二甘油酯溶液添加剂组，这样的话，磷酸二甘油酯溶液在PCR反应体系中的终浓度为2.8mg/ml。对照组将磷酸二甘油酯溶液换成14ul灭菌双蒸水，如附图中5。
3.PCR反应运行:
预变性94 °C4min
变性94 °C30s
退火58°C30s }32 个
延伸72 °C5min
进一步延伸72°C5min
4.PCR下反应后用琼脂糖凝胶电泳检测:结果如图所示，所用Maker为天根公司kbmarker,从图中可以看出加入磷酸二甘油酯添加剂的组明显比对照组条带亮,说明磷酸二甘油酯确实能提高PCR效果。
[0015]
【附图说明】
图1为本发明中利用磷酸二甘油脂优化扩增长度为9kb左右的DNA片段结果，图中1，2分别表示对照组和加入磷酸二甘油酯溶液添加剂组。
【主权项】
1.一种磷酸二甘油酯作为PCR增效添加剂提高扩增效果的方法，其特征在于，先将磷酸二甘油酯溶于无菌水制备磷酸二甘油酯溶液。
2.根据权利要求1所述的PCR添加剂，其特征在于:所述磷酸二甘油酯溶液的浓度为3-6mg/ml的磷酸二甘油酯水溶液。
3.根据权利要求1或2所述的PCR增效剂，其特征在于:向PCR反应体系中加入磷酸二甘油酯水溶液后磷酸二甘油酯的终浓度为0.8-3mg/ml。
4.根据权利要求1所述的磷酸二甘油酯提高PCR扩增效果的方法，其特征在于，所述的PCR扩增包括:常规PCR，高GC片段PCR、复杂序列的PCR。
【专利摘要】本发明的目的是提供一种PCR增效添加剂磷酸二甘油酯。本发明的利用添加磷酸二甘油酯的方法，提高了DNA聚合酶对高温的耐受程度，从而使PCR反应在高温下能更稳定的进行，从而提高PCR扩增效果。
【IPC分类】C12N15-10
【公开号】CN104560947
【申请号】CN201310483541
【发明人】朱道辰, 陈焱, 洪好, 朱淑静
【申请人】镇江拜因诺生物科技有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月16日