本发明的所有方面而言，本发明的第五个方面的经培养的细胞集落优选为克隆的细胞集落。
[0055]在内容所允许的情况下，在上文的本发明的第一个方面中所给出的优选的特征和说明还适用于本发明的第五个方面。
[0056]本发明优选实施方案的详细描述
[0057]下文参照示意性附图，以举例的方式更详细地描述本发明的实施方案，其中:
[0058]图1为自动操作仪器的透视图；
[0059]图2示出图1的自动操作仪器的成像系统；
[0060]图3A和3B为使用图2的成像系统所获得的细胞集落的白光图像；
[0061]图4为图1的自动操作仪器的细胞拾取头的透视图；
[0062]图5示出在使用FLIPR? Calcium 5?试剂处理和未处理的2个不同的时间点，表达ATl的CHO Kl细胞集落的白光图像；
[0063]图6为示出FLIPR? Calcium 5?试剂对表达ATl的CHO Kl细胞的细胞生长的影响的图；
[0064]图7A和7B示出在处理前和处理后的细胞集落的荧光图像；
[0065]图8为示出荧光强度随时间变化的图；以及
[0066]图9示出处理前和处理后的细胞的荧光图像。
[0067]图1示出其外壳被除去从而显露出内部构件的自动操作仪器10。自动操作仪器10的各构件的操作由计算机12(其在图2中示出)控制，如下文所述。
[0068]自动操作仪器10具有主平台14，在该主平台上对包含经培养的细胞的培养板进行操作。如图2最清晰可见，主平台14提供有光圈16。透明的玻璃板18位于光圈16之上。透明玻璃板18的上表面形成了成像站20，其中可以放置培养板从而可以使培养在培养板中的细胞可视化，如下文所述。
[0069]此外，成像站20还包括定位向导件(未示出)，其将标准构造的培养板保持在精确的位置。
[0070]如图1所示，自动操作仪器10包括成像系统22，其位于主平台14的下方，更具体而言，位于光圈16的下方。成像系统22安装(下文将更详细地描述)在光学平台24上，其也相对主平台14而牢固地安装。
[0071]现在参见图2，成像系统22包括第一光源26、第二光源28以及照相机30，以用于获得位于成像站20中的培养板中的细胞的图像。非常概括而言，第一光源26与照相机30一起使用以采用暗视野构造而获得细胞的白光图像。这可以用于确定细胞集落和细胞的位置、确定细胞集落的边界、以及通过拍摄连续图像而用于确定集落生长的速率。此外，概括而言，第二光源28与照相机30 —起使用以获得由细胞发出的荧光或发光的图像。现在将更详细地描述成像系统22及其用途。
[0072]第一光源26包括多个白光发光二极管(LED) 32。白光LED 32被安装在具有中心光圈36的安装环34上。LED 32的光轴位于普通虚共有假象锥(未示出)的表面上，从而使得LED 32所发出的各光束汇集于假象锥顶端的汇聚点38处。在图2中，斜箭头40示出从2个LED 32到汇聚点38的光路。
[0073]为了说明的目的，图2示出了置于成像站20上的六孔培养板42。然而，应当理解还可以使用不同类型的培养容器。六孔培养板42的每个孔通过数字44来识别，并且直接位于成像系统22的上方。孔44具有水平培养表面46，其上生长有许多粘附的细胞集落48。在孔44中提供有液体生长培养基(未示出)，其覆盖细胞集落48。
[0074]由LED 32发出的光束的汇聚点38稍高于培养表面46和细胞集落48。
[0075]提供给LED 32的电源由计算机12控制，控制线50示意性示出。因此，LED 32的照明由计算机12控制。
[0076]此外，成像系统22还包括半镀银的镜子52，该镜子与水平成45°角并位于安装环34的中心光圈36的下方。按照已知的方式，大部分的光垂直向下移动，如向下箭头54所示，在不具有任何方向改变的条件下直接通过半镀银的镜子52。另一方面，大部分的光以水平箭头56所示的方向水平移向半镀银镜子52的倾斜上表面，被半镀银镜子52垂直向上反射，并且入射角与反射角均成45°。
[0077]此外，成像系统22还包括自动对光变焦透镜58。发现特别适用的一种市售可得的变焦透镜为Leica McaroFluo Z6AP0A变焦透镜，但是还可以使用其他的透镜。变焦透镜58接受通过半镀银镜子52后以向下箭头54的方向垂直向下通过的光。变焦透镜58集中光以被照相机30接受。变焦透镜58的焦距可以改变，这由计算机12控制，如控制线60示意性示出的那样。变焦透镜58的光轴与汇聚点38对齐。
[0078]照相机30接受变焦透镜58集中的光。照相机通过光产生图像并将图像通过控制线62传输至计算机12。
[0079]照相机30能够由较低强度的光产生图像，例如置于成像站20上的培养板上的细胞中所发出的荧光或发光。优选的是，照相机30还能够在由所述低强度光源产生图像的同时覆盖培养板42 (其置于成像站30上)的培养表面46的较大的视野。优选的是，照相机30产生的图像覆盖了许多附着在培养表面46上的分开的细胞集落48 (或单一细胞)。
[0080]发现特别适合的一种市售可得的照相机为Hamamatsu ORCA Flash 4.0。这种照相机使用了提供较高的感光度的sCMOS图像传感器。此外，用于Hamamatsu照相机中的sCMOS图像传感器的感应面积的尺寸较大(13.312_ X 13.312_)，这允许照相机30获得覆盖较大视野的图像。Hamamatsu照相机的其他优点在于其具有相对大量的像素(2048x 2048)。在必要时，相对大量的像素可以具有较高的分辨率。可选地，当感光度比分辨率更重要时，可以传入由大量相邻的像素得到的信号以增加感光度。[0081 ] 此外，还评价了以下照相机并发现它们是合适的:Apogee ALTA U260 ；AndorNeo-sCMOS ;和Andor Neo-sCMOS oem。这些照相机的图像传感器的感应面积的尺寸分别为:10.2mm x 10.2mm ； 16.6mm x 14mm ;和16.6mm x 14mm。通过这些研宄得结论，感应面积为10mm2或更大的照相机是优选的。
[0082]此外，还可以使用具有除sCMOS图像传感器以外的图像传感器的照相机。例如可以使用具有传统的CMOS或CCD图像传感器的照相机，但是所得的结果可能不会特别好。
[0083]成像系统22包括第一滤波器64。该滤波器的最大带通为516nm。第一滤波器64可以由合适的动力(未示出)在计算机12的控制下被移出变焦透镜58与照相机30之间的光路。第一滤波器64用于下文所述的目的。
[0084]如图2所示，第二光源28置于与半镀银镜子52相同的水平位置，并沿着水平箭头56的方向使光通向半镀银镜子52的倾斜上表面。第二光源28的照明由计算机12通过控制线68控制。
[0085]发现适用于第二光源28的一种市售可得的光源为Sola 6-LCR SA白光源，但是可以使用其他市售可得的光源。
[0086]最大带通为495nm的第二滤波器70置于第二光源28与半镀银镜子52之间。
[0087]现在将描述成像系统22的操作。
[0088]如上文所述，第一光源26 (LED 32)与照相机30联合使用以得到在培养板42 (位于成像站20上)的培养表面46上生长的细胞和/或细胞集落48的白光图像。由LED 32得到的白光向上通过主平台14的光圈16、通过玻璃板18、通过培养板42的底壁，指向汇聚点38。由细胞集落48和/或单一细胞向下散射的光向下返回通过培养板42、通过玻璃板18、通过光圈16、通过中心光圈36，指向半镀银镜子52，在此，大部分的散射光直线通过半镀银镜子52，到达自动对光变焦透镜58。变焦透镜58集中光，从而允许照相机30产生培养表面46上的细胞集落48和/或单一细胞的图像。
[0089]在使用第一光源26和照相机30按照所述的这种方式获得图像时，第一滤波器64从光路上移除，其不起作用。
[0090]将照相机30生成的图像传输至计算机12中用于分析。
[0091]图3A和3B为按照这种方式获得的细胞集落48的白光图像。图3A为原始图像，图3B示出在使用已知的电子方差滤波器来增加细胞集落48与背景之间的对比之后的相同的图像。
[0092]第二光源28可以与照相机30组合使用以获得培养板42上的细胞集落48或单一细胞的荧光图像。根据具体的荧光体系来选择第一滤波器64和第二滤波器70。在该具体的实例中，选择第一滤波器64和第二滤波器70以与上文讨论的FLIPR? Calcium 5?荧光试剂一起使用。该试剂用于指示细胞溶质钙浓度。该试剂渗透至细胞中并与细胞溶质钙结合。当使用该试剂时，钙与该试剂的结合会增加试剂的荧光反应，因此增加的细胞溶质钙水平会导致细胞内荧光的增强。如上文所讨论，第二滤波器70的最大带通为495nm，这为Calcium 5?试剂的最大激发。第一滤波器64的最大带通516nm相当于Calcium5 ?试剂的最大荧光发射。显然，当使用其他荧光体系时，可以用具有不同最大带通的适合所研宄的荧光体系的其他滤波器替换上文所述的第一滤波器64和第二滤波器70。第一滤波器64和第二滤波器70可以由滤波器轮承载，从而用于在计算机12的控制下更换滤波器。
[0093]在操作中，由第二光源28得到的白光被第二滤波器70过滤，使得最大波长为495nm的光被半镀银镜子52向上反射。反射光通过中心光圈36、光圈16、玻璃板18以及培养板42的底部，到达培养板42中的细胞集落48或细胞。此光激发了细胞集落48的细胞内(或单一细胞内)的Calcium 5?试剂。细胞内Calcium 5 ?试剂的发射光向下返回通过培养板42的底部、透明玻璃板18、光圈16、中心光圈36，到达半镀银镜子52。大部分的此发射光直线通过半镀银镜子52，进入变焦透镜58，该变焦透镜58将光集中到照相机30上。在这种情况中，第一滤波器64位于光路中，并在发射光通过变焦透镜58与照相机30之间时过滤发射光。由照相机30获得的荧光图像被传输至计算机12以用于分析。
[0094]当使用了第一光源26的成像系统22用于获得细胞集落或单一细胞的白光图像时，或者当使用了第二光源28的成像系统用于获得荧光图像时，可以通过计算机12来操纵自动对光变焦透