事实上，这些图像与所预测的是一致的。在缺乏ATl受体的情况下，加入血管紧张素II不会导致细胞溶质钙浓度的升高。
[0127]图8示出通过对由成像系统22得到的图像进行分析，计算机12对表达ATl的细胞的四个随机选择的细胞集落测定的荧光强度水平。在图8中，图表上的每个点都代表对成像系统22所获得的单一荧光图像的单个细胞集落所测定的荧光强度水平。t = O时的荧光水平为基线图像中的荧光水平。在加入血管紧张素II后，每8秒取得图像，并且图表显示由连续图像中的每一个所获得的、4个集落中的每一个的相对荧光强度。如图8可见，在加入血管紧张素II后大约16秒时，细胞内荧光达到最高峰，然后在随后140秒内较稳定地降低。
[0128]实施例3
[0129]在实施例2中，通过将荧光图像与白光图像做比较，显而易见的是所有或基本上所有表达ATl的细胞集落在添加血管紧张素II后都显示出细胞内的荧光增强。由于在实施例2中使用的表达ATl的CHO-Kl细胞来自稳定表达ATl的细胞系，所以上述情况是可预测的。
[0130]然而，应该理解的是可以对细胞集落(或单一细胞)的异质混合物实施相同的方法，并且该方法可以用于从混合物中选择具有所需特征的细胞集落(或单一细胞)。
[0131]以下是如何实施上述方法的实例。
[0132]使用被设计为可以表达ATl的基因构建体来转染不表达ATl受体的细胞系。如所公知的那样，转染过程是低效的。转染后，许多细胞根本不表达AT1，并且对于表达ATl的那些细胞而言，表达程度变化较大。
[0133]平板接种并孵育经转染细胞的悬浮物，从而形成分散的细胞集落。在平板接种前，将细胞悬浮物充分稀释，以确保即使不是全部也是大部分在平板上生长的集落衍生自单一细胞，从而是克隆的。对包含克隆细胞集落的培养板实施实施例2中所用的相同的方法。
[0134]在该过程中，将在加入血管紧张素II溶液后由各克隆集落得到的相对荧光强度与加入血管紧张素II前由同一克隆集落获得的相对荧光强度(即，基线水平)相比较。细胞内荧光的增强表明细胞溶质钙浓度增加，进而其为表达功能性ATl受体的标志物。
[0135]由计算机12选择被证明在加入血管紧张素II后细胞内荧光增强的那些克隆细胞集落，并且计算机12利用白光成像确定这些集落在培养板上的位置。
[0136]了解了表现出细胞内荧光增强的细胞集落的位置，可以使用细胞拾取头74在计算机12的控制下拾取那些集落，并可以对各拾取的集落中的细胞进行亚培养并进行进一步的分析，以确定所述的克隆是否表现出所需的ATl受体的表达。
[0137]未证明细胞内荧光增强的集落不被拾取，并且不进行进一步的检测。这节省了在分析不合适的克隆中可能花费的大量时间和资源。
[0138]实施例4
[0139]本实施例利用了由表达ATI的CHO-Kl细胞的单一集落所衍生的细胞，其中所述的集落是在实施例2的程序之后由细胞拾取头74拾取的。使得自所拾取的集落的细胞悬浮，并平板接种于具有培养基的新培养板中。然后对新接种的细胞重复实施例2的过程。在实施例4过程中取得的图像示于图9中。在图9中，上方的图像为在加入血管紧张素II之前获得的荧光基线图像。下方的图像为在加入血管紧张素II之后大约20秒时获得的荧光图像。如所示，下方图像中的荧光水平明显高于上方图像的荧光水平。
[0140]本实施例证明可以将细胞暴露于Calcium 5?试剂，使用血管紧张素II刺激它们，并拾取它们，并且这些细胞仍对血管紧张素II有反应，而且还证明在再次接种后细胞内荧光增强。
[0141]实施例5
[0142]使用上文所述类型的任意成像系统，都要在对源自各集落或细胞的荧光的感光度与视野之间进行权衡。视野可以随着对各集落或细胞的感光度的降低而增大(例如缩小)，相反，感光度可以随着视野的减小而增大(例如放大)。如果为了获得所需的感光度，视野不必覆盖培养板的整个培养表面，光学运送器72可以移动成像系统22，使得可以通过在光学运送器72的不同位置处取得一系列图像而使得整个培养表面46成像。
[0143]在上述使用自动操作仪器10进行的实验中，使用以3x3矩阵排列的9个独立的叠加图像使标准六孔培养板的单个孔44成像。发现可以在13秒的总时间内生成9个叠加图像，其中所述总时间包括每个图像的曝光时间为200ms、将图像下载至计算机12所用的时间、以及光学运送器72移至所需位置所用的时间。
【主权项】
1.一种选择具有所需特征的经培养的细胞集落或经培养的单一细胞的方法，包括: 在共同的培养空间中提供多种经培养的细胞集落或经培养的单一细胞，其中所述的多种在所需特征方面是异质的； 在所述的细胞集落或所述单一细胞处于所述的共同的培养空间中时，对所述的细胞集落或所述单一细胞进行处理，其中所述的处理引发至少一种所述的细胞集落或所述单一细胞的细胞成分的功能发生改变，所述的功能改变指示被引发功能改变的所述或各个细胞集落或单一细胞具有所需的特征； 在所述的共同的培养空间中，评估各个所述细胞集落或所述单一细胞的功能改变的标志物； 选择至少一种而不是全部所述的细胞集落或所述单一细胞，其中所述的选择考虑了所述评估以确定所预测的具有所需特征的情况，其中基于所述的评估，预测所述或各个所选择的细胞集落或单一细胞具有所需的特征；以及 提供所选择的至少一种细胞集落或至少一种单一细胞的空间位置的指示。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的标志物为细胞内的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的标志物为细胞溶质钙浓度的改变。
4.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述的评估包括测定荧光或发光。
5.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其还包括从所述的共同的培养空间中拾取所述或一种所选择的细胞集落或单一细胞；以及培养所拾取的细胞集落或单一细胞。
6.一种计算机程序，包括用于指导自动操作仪器实施根据前述任意一项权利要求所述的方法的指令。
7.一种计算机可读媒介，其具有储存于其上的根据权利要求6所述的计算机程序。
8.—种自动操作仪器，包括处理器和储存媒介，所述的储存媒介具有储存于其上的根据权利要求6所述的计算机程序，所述的处理器与所述的储存媒介连接以用于在所述处理器上运行所述计算机程序。
9.一种用于选择具有所需特征的经培养的细胞集落或经培养的单一细胞的自动操作仪器，包括: 成像站，其中可以设置有培养容器； 成像系统，适用于生成覆盖视野的至少一个图像，所述的视野包括容纳在置于所述成像站的培养容器的共同培养空间中的多种细胞集落或单一细胞；处理装置，被编程为分析至少一个图像，从而评估所述视野中所包括的各细胞集落或单一细胞的指示细胞成分的功能改变的标志物，所述功能改变指示所需特征的存在情况；所述的处理装置被编程为选择至少一种而不是全部所述的细胞集落或单一细胞，其中所述的选择考虑了所述评估以确定所预测的具有所需特征的情况，其中基于所述的评估，预测所述或各个所选择的细胞集落或单一细胞具有所需的特征；以及 所述的处理装置被编程为提取对至少一种所选择的细胞集落或单一细胞的空间位置的指示。
10.根据权利要求9所述的自动操作仪器，其包括用于将流体分配至位于所述成像站的培养容器的共同培养空间中的自动操作分配器，该自动操作分配器由所述的处理装置控制。
11.根据权利要求10所述的自动操作仪器，其中所述的处理装置被编程为按照以下顺序实施各步骤: i)操纵所述成像系统，以取得包含位于所述成像站的培养容器的共同培养空间中的多种细胞集落或单一细胞的视野的第一图像； ii)操纵所述的自动操作分配器，以将包含一种或多种处理化学品的流体处理剂分配至所述培养容器的共同培养空间中； iii)操纵所述的成像系统，以取得包含位于所述成像站的所述培养容器的共同培养空间中的多种细胞集落或单一细胞的视野的第二图像； 并且其中所述处理装置被编程以实施的所述分析包括，比较所述的第一图像和第二图像以确定它们之间对应于各个所述细胞集落或单一细胞的改变。
12.根据权利要求9至11中任意一项所述的自动操作仪器，其中所述的成像系统包括用于检测视野中的由细胞集落或单一细胞所发出的荧光或发光的检测器。
13.根据权利要求12所述的自动操作仪器，其中所述的检测器包括sCMOS图像传感器。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的自动操作仪器，其中所述的检测器包括感应面积为至少10mm2的图像传感器。
15.根据权利要求9至14中任意一项所述的自动操作仪器，其包括用于拾取单独的细胞集落或单独的单一细胞的自动操作细胞拾取器，所述的自动操作细胞拾取器由所述的处理装置控制，所述的处理装置被编程为操纵所述的自动操作细胞拾取器来拾取所述处理装置选择的并且已经提取其空间位置的指示的细胞集落或单一细胞。
16.根据权利要求9至15中任意一项所述的自动操作仪器，还包括其中在共同的培养空间中具有多种经培养的细胞集落或经培养的单一细胞的培养容器，其中所述的多种在所需特征方面是异质的，所述共同的培养空间包含至少一种处理化学品，其用于引发至少一种所述细胞集落或所述单一细胞的细胞成分的功能改变，所述的功能改变指示其中被引发功能改变的所述或各个细胞集落或单一细胞具有所需特征。
【专利摘要】本发明提供一种方法和仪器，其能够从位于共同的培养空间中的多种异质的经培养的细胞集落或经培养的单一细胞中选择具有所需特征的经培养的细胞集落或经培养的单一细胞。在细胞集落或单一细胞处于共同的培养空间中时，对所述的细胞集落或单一细胞实施处理，以使具有所需特征的那些细胞的细胞成分的功能获得改变。然后在共同的培养空间中，评估单独的细胞集落或单独的单一细胞的功能改变的标志物。
【IPC分类】C12M1-34, C12Q1-24, C12Q1-04
【公开号】CN104583417
【申请号】CN201380045718
【发明人】阿拉斯代尔·麦克米伦·罗伯逊, 史帝芬·马丁·盖姆, 胡利安·弗朗西斯·伯克, 马克·罗伯特·特鲁斯代尔, 安娜·路易丝·菲利浦斯, 李·冯·兰多, 乔纳森·西蒙兹
【申请人】分子装置有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年7月2日
【公告号】EP2682187A1, WO2014008222A1