选择方法及仪器的制造方法
【专利说明】选择方法及仪器
[0001]本申请要求于2012年7月2日提交的欧洲专利申请N0.12174574.9的优先权，该申请的全部内容以引用方式并入本文。
[0002]存在许多这样的情况，其中需要在具有所需特征的异质群体、细胞集落或单一细胞中进行选择(换句话而言就是挑选)。
[0003]一个实例为选择细胞集落或单一细胞，从而形成细胞系以用于基于细胞的报告检验。基于细胞的报告检验可以例如用于筛选用于新药的候选化合物。在此类检验的实例中，表达特定蛋白质的合适的细胞系培养物暴露于候选化合物中，并评估该细胞的指示候选化合物与蛋白质之间的所需相互作用(直接或间接)的标志物。可以通过转染容易培养的细胞以使该细胞表达所关注的转基因或重组多肽或蛋白的功能拷贝，从而生成用于基于细胞的报告检验的细胞系。然而，转染过程导致形成细胞的异质混合物，并且关键的是选择其中转染过程已经产生所需特征的那些细胞。
[0004]目前，在转染后，将细胞进行有限稀释，并平板接种于多孔板中，这样从统计学上看，任何孔都不可能包含多于I个细胞。许多孔都不具有细胞。将在孵育过程中形成的克隆细胞集落进行亚培养，以产生多种不同的克隆培养物，每种都具有两个重复。对于每种克隆培养物而言，检测所述重复中一个的所需特征(通常都破坏性的)。这使得克隆培养物(即，未检测的重复)缩减到表现出所需特征的那些。由于这种方法不可避免地需要培养未呈现出所需特征的克隆，所以该方法是低效的。
[0005]发明概述
[0006]根据本发明的第一个方面，提供了选择具有所需特征的经培养的细胞集落或经培养的单一细胞的方法，其包括:在共同的培养空间中提供多种培养的细胞集落或培养的单一细胞，其中所述的多种在所需特征方面是异质的；在所述的细胞集落或所述单一细胞处于所述的共同的培养空间中时，对所述的细胞集落或所述单一细胞进行处理，其中所述的处理引发至少一种所述的细胞集落或所述单一细胞的细胞成分的功能发生改变，所述的功能改变指示被引发功能改变的所述或各个细胞集落或单一细胞具有所需的特征；在所述的共同的培养空间中，评估各个所述细胞集落或所述单一细胞的功能改变的标志物；选择至少一种而不是全部所述的细胞集落或所述单一细胞，其中所述的选择考虑了所述评估以确定所预测的具有所需特征的情况，其中基于所述的评估，预测所述或各个所选择的细胞集落或单一细胞具有所需的特征；以及提供所选择的至少一种细胞集落或单一细胞的空间位置的指示。
[0007]优选的是，当对经培养的细胞集落实施所述的方法时，所述的集落是克隆的细胞集落，但是所述的方法还可以用于非克隆的细胞集落。
[0008]所需的特征可以是特定多肽或蛋白质的功能拷贝的存在情况，优选为转基因或重组的多肽或蛋白质的功能拷贝的存在情况。例如，所述的多肽或蛋白质可以与信号转导途径的一部分相互作用或者形成信号转导途径的一部分。更具体而言，所需的特征可以是选自由以下蛋白组成的组中的蛋白质(优选为转基因或重组蛋白质)的功能拷贝的存在情况:G蛋白偶联受体、离子通道、激酶、磷酸酶、转录因子、细胞骨架蛋白、细胞周期蛋白、蛋白水解蛋白和连接酶。可供选择地，所需的特征可以为功能信号转导途径的存在情况。
[0009]在一个优选的实施方案中，所需的特征是细胞受体的功能拷贝的存在情况，所述的处理包括加入与细胞受体相互作用的化学品，并且所述的相互作用直接或间接地引发功能的改变。
[0010]所述的方法包括在共同培养空间中提供多种经培养的细胞集落或多种经培养的单一细胞。所述的共同培养空间为单一连续的培养空间。其可以包括不同的相互关联的区域，但是不包括不相连的培养空间，例如多孔板的分开的孔。因此，共同的培养空间可以为例如在单一的常规的皮氏培养皿中的培养空间、单一培养瓶中的培养空间或在多孔培养板的单一孔中的培养空间。细胞集落或单一细胞一起培养于共同的培养空间中，但是通常它们在空间上彼此分开。共同的培养空间通常包含连续体积的生长培养基，其支持所有经培养的细胞集落或所有单一细胞。生长培养基可以为例如液体生长培养基或半固体生长培养基。优选的是，培养基为液体生长培养基，并且细胞集落或单一细胞是附着的。通常，培养基的精确组成并不重要，只要该培养基具有支持细胞所必需的所有成分即可。
[0011]优选的是，细胞集落的细胞在培养时发生分裂。但是，这不是必须的，如本文所用，术语“培养”包括细胞保持存活但不分裂的情况。
[0012]优选的是，对经培养的细胞集落而非单一的细胞实施所述的方法。细胞集落通常通过以下过程来提供:制备单一细胞的悬浮物，其中所述的细胞就所需的特征而言是异质的；以及将细胞接种于共同的培养空间中，使得细胞基本上在空间上是彼此分开的。然后培养细胞，从而形成空间上分开的细胞培养物，其大部分是克隆的。所述方法优选使用细胞集落，这是因为在选择合适的集落时可以考虑集落的生长速率。
[0013]在同一共同的培养空间中，可以为细胞集落与单一细胞的混合物，并对该混合物实施所述的方法。
[0014]在不同的细胞集落之间或在不同的单一细胞之间所展现的异质性可以为存在或缺乏所需特征的形式，或者为不同水平或量级的所需特征的形式，在后一种情况中，可以包括特征不明显存在的情况。
[0015]所述的方法包括当细胞集落或单一细胞处于共同的培养空间中时，对细胞集落或单一细胞进行处理。在优选的实施方案中，以这样的方式对共同的培养空间进行处理:使所有的细胞集落或所有的单一细胞在相对短的时间(例如10、20或30秒)内经历处理(但是可能以不同的强度或浓度)。在这种情况下，如果观察到指示物衰退，优选在比其后观察到指示物明显衰退的时间更短的时间内对所有的细胞集落或所有的单一细胞进行处理。在其他优选的实施方案中，在不同的时间对各细胞集落或各单一细胞进行处理。例如，如果所述的处理为施加电流或电压，那么其可以通过在不同的时间对各集落或单一细胞施加电流或电压来实现。例如另一个实例，其中所述的处理为施加化学品，可以使该化学品以非活性的形式包含在生长培养基中。随后可以通过施加合适的局部刺激(例如，窄束的光)，使所述的化学品在各细胞集落或单一细胞附近以局部的方式转变成活性形式。
[0016]所述的处理可以包括例如向共同的培养空间中加入一种或多种化学品，使得该化学品在共同的培养空间中与细胞集落或单一细胞接触。所加入的化学品在性质上可以是生物化学品，例如生物化学小分子、肽、蛋白质或非肽大分子；或者可选地，所述的化学品可以在性质上是非生物化学品。替代化学处理或者除了化学处理以外，所述处理可以包括非化学干预，这种干预的一个实例是将温度调整至细胞集落或单一细胞暴露于共同的培养空间中的温度。另一种非化学处理是施加电流或电压。处理可以包括2个阶段或更多个阶段，例如在第一阶段中加入第一化学品，在随后的第二阶段中加入第二化学品。
[0017]在处理包括暴露于化学品并且细胞集落或单一细胞在液体生长培养基中培养的情况下，可以通过向培养基中加入一定体积的包含化学品的液体(比液体培养基的体积多)而使所有的细胞集落或单一细胞在相对短的时间内暴露于化学品。例如，所加入的液体的体积可以为液体培养基的体积的20%至50%之间，或者如果细胞未发生分离的话，甚至可以加入更多的液体。在其中培养基为半固体培养基的情况下，可以通过将化学品溶液的雾喷在半固体培养基的表面上而使细胞集落或单一细胞在相对短的时间内暴露于化学品。可供选择地，在其中培养基为半固体培养基的情况下，处理化学品可以以非活性的形式包含在培养基中，并通过将合适的活化刺激施加到整个培养基来同时进行活化。
[0018]细胞集落或单一细胞所暴露的化学品的浓度不必是均匀的。
[0019]除了所述的处理，可以对细胞集落或单一细胞进行其他的干扰。这种干扰的一个实例是在需要其他的干扰以使得能够检测由所述的处理所引发的功能改变的标志物时进行。例如可以首先使经培养的细胞集落或经培养的单一细胞与报告化学品一起孵育，该报告化学品进入集落的细胞或单一细胞中。该干扰后，对共同的培养空间进行处理，并引发具有所需的特征的细胞集落或单一细胞的细胞成分的功能改变。胞内化的报告化学品使得功能改变的标志物(或信号)能够被检测到。一个更具体的实例是，当集落或单一细胞首先与荧光或发光报告化学品一起孵育时，这些荧光或发光报告化学品进入集落的细胞或单一细胞中，从而使得能够测量细胞溶质的钙浓度。然后，对集落或单一细胞进行能够引发细胞成分的功能改变的处理，其导致细胞溶质的钙浓度发生改变。
[0020]理想的是，所述的处理和任何其他的干扰都不应该不可逆地改变具有所需特征的细胞集落或单一细胞。优选的是，所述的处理对具有所需特征的细胞集落或单一细胞基本上或完全是无毒的。
[0021]所述的处理引发了细胞成分功能的改变。细胞成分功能的改变指示其中功能发生改变的细胞集落或单一细胞具有所需特征。事实上，所需的特征可以是(但不必必须是)存在有功能发生改变的成分。功能的改变可以是例如功能量级的改变、无活性至有活性或者有活性至无活性的改变、或者由一种功能向不同功能的改变。例如，功能改变可以是活性与无活性状态之间的催化功能的改变，或者是催化功能的量级的改变。功能改变的另一个实例是膜通道构型的改变，例如开放和关闭构型之间的改变。功能的改变不必必须涉及细胞成分本身的结构或构型的任何改变。例如功能的改变可以为并非由细胞成分本身的改变所引起，而是由细胞成分由一个亚细胞位置移动至另一个亚细胞位置所引起的无活性至有活性或者有活性至无活性的改变。
[0022]所述的成分可以为能够发生指示存在所需特征的功能改变的任何细胞成分。例如，所述的成分可以为酶、细胞受体、膜通道或转录因子。举例说明，所需的特征可以为存在特定的膜受体(例如G蛋白偶联受体(GPCR))，所述的处理可以为加入可以与受体相互作用的化学品(例如配体)，所述的成分可以为由受体控制的信号转导途径(例如磷脂酰肌醇信号途径)的成分(例如磷脂酶C)，所述的功能改变可以为通过化学品与受体相互作用而引发的成分的催化活性的改变。磷脂酶C的活化导致细胞溶质的钙浓度增加，因此在此示例说明中，细胞溶质的钙浓度的改变可以作为细胞功能改变以及(间接地)存在所需特征的标志物。
[0023]在可供选择的示例说明中，所需的特征可以为存在特定的转录因子的功能拷贝。细胞成分可以为相同的转录因子。处理可以为加入转录因子的配体。功能改变可以为在转录因子由细胞质迀移至细胞核的过程中所发生的转录因子活性的改变。在此