PTG、Xgal、PEG-8000等其余试剂 购自北京索莱宝科技有限公司，并按照噬菌体展示环七肽库试剂盒说明书配置。
[0015] 二、实验步骤： 1、细胞培养 人膀胱移行细胞癌BIU-87细胞、人膀胱正常移行上皮细胞iMBT培养于含10%FBS的RPMI1640培养液中，37 °C、5%C02条件下恒温孵箱常规培养，待细胞贴壁生长至90%以上传 代。
[0016] 2、荷瘤鼠模型制备 人膀胱移行细胞癌BIU87细胞大量培养，待细胞贴壁生长至90%以上，用PBS清洗三 次，加入胰蛋白酶消化细胞，RPMI1640培养基终止消化，低速离心收集细胞，0°C条件下将收 集的细胞混悬于200y1Matrigel基底膜基质胶，细胞密度约为1X107/ml，分别接种于裸 鼠双侧前肢腋窝部位，每天观察并记录肿块直径，待直径达2cm左右且触之较硬，活动度较 好，无化脓破溃即用于筛选，出瘤率达100%。
[0017] 3、宿主菌E.coliER2738复苏、培养 从E.coliER2738菌种保存管沾取少许菌种，涂于LB-Tet平板，倒置于37°C恒温箱中 培养过夜，次日挑取单一菌落置于3mlLB-Tet培养液中，37°C、160rpm振荡培养至细菌对数 生长期（0D6CJ直为0? 5-0. 6之间）。LB-Tet平板及细菌扩增液于4°C保存。
[0018] 4、噬菌体展示环七肽库在荷瘤裸鼠体内筛选 (1)取Ph.D.-C7C?噬菌体展示环七肽文库10yl(约2X10npfu)，用TBS稀释成 200yl，备用； (2)取荷瘤小鼠1只，2%戊巴比妥钠以30mg/Kg麻醉裸鼠； (3)待小鼠表现出深度麻醉的迹象后，用lml医用胰岛素注射器将稀释好的200y1噬 菌体文库由尾静脉缓慢注射入小鼠体内，噬菌体文库体内循环15min; (4) 注射入噬菌体文库后，随即将小鼠腹部朝上固定于解剖台上，打开胸腔，用止血钳 固定并暴露心脏，此时检查小鼠出血情况，不应有胸腔积血，也不能有任何来自心脏或其 它大血管的出血。将医用注射器插入小鼠左心室3?5mm，轻轻推动注射器活塞，看到心脏 左侧颜色变白并轻微膨胀时，用针头将右心房扎一个孔，随后通过扎入左心室的注射器，以 保持心脏膨胀并依然跳动的速率用37°C预热生理盐水匀速灌注20ml; (5) 灌注完成后立即解剖小鼠，分离出肿瘤组织和作为对照组织的肾脏、肝脏、肺、肌 肉，各取一半组织置于4%的多聚甲醛中用于免疫组织化学鉴定，另取一半组织称重后用 4°C预冷的TBS冲洗3次，分别将组织用预冷的200目铜滤网研磨至无菌烧杯，同时用TBS 继续冲洗，回收TBS混悬液于离心管，4°C、3500rpm离心5min后弃去上清； (6) 沉淀加入0.2MGlycine-HCl(pH2.2)洗脱液11111，置于摇床41：温和震荡洗脱 8min-10min，随后加 1MTris-HCl(PH9.0)中和缓冲液 150yl混匀，4°C、3500rpm离心 5min，转移上清至另一离心管4°C冰箱存放，剩余沉淀物加lml0. 1%TritionX-100混勾 后置于4°C冰箱2小时，4°C、3500rpm再次离心5min，取上清与之前存放的上清一起转入离 心管，此为洗脱得到的全部噬菌体； (7) 各组织分别取洗脱产物不同稀释度（K^-IO4)于LB\IPTG\Xgal平板中测定滴度。 肿瘤组织的其余洗脱物扩增、纯化，用于下一轮筛选； 5、 噬菌体扩增、纯化 (1) 剩余洗脱物被扩增：将洗脱物加入到20mlER2738培养物中（菌体应当处于对数 前期)，37°C剧烈摇动培养4. 5hr; (2) 将培养物转入一离心管中，4°C、10000rpm离心10min，上清液转入另一离心管 中，再次离心； (3) 将上清的上部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4°C沉淀过夜； (4) 4°C、10000rpm离心PEG沉淀15min，倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液； (5) 沉淀物重悬于1mlTBS中，悬液转入微量离心管中，4°C离心5min使残余细胞沉 淀； (6) 上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀，冰上孵育60min， 4°C离心10min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清； (7) 沉淀物重悬于200ylTBS中。离心1min，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新 鲜管中。此即为扩增后的洗脱物，4°C贮存； 6、 噬菌体滴度测定 (1) 接种ER2738单菌落于5-10mlLB培养基中，摇床培养至对数中期（0D6QQ0. 5~0.6); (2) 细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成3ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释 度一管，保存于45°C备用； (3) 37°C预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用； (4) 在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体（稀释范围：未扩增的淘选洗脱物dOi-lO4; 扩增的噬菌体培养物上清：l〇8-l〇n); (5) 当菌体培养物达对数中期，分成200yl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度 一管； (6) 每管加入10y1不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5min; (7) 将感染细胞加入45°C预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于 37°C预温的LB/IPTG/Xgal平板上，适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开； (8) 待平板冷却5min后，倒置于37°C培养过夜； (9) 检查平板，计数有~102个噬菌斑的平板上的蓝色斑数，计算公式：噬菌体效价（pfu /10UL)=噬斑数X稀释倍数； 7、免疫组织化学鉴定噬菌体肽库体内分布 (1) 组织经10%福尔马林固定过夜，常规石蜡包埋、切片（4ym); (2) 脱蜡前，将切片于60°C恒温箱中烘烤20min; (3) 脱赌至水：二甲苯IlOmin-二甲苯IIlOmin- 100%乙醇2min- 95%乙醇 I2min- 95%乙醇II2min- 80%乙醇Imin- 70%乙醇Imin-自来水洗片刻一蒸馈 水洗片刻，再以PBS洗3次，每次5min; (4) 切片滴加3%的过氧化氢37°C湿盒放置30min,以消除内源性过氧化物酶活性；切 片经水洗，蒸馏水漂洗后，再以PBS洗3次，每次5min; (5) 微波抗原修复：将切片放入盛有0. 01M构椽酸钠缓冲液（pH6. 0)的容器中，置微 波炉内加热使容器内液体温度保持在92- 98°C之间并持续10 - 15min，取出容器，室温冷 却 20- 30min,PBS洗 3 次，每次 5min; (6) 封闭：擦去组织周围PBS，滴加10%山羊血清，置切片于湿盒内37°C、20min; (7) 吸去封闭剂，勿洗！滴加1:200稀释的兔抗M13噬菌体抗体，置切片于湿盒内， 4 °C冰箱过夜； (8)PBS洗3次，每次5min;滴加1:50稀释的羊抗兔生物素化二抗，置切片于湿盒内 37°C、30min，与此同时，以稀释液按标明稀释度稀释试剂A和试剂B，取等量A、B工作液混 合，置37°C湿盒中温育30min，即成ABC，以PBS洗3次，每次5min; (9) 滴加ABC液，置37°C湿盒中温育30min，再以PBS洗3次，每次5min; (10) 滴加DAB显色液，显色时间2-10min(在显微镜下控制显色程度）；自来水冲洗 3min中止； (11) 室温下用苏木素复染3min，自来水冲洗； (12) 脱水：95% 乙醇I2min- 95% 乙醇II2min- 100% 乙醇I2min- 100% 乙醇II 2min； (13) 透明：二甲苯一苯酷混合液2min-二甲苯I2min-二甲苯II2min-二甲苯III2min； (14) 中性树胶封片； (15) 结果观察：细胞膜或胞浆内出现棕黄色颗粒阳性染色，如阳性颗粒数少于每高倍 视野3处判为阴性，否之则为阳性；每次均以PBS代替一抗作为阴性对照。
[0019] 8、ELISA鉴定单克隆噬菌体与人膀胱移行细胞癌BIU87细胞结合特异性 (1) 噬菌体滴度测定时，培养物经过两次离心后取10y1再次测滴度获得噬菌体单克 隆样品