Tert启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，属于生物【技术领域】。TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，所述TERT启动子的单核苷酸多态性序列为：TERT启动子chr5,1,295,228位为C或T的碱基多态性序列；TERT启动子chr5,1,295,242-1,295,243位为CC或TT的碱基多态性序列；TERT启动子chr5,1,295,250位为C或T的碱基多态性序列。所述泌尿系统肿瘤为膀胱移行细胞癌或上尿路上皮细胞癌。本发明的优点在于首次在泌尿系肿瘤中发现TERT启动子的高频突变，为泌尿生殖系统肿瘤预后和监测的提供一种新的生物标志物。
【专利说明】TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用。
【背景技术】
[0002]膀胱癌是排在第九位的全球最常见的肿瘤。2013年，在美国有超过73000名患者被诊断为膀胱癌，其中死亡人数约15000人。其中超过90%的患者最初诊断为原发性膀胱癌，大约75%的患者目前为表浅膀胱肿瘤，20%的为浸润性膀胱肿瘤，剩下的5%初诊为转移性肿瘤。先前的研究表明，膀胱癌有着多变的临床表现和遗传背景。最近的膀胱肿瘤研究报道了 8 个相关基因(UTX，MLL-MLL3，CREBBP-EP300, NCORl，ARID1A, CHD6)。
[0003]目前检测“膀胱癌”采用的肿瘤标记物主要有以下几种，但是各肿瘤标志物都存在不同的缺点:
(1)、膀胱肿瘤抗原(BTA):BTA试剂分为BTA stat和BTA test两种；首先，这两种试剂都不能独立用于确诊膀胱癌；另外，BTA试剂价格昂贵，目前尚难以全面推广使用；
(2)、LewisX抗原检测:Lewis X是ー种ABO血型相关抗原，在正常尿路上皮中不存在该抗原；而5%~89%的移行细胞癌可检出Lewis X,但Lewis X与肿瘤的分级无关；
(3)、核基质蛋白22(nuclear matrix protein22,NMP22):NMP22是核有丝分裂器蛋白，诊断膀胱癌的敏感性为48%~90%，特异性为70%~92%，NMP22对高级，高期膀胱癌敏感性较高；
(4)、纤维蛋白/纤维蛋白降解产物(fibrindegradation products, FDP):用快速免疫检测法測定尿中FDP诊断膀胱癌的敏感性为68%，对T2~T4期膀胱癌的敏感性更是高达100% ；
(5)、玻璃酸酶检测hyaluronidase,HAase:玻璃酸酶是ー种细胞外降解基质透明质酸的内源性糖苷酶，在肿瘤进展中起重要作用，应用凝胶技术检测G2，G3级膀胱癌尿液中玻璃酸酶活性，敏感性达92%~100% ；
(6)、端粒酶活性(telomerase):端粒是位于染色体末端的保护性结构，随细胞分裂逐步缩短，直至细胞死亡，端粒酶的作用就是延长端粒，现已发现多种肿瘤细胞中端粒酶活性增强，该法诊断包括低级，低期肿瘤在内的膀胱癌，敏感性可达91%。
[0004]然而，导致膀胱肿瘤发生的关键点仍未完全阐明，同时由于这些个体标记的灵敏性较低以至于未被应用于临床实践中，这表明需要新的灵敏性高的生物标记。
【发明内容】
[0005]在本发明的试验过程中，在超过85%的人类肿瘤研究中发现端粒酶逆转录酶(TERT, TERT通过Human Genome Browser获取NCBI发布版本37的人类基因组序列:Feb.2009 (GRCh37/hgl9 ) ；>hgl9_ensGene_ENST00000310581_0 range=chr5:1295163-1296562 5’pad=400 3’pad=0 strand=- repeatMasking=none)活跃，我们认为是一个人类肿瘤发生的重要机制。TERT是端粒酶的催化部分，位于5号染色体短臂，在人类肿瘤中调节端粒酶活性。最近人们应用全基因组测序在黑素瘤中发现TERT启动子突变。人们在ー些膀胱癌样本中证实了高频率的TERT启动子突变。ー些研究发现，具有活性的端粒酶或TERT表达增加与肿瘤的病理分期以及临床分期是相关联的。然而，人们还未获得TERT基因拷贝，TERT的表达或活性对膀胱癌的临床影响仍然是有争议的。在本发明中，我们通过试验得到TERT启动子的高频突变位点，并进行了相关的体外功能分析试验来证实:这些启动子的突变可提高ETRT活性，是导致恶性肿瘤发生的关键点所在，还分析了应用临床病理因素来评估TERT基因作为早期癌症检测和预后的生物标记的作用，表明这些突变对泌尿生殖系统恶性肿瘤的诊断和预后具有重要的意义。
[0006]本发明的目的在于公开了 TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，所述TERT启动子的单核苷酸多态性序列为:
TERT启动子chr5，I, 295，228位为C或T的碱基多态性序列；
TERT启动子chr5，I, 295，242-1，295，243位为CC或TT的碱基多态性序列；
TERT启动子chr5，I, 295，250位为C或T的碱基多态性序列。
[0008]上述技术方案所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，其中，所述泌尿系统肿·瘤为膀胱移行细胞癌或上尿路上皮细胞癌。
[0009]上述技术方案所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，其中，所述应用包括下述步骤:
(1)、从样本泌尿系统组织中提取DNA；
(2)、以包含TERT启动子基因的待测基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增TERT启动子基因，所述引物对P为:
TF:5，-CAGCGCTGCCTGAAACTC-3，，
TR:5’ -GTCCTGCCCCTTCACCTT-3’ ；
PCR扩增完成后，对PCR产物进行sanger测序，当样本中含有TERT启动子的单核苷酸多态性序列时，该样本为膀胱移行细胞癌或上尿路上皮细胞癌样本。
[0010]上述技术方案所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，其中，所述的PCR反应体系体积为20 iil，含有dNTP 2 u IUO X PCR Buffer 2 U I,TF(10 PM) I U I, TR(10 U M) Iii 1、模板 DNA IuU dH20 12.5 ii I 和 TaKaRa Taq HS
0.5 u I。
[0011]上述技术方案所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，其中，所述的PCR扩增反应程序为:93°C 2分钟预变性，然后按93°C I分钟，55°C I分钟，72°C I分钟，共40做个循环，最后72°C 7分钟延伸。
[0012]本发明具有以下有益效果:
1、本发明为检测膀胱癌提供一种新的肿瘤标志物，对发现膀胱癌及其相关疾病的易感人群和基因诊断有重要价值；2、本发明中的TERT启动子的高频突变可能膀胱癌发生的关键点所在，对探索膀胱癌等疾病的发病机制有重要意义；
3、本发明为临床生物治疗提供了分子靶向，同时也开辟新的治疗途径起到重要作用。
[0013]【专利附图】
【附图说明】:
图1为通过ABI 3730 XL测序仪对PCR产物进行sanger测序得到的反链上体细胞突变位点；
图2为PCR(RT-PCR)对TERT表达的分析结果，其中WT为野生型、C228T为正链chr5，I, 295，228C>T 突变和 C250T 为正链 chr5, I, 295，250 OT ；
图3为蛋白免疫印记技术检测TERT的表达分析结果，其中WT为野生型、C228T为正链chr5, 1，295，228C>T 突变和 C250T 为正链 chr5, I, 295, 250 OT ；
图4为染色质免疫共沉淀(ChIP)试验检测TERT表达分析结果，其中WT为野生型、C228T 为正链 chr5, 1，295，228C>T 突变和 C250T 为正链 chr5, I, 295, 250 OT ；
图5为划痕愈合实验检测TERT启动子突变对膀胱癌细胞的侵袭能力的结果，其中WT为野生型、C228T 为正链 chr5, 1，295，228C>T 突变和 C250T 为正链 chr5, I, 295, 250 OT ；图6为TERT启动子突变和膀胱癌患者的病理因素分析结果图。
[0014]【具体实施方式】:
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用作进ー步的说明。
[0015]试验例1:通过TERT启动子的单核苷酸多态性序列检测泌尿系统肿瘤:
一、样本来源及选择标准:
用中国泌尿生殖系统癌症基因组学协会(UCGC)会员机构新诊断的泌尿系统癌症病人的肿瘤组织作为实验组，同时用患者的外周血或形态正常膀胱组织作为对照组。所有标本收集后用液氮快速冷冻并立即存储在_80°C的环境中以用于更远研究。由两个独立的病理学家在显微镜下评估由苏木精-伊红(HE)染色制备的癌组织切片。在本研究中，仅有肿瘤细胞超过80%的肿瘤组织被用来提取DNA和进行随后的测序。目前研究中总共有302位泌尿生殖系肿瘤患者參与测序，包括216名膀胱癌患者，11名肾盂癌患者，24名肾细胞癌患者，21名肾上腺肿瘤患者，17名睾丸癌患者及13名前列腺癌患者。
[0016]样本的选择标准:1、所有患者(302例)在术前都未经放疗或化疗；2、患者都是由中山肿瘤中心确诊的；3、样本组织都是新鲜组织，切下后30分钟内放入RNAlater中，并在4° C冷藏过夜，其后-80° C低温储存；4、经HE染色，肿瘤细胞超过80%的肿瘤组织；5、正常托肾组织在病理学检查中显示正常的肾小管和肾小球且无肿瘤细胞污染；6、年龄大于18岁。
[0017]二、主要试剂和仪器:
QIAamp DNA Mini Kits (试剂盒、希尔登，德国)；Dual 96-well GeneAmp PCRSystem 9700(美国，Life Technologies公司)；ABI 3730 XL测序仪(美国应用生物系统公司);TAKARATaqTM Hot Start (试剂盒、大连宝生物工程有限公司)。
[0018]三、操作步骤:
(一)、按照QIAamp DNA Mini Kits试剂盒中说明书的步骤对302例样本(癌症患者的肿瘤组织作为实验组，同时用患者的外周血或形态正常膀胱组织作为对照组)中的DNA进行提取:
1、切割组织样品，确定组织的数量，对于样本组织的取材应在25mg以内。DNA产量与组织类型和大小有关，一般来说Img组织可得到大约0.2-1.2 ii g的DNA。
[0019]2、将切割下来的组织样品切碎(step2a),研磨(step2b):
2a.将约25毫克的组织样品切成小块。放入ー个1.5ml离心管，并添加180 u I Buffer
ATL。[0020]2b.在将组织样品置于液氮中，研磨磨彻底后倒入到1.5ml离心管。加入180 U IBuffer ATL0此过程中，液氮可以挥发，但组织不能融化。
[0021]3、加入20 ill proteinase K,振荡处理20s, 56°C水浴至组织完全裂解。
[0022]注:proteinase K必须使用，因为QIAGEN Protease在Buffer ATL存在的情况下活性已降低。裂解时间视组织块大小而定，通常l_3h即可完全裂解。过夜处理是合理的，无不良影响。为保证裂解效率，应使用振荡水浴或者振荡台。
[0023]4、1.5毫升微型离心机短时离心，以去除离心管盖内沿液体。
[0024]5、加入200 ill Buffer AL，振荡15S，70°C水浴lOmin。1.5毫升微型离心机短时离心，以去除离心管盖内沿液体。
[0025]加入Butter AL后，可能会产生白色沉淀物，70°C水浴中大都可以溶解。这些沉淀物对于抽提过程和后续实验没有影响。
[0026]6、加入200 U Iこ醇(浓度为96%_100%)，振荡15s，1.5毫升微型离心机短时离心，
以去除离心管盖内沿液体。加入こ醇后，可能会产生白色沉淀物。这些沉淀物对于抽提过程和后续实验没有影响。
[0027]7、仔细的将以上所得混合液(包括沉淀物)小心加入到QIAamp Mini spincolumn中，将离心柱放入2ml收集管中。盖紧离心管盖，以6000Xg(8000rpm)离心lmin。将离心管取出，放入一支洁净的2ml收集管中(试剂盒提供)，丢弃旧的收集管与滤液。6000 Xg (8000rpm)离心是为了减少噪音，最大速度离心不影响DNA产量和纯度。务必使所有溶液进入到收集管，如没有，则需再次以更高速度离心直至所有溶液进入收集管。
[0028]8、小心加入 500 u I Buffer AWl 到 QIAamp Mini spin column 中，盖紧离心管盖，以6000Xg(8000rpm)离心lmin。将离心管取出，放入一支洁净的2ml收集管中(试剂盒提供)。丢弃收集管及其中的虑液。
[0029]9、小心加入 500ii I Buffer AW2 到 QIAamp Mini spin column 中；盖紧离心管盖，以 20000 X g (14000rpm)离心 3min。
[0030]10、将QIAamp Mini spin column置入一支新的2ml收集管中(自备)，丢弃旧的收集管与滤液。全速离心lmin。此步是为了防止Buffer AW2残留。
[0031]11、将QIAamp Mini spin column置入一支洁净1.5ml收集管中(自备)，丢弃旧的收集管与滤液。小心在QIAamp Mini spin column中加入200 u I Buffer AE或蒸懼水。室温下静置 lmin,6000Xg(8000rpm)离心 lmin。
[0032]12、重复step 11之离心操作。将收集管盖好，保存于_20°C，此时收集管中为肿瘤和正常対照的DNA。
[0033](二)、PCR 引物设计:
针对TERT核心启动子序列设计引物,用primer5.0设计引物:TF: 5， -CAGCGCTGCCTGAAACTC-3，；
TR: 5’ -GTCCTGCCCCTTCACCTT-3’。
[0034](三)、进行PCR扩增:利用Dual 96-well GeneAmp PCR System 9700 (美国，LifeTechnologies公司)PCR扩增仪,用步骤(二)中相同的引物扩增从步骤(一)中获得的DNA模板，.按照TAKARATaqTM Hot Start PCR试剂盒的说明书要求扩增出启动子片断:
(1)、按表1中的组份配制PCR反应体系(在冰上进行反应体系的配制)。
[0035]表1PCR反应体系
【权利要求】
1.TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，所述TERT启动子的单核苷酸多态性序列为: TERT启动子chr5，I, 295，228位为C或T的碱基多态性序列； TERT启动子chr5，I, 295，242-1，295，243位为CC或TT的碱基多态性序列； TERT启动子chr5，I, 295，250位为C或T的碱基多态性序列。
2.根据权利要求1所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，其特征在于:所述泌尿系统肿瘤为膀胱移行细胞癌或上尿路上皮细胞癌。
3.根据权利要求1或2所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，其特征在于，所述应用包括下述步骤: (1)、从样本泌尿系统组织中提取DNA； (2)、以包含TERT启动子基因的待测基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增TERT启动子基因，所述引物对P为:
TF:5，-CAGCGCTGCCTGAAACTC-3，，
TR:5’ -GTCCTGCCCCTTCACCTT-3’ ； PCR扩增完成后，对PCR产物进行sanger测序，当样本中含有TERT启动子的单核苷酸多态性序列时，该样本为膀胱移行细胞癌或上尿路上皮细胞癌样本。
4.根据权利要求3所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，其特征在于，所述的PCR反应体系体积为20 iil，含有dNTP 2 u IUO X PCR Buffer2 U I ,TF(10 PM) I u 1,TR(10 U M) Iii 1、模板 DNA I U UdH2O 12.5 ii I 和 TaKaRa TaqHS 0.1。
5.根据权利要求3所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为:93°C2分钟预变性，然后按93°C I分钟，550C I分钟，72°C I分钟，共40做个循环，最后72°C 7分钟延伸。
【文档编号】C12Q1/68GK103571954SQ201310514819
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2013年10月28日
【发明者】吴松, 黄毅, 王波, 蔡志明, 梅红兵 申请人:深圳市第二人民医院