滴度，每个克隆取101CI病毒子用于ELISA，4°C保存，共取30个单克隆噬菌体，命名为 R1、R2…、R30; (2) 将81现7细胞及人膀胱正常移行上皮细胞11?1'悬液按1\104/孔的密度接种于96 孔酶联反应板，细胞培养基200y1/孔，置于37°C、5%C02、饱和湿度环境培养箱培养24h， 细胞贴壁、伸展，长满单层(每组设2个复孔）； (3) 对细胞进行无血清处理lh，吸尽培养液，TBST清洗细胞5minX3次，再用4%多聚 甲醛固定15min; (4) TBST清洗细胞5minX3次，加3%过氧化氢液100y1/孔，置于37°C孵箱30min， 阻断内源性过氧化物酶活性； (5) TBST清洗细胞 5minX3 次，加 5%PBS-BSA37°C封闭lh; (6) 吸取封闭液，分别加入滴度约K^pfu的单克隆噬菌体100yl，37°C震荡孵育 l-2h； (7)TBST洗lminX3 次；加 1:5000 稀释的HRP/Anti-M13 单克隆液 100yl，37°C震荡 孵育lh; (8)TBST洗lminX3次；用TMB显色，HC1终止反应，酶标分析仪检测450nm处OD值， 以体外第一轮洗脱得到的未结合噬菌体为阴性对照，PBS为空白对照。计算公式为：亲和力 = [BIU87 (OD45Qnm克隆一OD45Qnm阴性对照克隆）]/[iMBT(OD45Qnm克隆一OD45Qnm阴性对照克 隆）]，亲和力彡2为阳性克隆。
[0020] 9、阳性单克隆噬菌体DNA提取 参照《分子克隆》第3版及M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒说明书中提供 的方法进行； (1) 将ELISA检测后亲和力> 5的单克隆噬菌体按前述方法扩增，小心取上清lml转 入新的EP微量离心管中12000rpm离心5min，小心取800y1上清转入新的1. 5ml离心管， 用于噬菌体基因组DNA的纯化与展示多肽的序列测定； (2) 将上述1. 5ml离心管中加入400y1结合液MB，上下颠倒20次充分混匀； (3) 将上述混合物加入一个吸附柱AC中，13000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液； (4) 加入700y1含无水乙醇的漂洗液WB，12000rpm离心30秒，弃废液； (5) 将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液 中残留乙醇抑制下游反应； (6) 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜中间部位加50y1洗脱缓冲液 EB(洗脱缓冲液事先在50°C水浴中预热)，室温放置10分钟，12000rpm离心1分钟，洗脱 体积越大，洗脱效率越尚，如果需要DNA浓度较尚，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积 不应少于40y1，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量； (7) 取 30y1 送华大基因（BGI)测序，-96gIII测序引物W-H°CCCTCATAGTTAGCG TAACG-3'，DNA可以存放在2-8°C，如果要长时间存放，可以放置在-20°C。
[0021] 10、噬菌体单链DNA序列分析 根据噬菌体展示环七肽库试剂盒使用说明书有关读序指导，利用DNAman软件，查 找-96gIII引物及酶切位点KpnI(GGTACC)和EagI(CGGCCG)，两个酶切位点之间即为插 入的随机外源性多肽氨基酸，按照A-T、C-G互补原则及三联密码子学说翻译成多肽； 登陆NCBI/BLAST、SwissProt对其进行分析，对确定的氨基酸序列同数据库中已知蛋 白质的氨基酸序列进行同源性分析，并分析这些氨基酸相互之间是否存在同源性。
[0022] 11、FITC标记荧光探针的合成 根据ELISA鉴定及测序分析结果，选择克隆重复率高表达的多肽序列NYZL1，由杭州中 肽生化有限公司合成FITC标记多肽（FITC-C6-NYZL1)，通过HPLC及MW纯化、鉴定该合成肽 纯度多98%。
[0023] 12、荧光显微镜鉴定FITC标记多肽的特异性 (1) FITC标记多肽用灭菌三蒸水溶解，浓度为25ymol/1 ; (2) 将人膀胱移行细胞癌BIU87细胞以IX105/孔的密度接种于玻底培养皿中，置于 37°C、5%C02培养箱培养24h; (3) 细胞用无血清培养基处理1h，4%多聚甲醛固定20min，PBS洗3次Xlmin; (4) 2%PBS-BSA封闭1h后，加入200ylFITC标记多肽，4°C孵育过夜； (5)PBS清洗3次Xlmin，加DAPI染色液，静置8-10min，再次PBS清洗3次Xlmin，封 片后共聚焦显微镜下观察采集图片。
[0024] 13、流式细胞术鉴定FITC标记多肽的特异性 (1) 人膀胱移行细胞癌BIU87细胞制成密度为IX106/ml的细胞悬液2ml，分装于 20个离心管中； (2) FITC标记多肽用灭菌三蒸水溶解，浓度为25ymol/1 ; (3) 取10管加10y1FITC标记多肽，剩余10管加PBS作为空白对照，混匀后在室温下 避光60min; (4) lOOOrpm离心5min，PBS清洗3次Xlmin，重复两次； (5) 过滤标本，1400rpm离心4min，加入200y1Buffer，流式细胞仪进行检测。
[0025] 三、实验结果 1、成功建立异体移植BIU87细胞荷瘤鼠模型 人膀胱移行细胞癌BIU87细胞接种于裸鼠双侧前肢腋窝部位，致瘤1周后即可长出肉 眼可见的肿瘤，逐日观察记录肿块直径，待直径达2cm左右触之质硬，活动度较好，无化脓 破溃即可用于体内筛选，出瘤率达100% (如图1所示)，肿瘤组织染色后镜下观察可见肿 瘤细胞呈弥散状分布，大小较均一，细胞核大深染，呈圆形，核仁明显并可见核分裂象，胞浆 丰富(如图2所示)。
[0026] 2、噬菌体展示环七肽库体内筛选 将Ph.D. -C7C?肽库尾静脉注射入荷瘤裸鼠，经过三轮体内亲和筛选并洗脱后进行噬 菌体滴度测定，结果显示，随着每一轮筛选，噬菌体回收率不断提高，到第三轮筛选结束时， 噬菌体从肿瘤组织的回收率是第一轮的4. 334X102倍，富集效果明显(表1)。
[0027] 表1:噬菌体展示环七肽库体内筛选噬菌体克隆富集
【主权项】
1. 一种膀胱移行细胞癌细胞系BIU87特异性结合的多肽，命名为NYZL1，编码该多肽的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，即 5，-GCAATGACGACCAATCGGCGACGAACA-3, 〇
2. 根据权利要求1所述的膀胱移行细胞癌细胞系BIU87特异性结合的多肽，其氨基酸 序列如SEQ ID NO. 2所示，即 Cys Ser Ser Pro lie Gly Arg His Cys〇
3. -种膀胱移行细胞癌细胞系BIU87特异性结合的多肽在制备膀胱癌药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及筛选肿瘤组织特异性结合肽，具体为一种膀胱移行细胞癌细胞系BIU87特异性结合的多肽及其应用，命名为NYZL1，编码该多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示， 以及膀胱移行细胞癌细胞系BIU87特异性结合的多肽在制备膀胱癌药物中的应用，本发明利用噬菌体展示技术，以我国第一株自建人膀胱癌细胞BIU87为靶细胞，筛选出与人膀胱癌BIU87细胞特异性结合的噬菌体克隆，获得能与人膀胱癌靶向结合的氨基酸序列，本发明采用荷瘤动物模型进行完全体内筛选，最大限度的模拟膀胱癌组织中的实际内环境，借助自身组织、器官为对照，丰富了筛选靶蛋白的范围，提高筛选的特异性，为膀胱癌早期诊断、抗肿瘤药物制备提供一定的理论依据。
【IPC分类】C07K7-06, A61K38-08, A61P35-00, C12N15-11
【公开号】CN104593359
【申请号】CN201410824193
【发明人】杨晓峰, 张帆, 罗俊茜
【申请人】山西医科大学第一医院
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月26日