使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种使耐药菌菌敏感性恢复的方法，具体涉及一种使产ESBLs的多重 耐药菌敏感性恢复的方法。
【背景技术】
[0002] 目前全球进入了抗生素后时代，国内多重耐药菌的检出率超过50% ;2012年《中 华感染学杂志》刊出：产超广谱酶的多重耐药菌阳性率为52. 4% ;《药物流行病学杂志》报 道肺炎克雷伯产超广谱酶的阳性率为49. 3%，大肠杆菌产超广谱酶的阳性率为45. 4% ;现 在多重耐药菌感染已经危及到儿童的健康，2010全国监控网报道：0-14岁儿童肺炎克雷伯 产超广谱酶的阳性率为64. 9%，大肠杆菌产超广谱酶的阳性率为69. 9% .数据显示产超广 谱酶的阳性率儿童比成人高。
[0003] 其次，医院由于使用抗生素和消毒液，医院环境中大部分是多重耐药菌，在医院出 生的新生儿，其最初建立正常菌群时的细菌就可能就是多重耐药菌，所以新生儿一旦生病， 做培养时大约四分之三都是多重耐药菌，探索恢复多重耐药细菌敏感性的方法已经成为一 个崭新的课题。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法，显示多重耐药菌 在营养丰富的培养基传代可以恢复部分抗生素敏感性，本发明的方法切实可行，其结果具 有准确、可靠的优点。
[0005] 一种使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法，包括如下步骤：
[0006] (1)选取临床产ESBLs的多重耐药菌为原始菌株，保藏备用；
[0007] (2)将所述原始菌株经增菌、分离制备成菌悬液；
[0008] (3)将所述菌悬液转种到一个血液增菌肉汤管，同时转种到一个分离平皿，分别传 代培养18_24h，在所述分离平皿中形成菌落；然后观察分离平皿中的所述菌落，若所述菌 落单纯无污染，说明本次传代合格，若所述菌落有污染，则重新进行本次传代，直到所述菌 落无污染为止；然后将所述血液增菌肉汤管中的菌悬液转种到另一个血液增菌肉汤管中并 同时转种到另一个分离平皿中；重复以上步骤至少至20代；
[0009] (4)将步骤（3)得到的最后一个血液增菌肉汤管中的菌悬液转种到血培养皿中进 行分离培养18_24h，产生典型菌落，对所述典型菌落进行药敏试验，同时与所述原始菌株的 药敏进行比较，得出血液增菌肉汤管传代培养得到的细菌的药物敏感性恢复情况。
[0010] 本发明所述使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法，其中，所述产ESBLs 的多重耐药菌为肺炎克雷伯菌ESBL(Klebsiella peneumoniae ESBL)或大肠埃希菌 ESBL(Escherichia coli ESBL);所述肺炎克雷伯菌 ESBL，保藏号 CCTCC NO :M 2014594,保 藏日期：2014年11月25日，现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大 学；所述大肠埃希菌ESBL，保藏号CCTCC NO :M 2014593,保藏日期：2014年11月25日，现 已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学。
[0011] 本发明所述使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法，其中，所述步骤（1)具体 包括如下步骤：
[0012] 取所述原始菌株的典型菌落接种到含有菌种保存液的尖底微量离心管内，-20°C 低温保存，所述菌种保存液为质量分数为15%甘油胰化酪蛋白大豆汤，其具体成分为：胰 化酪蛋白17g/L，大豆胨3g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2. 5g/L，葡萄糖2. 5g/L，其余为蒸馏 水。
[0013] 本发明所述使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法，其中，所述步骤（2)具体 包括如下步骤：
[0014] 首先把所述冷藏的尖底微量离心管内的菌株经过增菌培养，所述增菌培养为取少 量所述菌株加入增菌培养管内，置于35土rc培养18-24h;然后再进行分离培养，所述分离 培养具体步骤如下：用接种环蘸取所述增菌培养后的菌悬液，划线接种到营养琼脂平皿上， 置于35±1°C培养18-24h，可见单一菌落，判定所述菌株有无污染，如无污染则该增菌培养 物即为试验用菌悬液，若有污染则重新做上述步骤，直至无污染为止。
[0015] 本发明所述使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法，其中，所述步骤（3)具体 包括如下步骤：
[0016] a、将所述菌悬液转种到所述血液增菌肉汤管，同时转种到所述分离平皿，分别传 代培养，所述传代培养为在35±1°C条件下培养18_24h，所述分离平皿中形成菌落；
[0017] b、观察所述分离平皿中的菌落，若所述菌落单纯无污染，说明本次传代合格，若所 述菌落有污染，则重新进行本次传代，直到所述菌落无污染为止；
[0018] c、将所述血液增菌肉汤管和分离平皿分别编号为AjPB1;
[0019] 将所述A1血液增菌肉汤管中的菌悬液按照所述步骤a和b进行传代，并将转种的 血液增菌肉汤管和分离平皿分别编号为4和B 2;
[0020] 将所述A2血液增菌肉汤管中的菌悬液按照所述步骤a和b进行传代，并将转种的 血液增菌肉汤管和分离平皿分别编号为^和B 3;
[0021] 将所述A3血液增菌肉汤管中的菌悬液按照所述步骤a和b进行传代，并将转种的 血液增菌肉汤管和分离平皿分别编号为?和B 4;
[0022] 按照上述方法连续传代30次，最后一次传代的血液增菌肉汤管和分离平皿分别 编号为AdP B3tl。
[0023] 本发明所述使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法，其中，所述步骤（4)具体 包括如下步骤：
[0024] 将步骤（3)得到的A3tl血液增菌肉汤管中的菌悬液转种到血培养皿中进行分离培 养18-24h，产生典型菌落，对所述典型菌落进行药敏试验，同时与所述原始菌株的药敏进行 比较，得出血液增菌肉汤管传代培养得到的细菌的药物敏感性恢复情况。
[0025] 中测定药敏所用的仪器为法国梅里埃全自动细菌鉴定/药敏分析仪，型号：ViETK 2Compact〇
[0026] 本发明所述使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法，其中，所述其血液增 菌肉汤管中含有血液增菌肉汤，其组分为：蛋白胨10. 〇g/L ;牛肉浸出粉3. Og/L;氯化钠 5. Og/L;葡萄糖I. Og/L;枸橼酸钠3. Og/L;磷酸氢二钾2g g/L;对氨基苯甲酸0. 05g/L;硫 酸镁2. 4g/L ;酚红0. 024g/L ;其余为蒸馏水；血液增菌肉汤pH值为7. 3?7. 5 ;经121°C灭 菌15min和35°C，24h无菌试验备用。
[0027] 本发明所述使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法，其中，所述菌种保存液 制法为：将所述菌种保存液各成分混均匀，加热溶解得到混合液，校正所述混合液的PH值 至7. 0?7. 5后，过滤所述混合液并将滤液分装于I. 5ml尖底微量离心管内，每管0. 6ml， 121°C条件下高压灭菌15分钟。
[0028] 本发明方法操作过程中应注意的问题如下：
[0029] 排除污染：未使用的血液增菌肉汤管预先放到孵育箱预培养2天，以排除肉汤管 的污染，隔离衣经高压灭菌，使用一次性口罩和帽子.
[0030] 检查实验设备的完好性：35±1°C孵育箱；试验前用75%酒精消毒擦拭孵育箱，细 菌室专用台式高压灭菌器；法国梅里埃全自动细菌鉴定/药敏分析仪等；
[0031] 操作环境的准备：试验在二级生物安全室进行，每次实验前首先打开房间和超净 台的紫外线消毒40分钟以上，消毒前预先把接种环、接种针、临床的检出的产ESBLs的多重 耐药菌菌悬液（已编码的）放进超净台；严格无菌操作：洗净双手，穿灭菌隔离衣，带一次 性口罩、帽子、带无菌手套。
[0032] 与现有技术相比，本发明方法具有如下优点：
[0033] 本发明方法是探索多重耐药菌恢复对抗生素的敏感性，为临床提供可靠的药物敏 感试验信息，指导抗生素应用，本发明方法用血液增菌培养管对多重耐药菌转种传代20-30 代，了解多重耐药菌在脱离抗生素的高营养环境中对抗生素的敏感性恢复情况。
[0034] 本发明方法用多重耐药菌在血液增菌肉汤管内连续20-30代传代，通过实验证明 产ESBLs肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌脱离抗生素环境，在营养丰富的血液增菌肉汤管培养， 对部分抗生素的敏感性恢复了，可以预测人类患病治疗后体内残存的少许多重耐药菌，或 者是在医院生产的新生儿的携带的多重耐药菌，脱离抗生素环境一段比较长的时间后其敏 感性能够恢复。
[0035] 本发明方法中细菌的传代是在血液增菌肉汤管中进行的（类似人体环境），得到 的数据更加真实可靠，对今后人类抗生素的使用有指导意义。
【具体实施方式】
[0036] 实施例1
[0037] 一种使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法，包括如下步骤：
[0038] (1)选取临床产ESBLs的多重耐药菌为原始菌株，保藏备用；
[0039] (2)将所述原始菌株经增菌、分离制备成菌悬液；
[0040] (3)将所述菌悬液转种到一个血液增菌肉汤管，同时转种到一个分离平皿，分别传 代培养18_24h，在所述分离平皿中形成菌落；然后观察分离平皿中的所述菌落，若所述菌 落单纯无污染，说明本次传代合格，若所述菌落有污染，则重新进行本次传代，直到菌落无 污染为止；然后将所述血液增菌肉汤管中的菌悬液转种到另一个血液增菌肉汤管中并同时 转种到另一个分离平皿中；重复以上步骤至少至20代；
[0041] (4)将步骤（3)得到的最后一个血液增菌肉汤管中的菌悬液转种到血培养皿中进 行分离培养18_24h，产生典型菌落，对所述典型菌落进行药敏试验，同时与所述原始菌株的 药敏进行比较，得出血液增菌肉汤管传代培养得到的细菌的药物敏感性恢复情况。
[0042] 实施例2
[0043] -种使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法，包括如下步骤：
[0044] (1)选取产肺炎克雷伯菌ESBL或大肠埃希菌ESBL为原始菌株，保藏备用：所述产 ESBLs的多重耐药菌为肺炎克雷伯菌ESBL或大肠埃希菌ESBL ;所