述肺炎克雷伯菌ESBL，保 藏号CCTCC NO :M 2014594,保藏日期：2014年11月25日；所述大肠埃希菌ESBL，保藏号 CCTCC NO :M 2014593,保藏日期：2014 年 11 月 25 日；
[0045] 取所述原始菌株的典型菌落接种到含有菌种保存液的尖底微量离心管内，-20°C 低温保存，所述菌种保存液为15%甘油胰化酪蛋白大豆汤，其具体成分为：胰化酪蛋白 17g/L，大豆胨3g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2. 5g/L，葡萄糖2. 5g/L，其余为蒸馏水；
[0046] 菌种保存液制法为：将所述菌种保存液各成分混均匀，加热溶解得到混合液，校正 所述混合液的PH值至7. 0?7. 5后，过滤所述混合液并将滤液分装于I. 5ml尖底微量离心 管内，每管0.6ml，121°C条件下高压灭菌15分钟；
[0047] (2)首先把所述冷藏的尖底微量离心管内的菌株经过增菌培养，所述增菌培养为 取少量所述菌株加入增菌培养管内，置于35±1°C培养18-24h;然后再进行分离培养，所述 分离培养具体步骤如下：用接种环蘸取所述增菌培养后的菌悬液，划线接种到营养琼脂平 皿上，置于35± I °C培养18-24h，可见单一菌落，判定所述菌株有无污染，如无污染则该增 菌培养物即为试验用菌悬液，若有污染则重新做上述步骤，直至无污染为止；
[0048] 所述增菌肉汤管中含有血液增菌肉汤，其组分为：蛋白胨10. Og/L;牛肉浸出粉 3. Og/L;氯化钠5. Og/L;葡萄糖I. Og/L;枸橡酸钠3. Og/L;磷酸氢二钾2g g/L;对氨基苯甲 酸0. 05g/L ;硫酸镁2. 4g/L ;酚红0. 024g/L ;其余为蒸馏水；血液增菌肉汤pH值为7. 3? 7. 5;经121°C灭菌15min和35°C，24h无菌试验备用；
[0049] (3) a、将所述菌悬液转种到所述血液增菌肉汤管，同时转种到所述分离平皿，分别 传代培养，所述传代培养为在35±1°C条件下培养18-24h，所述分离平皿中形成菌落；[0050] b、观察所述分离平皿中的菌落，若所述菌落单纯无污染，说明本次传代合格，若所 述菌落有污染，则重新进行本次传代，直到所述菌落无污染为止；
[0051] c、将所述血液增菌肉汤管和分离平皿分别编号为AjPB1;
[0052] 将所述A1血液增菌肉汤管中的菌悬液按照所述步骤a和b进行传代，并将转种的 血液增菌肉汤管和分离平皿分别编号为4和B 2;
[0053] 按照上述方法连续传代30次，最后一次传代的血液增菌肉汤管和分离平皿分别 编号为AdPB3tl;
[0054] 将所述A2血液增菌肉汤管中的菌悬液按照所述步骤a和b进行传代，并将转种的 血液增菌肉汤管和分离平皿分别编号为^和B 3;
[0055] 将所述A3血液增菌肉汤管中的菌悬液按照所述步骤a和b进行传代，并将转种的 血液增菌肉汤管和分离平皿分别编号为?和B 4;
[0056] 本实验严格无菌操作，并且实验前采取排除污染，使用均是无菌物品，故传代过程 中没有发生污染情况；
[0057] (4)将步骤（3)得到的A3tl血液增菌肉汤管转种到血培养皿中进行培养，取培养产 生的典型菌落进行药敏试验，同时与原始菌株的药敏进行比较，得出血液增菌肉汤管传代 培养得到的细菌的药物敏感性恢复情况；测定药敏所用的仪器为法国梅里埃全自动细菌鉴 定/药敏分析仪，型号：ViETK 2Compact。
[0058] 本实施例测得结果如下：
[0059] 产ESBLs的大肠埃希菌传代前后的药敏试验结果
[0060] 产ESBLs的大肠埃希菌不同菌株编号Yb Y18，把临床检测的产ESBLs的大肠埃希 菌传代培养30次，13株产ESBLs的大肠埃希菌，经过血液肉汤传代，其中有10株合计25种 抗生素敏感性恢复，4株有2种抗生素（左氧氟沙星、氨苄/舒）由中敏变成耐药，其对不同 抗菌药物的敏感性恢复的现象见表1。
[0061] 表1产ESBLs的大肠埃希菌血液增菌肉汤传代前后的药敏试验结果比较
[0062]
【主权项】
1. 一种使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 选取临床产ESBLs的多重耐药菌为原始菌株，保藏备用； (2) 将所述原始菌株经增菌、分离制备成菌悬液； (3) 将所述菌悬液转种到一个血液增菌肉汤管，同时转种到一个分离平皿，分别传代培 养18-24h，在所述分离平皿中形成菌落；然后观察所述菌落，若所述菌落单纯无污染，说明 本次传代合格，若所述菌落有污染，则重新进行本次传代，直到所述菌落无污染为止；然后 将所述血液增菌肉汤管中的菌悬液转种到另一个血液增菌肉汤管中并同时转种到另一个 分离平皿中；重复以上步骤至少至20代； (4) 将步骤（3)得到的最后一个血液增菌肉汤管中的菌悬液转种到血培养皿中进行分 离培养18-24h，产生典型菌落，对所述典型菌落进行药敏试验，同时与所述原始菌株的药敏 进行比较，得出血液增菌肉汤管传代培养得到的细菌的药物敏感性恢复情况。
2. 根据权利要求1所述使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法，其特征在于，所述 产ESBLs的多重耐药菌为肺炎克雷伯菌ESBL或大肠埃希菌ESBL ;所述肺炎克雷伯菌ESBL， 保藏号CCTCC NO:M 2014594,保藏日期：2014年11月25日；所述大肠埃希菌ESBL，保藏号 CCTCC NO :M 2014593,保藏日期：2014 年 11 月 25 日。
3. 根据权利要求2所述使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法，其特征在于，所述 步骤（1)具体包括如下步骤： 取所述原始菌株的典型菌落接种到含有菌种保存液的尖底微量离心管内，-20°C低温 保存，所述菌种保存液为15%甘油胰化酪蛋白大豆汤，其具体成分为：胰化酪蛋白17g/L， 大豆胨3g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2. 5g/L，葡萄糖2. 5g/L，其余为蒸馏水。
4. 根据权利要求3所述使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法，其特征在于，所述 步骤（2)具体包括如下步骤： 首先把所述冷藏的尖底微量离心管内的菌株经过增菌培养，所述增菌培养为取少量所 述菌株加入增菌培养管内，置于35±1°C培养18-24h ;然后再进行分离培养，所述分离培养 具体步骤如下：用接种环蘸取所述增菌培养后的菌悬液，划线接种到营养琼脂平皿上，置于 35土 1°C培养18-24h，可见单一菌落，判定所述菌株有无污染，如无污染则该增菌培养物即 为试验用菌悬液，若有污染则重新做上述步骤，直至无污染为止。
5. 根据权利要求4所述使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法，其特征在于，所 述步骤（3)具体包括如下步骤： a、 将所述菌悬液转种到所述血液增菌肉汤管，同时转种到所述分离平皿，分别传代培 养，所述传代培养为在35±1°C条件下培养18-24h，所述分离平皿中形成菌落； b、 观察所述分离平皿中的菌落，若所述菌落单纯无污染，说明本次传代合格，若所述菌 落有污染，则重新进行本次传代，直到所述菌落无污染为止； c、 将所述血液增菌肉汤管和分离平皿分别编号为&和B 1; 将所述4血液增菌肉汤管中的菌悬液按照所述步骤a和b进行传代，并将转种的血液 增菌肉汤管和分离平皿分别编号为八2和B 2; 将所述A2血液增菌肉汤管中的菌悬液按照所述步骤a和b进行传代，并将转种的血液 增菌肉汤管和分离平皿分别编号为A#P B 3; 将所述A3血液增菌肉汤管中的菌悬液按照所述步骤a和b进行传代，并将转种的血液 增菌肉汤管和分离平皿分别编号为八4和B 4; 按照上述方法连续传代30次，最后一次传代的血液增菌肉汤管和分离平皿分别编号 为 A3(i和 B3Q。
6. 根据权利要求5所述使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法，其特征在于，所述 步骤（4)具体包括如下步骤： 将步骤（3)得到的A3(l血液增菌肉汤管中的菌悬液转种到血培养皿中进行分离培养 18-24h，产生典型菌落，对所述典型菌落进行药敏试验，同时与所述原始菌株的药敏进行比 较，得出血液增菌肉汤管传代培养得到的细菌的药物敏感性恢复情况。
7. 根据权利要求6所述使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法，其特征在于，所述 血液增菌肉汤管中含有血液增菌肉汤，其组分为：蛋白胨10. 〇g/L ;牛肉浸出粉3. Og/L ;氯 化钠5. Og/L ;葡萄糖1. Og/L ;枸橼酸钠3. Og/L ;磷酸氢二钾2g g/L ;对氨基苯甲酸0. 05g/ L ;硫酸镁2. 4g/L ;酚红0. 024g/L ;其余为蒸馏水；所述血液增菌肉汤pH值为7. 3?7. 5 ; 经121°C灭菌15min和35°C，24h无菌试验备用。
8. 根据权利要求7所述使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法，其特征在于，所述 菌种保存液制法为：将所述菌种保存液各成分混均匀，加热溶解得到混合液，校正所述混合 液的PH值至7. 0?7. 5后，过滤所述混合液并将滤液分装于1. 5ml尖底微量离心管内，每 管0. 6ml，121°C条件下高压灭菌15分钟。
【专利摘要】本发明公开了一种使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法，包括如下步骤：(1)从临床选取原始菌株，保藏备用；(2)将所述各原始菌株经增菌、分离制备成菌悬液；(3)转种并经血液增菌肉汤管传代；(4)测定药敏，得出血液增菌肉汤管传代培养得到的细菌的药物敏感性恢复情况。本发明使产ESBLs的多重耐药菌敏感性恢复的方法切实可行，其结果具有准确、可靠的优点。CCTCC NO：M 201459420141125CCTCC NO：M 201459320141125
【IPC分类】C12R1-19, C12R1-22, C12N1-20
【公开号】CN104611261
【申请号】CN201510046356
【发明人】田恒忠, 孟祥清, 邢浩莉, 孙丹, 赵淑海, 万莉, 倪宁, 吕红光, 任忠, 杨洁, 李倩, 卜小芳, 陈玲, 尹晓玲, 秦国娟
【申请人】淮南市妇幼保健院, 邢浩莉
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月29日