化酶的启动子和终止子。
[0020] 重组质粒地巧oD的构建： 将巧oD的PCR产物利用E. Z. N. A?Gel Extraction Kit进行纯化后，用公a紐I和思a I处理，再连接到与质粒地BRlMCS-tet所对应的限制性位点即得重组质粒地巧oD，所述 pBBRlMCS-tet含有丙丽酸脱駿化酶的启动子和终止子。
[00川 实施例2 耐己醇运动发酵单胞菌的制备： 将实施例1中所得的重组质粒地皿poD通过电转化的方式，转化入Z. mobilis ZM4中， 将经质粒转化后的细菌铺于含有5 y g/ml四环素的RM琼脂固体平板培养基上，刮取单克隆 置于M液体培养基中，在3(TC下静置培养过夜。
[0022] 对组菌株的制备： 将实施例1中所得的重组质粒地巧oD通过电转化的方式，转化入Z. mobilis ZM4中， 将经质粒转化后的细菌铺于含有5 y g/ml四环素的RM琼脂固体平板培养基上，刮取单克隆 置于M液体培养基中，在3(TC下静置培养过夜。对照菌株ZM4-巧oD中的rpoD未受任何突 变处理。
[002引 实施例3 1)细菌生长的表征： 将实施例2所得本发明菌株ZM4-m巧oD和对照菌株ZM4-巧oD于RM培养基，在3(TC下 培养至0D600=1. 0,再进行10倍梯度稀释，将稀释后的菌液铺于含有不同浓度己醇的RM琼 脂固体平板上，于3(TC培养4-5天。
[0024] 2)生长曲线的绘制 将实施例2所得本发明菌株ZM4-mrpoD和对照菌株ZM4-巧oD于Bioscreen C system 中进行培养。取十分之一（v/v)的过夜菌液加入1ml含有不同己醇浓度（0%、6%、8%、10%) 的新鲜M液体培养基中，加入后，菌液的浓度为0D600=0. 15-0. 20。然后，将细菌加入 Bioscreen plate上，每孔加入量为300 y 1，将温度控制在30°C，0D设为600,每隔比测定 一次吸光度，一共进行1化，每次测定时，将细菌培养物摇晃60s。
[00巧]如说明书附图1所示，本发明菌株ZM4-m巧oD与对照菌株ZM4-巧oD在没有己醇 时，生长情况没有显著差别，当己醇浓度为6%或8%时，对照菌株ZM4-巧oD的生长能力显著 下降，而当己醇浓度为10%时，对照菌株ZM4-巧oD几乎不再生长。而本发明菌株ZM4-m巧oD 在己醇浓度为6%和8%时均能很好生长，在己醇浓度为10%时也具有一定生长能力。
[0026] 如说明书附图2所示，本发明菌株ZM4-m巧oD与对照菌株ZM4-巧oD在没有己醇 时，生长曲线没有显著差别。在己醇浓度为5%时，本发明菌株ZM4-m巧oD在7-8小时后，便 进入稳定期，比对组菌株ZM4-巧oD早3小时；当己醇浓度为8%时，本发明菌株ZM4-m巧oD 的最高菌浓可达〇D600=0. 9,而对照菌株ZM4-巧oD只能达到0D600=0. 4 ;当己醇浓度为10〇/〇 时，本发明菌株ZM4-m巧oD的生长也显著快于对照菌株ZM4-巧oD。
[0027] 实施例4 己醇胁迫条件下细菌对葡萄糖的消耗利用： 将实施例2所得本发明菌株ZM4-m巧oD和对照菌株ZM4-巧oD置于含有20g/L的RM培 养基中，于3(TC培养至对数中期，取10ml菌液加入到100ml含有9%己醇的新鲜RM液体培 养基中，加入后，菌液的0D600为0.2左右。将细菌于3(TC下培养2-3天。培养过程中，每 隔化取1ml菌液作为测试样品，共取9次，样品存于-2(TC中。葡萄糖浓度是利用硫酸作为 流动性，通过HPLC进行测定的，流动相流速为0. 6ml/min，柱温为35C。
[0028] 如说明书附图3所示，在含有己醇浓度为9%的RM培养基中，本发明菌株 ZM4-m巧oD在培养4她后，菌浓便达到了 0Dew=l. 5,而对照菌株ZM4-巧oD的菌浓仅为 0化00二0. 8。
[0029] 在含有己醇浓度为9%的培养基中培养2化之后，本发明菌株ZM4-m巧oD消耗了近 78%的葡萄糖，而对照菌株ZM4-巧oD仅仅消耗了 35%左右的葡萄糖；培养5化之后，本发明 菌株ZM4-m巧oD消耗了近93%的葡萄糖，而对照菌株ZM4-巧oD仅消耗了 70%左右的葡萄糖。
[0030] 实施例5 定量PCR检测： 利用BI0PRAD Real-Time PCR系统对a化B和pdc的表达进行检测。所用引物由引物 设计软件设计，并在目标基因的3端上扩增约l(K)bp。PCR的过程为；94°C变性15min进入 循环，循环参数为；94°C变性20s，6(TC退火30s，共循环40次，然后于72C延伸5min。PCR 扩增产物用SYBR Green进行检测。编码有16S RNA的基因作为内生性控制基因。本 发明所用引物序列如表1所示： 表1
【主权项】
1. 一株耐乙醇运动发酵单胞菌，其特征在于，所述耐乙醇运动发酵单胞菌含有经突变 改造后的rpoD基因，该基因编码的RpoD蛋白的点突变为Q57L、G426C和I448N ;所述耐乙 醇运动发酵单胞菌能耐受初始浓度至少为9%的乙醇；所述耐乙醇运动发酵单胞菌的分类 命名％ZymomonasmobilisZM4_mropD，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏 号为CGMCC NO. 10617,保藏时间为2015年3月12日。
2. 制备如权利要求1所述耐乙醇运动发酵单胞菌的方法，其特征在于，所述方法包括 如下步骤： 1) 突变 rpoD 基因的制备：利用 GeneMorph II Random Mutagenesis Kit 对 rpoD 的 PCR产物进行易错聚合酶链式反应；筛选出编码蛋白的点突变在Q57L、G426C和I448N的突 变rpoD基因； 2) 重组质粒pBmrpoD的构建：将步骤1)所得物进行纯化后，用ifeMl I和I 处理，再连接到与质粒pBBRIMCS-tet所对应的限制性位点即得重组质粒pBmrpoD，所述 pBBRIMCS-tet含有丙酮酸脱羧化酶的启动子和终止子； 3) 将重组质粒pBmrpoD转化入运动发酵单胞菌Z. mobilis ZM4中，并在培养基中进行 培养； 4) 将步骤3)的培养物接种到含有乙醇的培养基中，乙醇初始浓度为7-9%，经三轮筛选 后，将菌液涂布于含有9%乙醇和5 y g/ml四环素的固体培养基上培养，随机挑选单克隆， 提取质粒后，进行DNA测序。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述纯化是利用E. Z. N. A?Gel Extraction Kit，并严格按照产品说明书操作说明进行的。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)和步骤4)中，所述培养基为RM培 养基。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3中，所述转化为电转化。
6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3中，在所述培养时，培养方式为：先 于RM固体培养基进行培养，再于RM液体培养基中在30°C下静置过夜培养。
7. 权利要求1所述的耐乙醇运动发酵单胞菌在乙醇生产上的应用。
【专利摘要】本发明提供了一株耐乙醇运动发酵单胞菌，该耐乙醇单胞菌含有经突变改造后的rpoD基因，该基因编码的RpoD蛋白的点突变为Q57L、G426C和I448N；所述耐乙醇运动发酵单胞菌能耐受初始浓度至少为9%的乙醇；所述耐乙醇运动发酵单胞菌的分类命名为Zymomonas mobilis (ZM4-mropD)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.10617，保藏时间为2015年3月12日。本发明还提供了制备该菌株的方法，其包括：突变rpoD基因的制备、重组质粒pBmrpoD的构建、质粒转化以及利用不同梯度乙醇进行筛选。本发明菌株能耐受初始浓度至少为9%的乙醇，制备方法易操作。本发明还公布该菌株在生产乙醇的应用。CGMCC NO.1061720150312
【IPC分类】C12N15-54, C12P7-06, C12N1-21, C12N15-74, C12R1-01
【公开号】CN104673737
【申请号】CN201510151269
【发明人】谭芙蓉, 何明雄, 吴波, 代立春, 秦晗, 祝其丽, 胡启春
【申请人】农业部沼气科学研究所
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年4月1日