一种皮质抑素生长抑素双表达dna疫苗及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物基因免疫技术领域，具体地说设及一种皮质抑素生长抑素双表 达DNA疫苗及制备方法和应用，包括将生长抑素融合己肝表面抗原表达基因S/2SS和皮质 抑素融合己肝表面抗原表达基因克隆到具有双表达质粒载体pIRES中，之后转化大肠杆菌 D册a ;还设及该疫苗在促进小鼠生长中的应用。 技术背景
[0002] 生长抑素（S巧是下丘脑释放的14肤激素，在动物体内具有广泛的抑制作用，特别 对生长及泌乳具有明显的影响。许多研究证实，应用SS主动或被动免疫动物可W提高GH 水平，促进动物生长和泌乳。由于生长抑素分子量小（1658kD)，免疫原性弱，生长抑素常规 免疫时都要与蛋白载体偶联或与蛋白基因等重组W增强生长抑素的免疫原性。国外已报道 的有应用SS抗血清被动免疫或化学合成SS制成免疫原主动免疫羊、牛等家畜，可W显著 提高增重效果，但免疫维持时间短，且化学合成多肤疫苗成本高，基因工程表达产物纯化繁 杂，不利于生产推广。国内已开发出激生I号、激生II号等促生长产品，即利用基因工程原 理将SS与化sAg融合基因插入到痘苗病毒的TK基因，构建重组痘苗病毒，接种到鸡胚或细 胞上培养产生表达SS-冊sAg融合蛋白的痘苗病毒活载体苗。但此重组活载体疫苗常因诱 发机体对载体自身的免疫反应而不能重复使用，此外还存在毒力回升等安全性问题。生长 抑素基因免疫可望克服该一缺点，成为促进动物生长的新途径。
[0003] 生长抑素DNA疫苗免疫原理是通过机体免疫体系激活识别反应原从而产生SS抗 体，中和内源性SS，达到促使体内GH的增加，从而促进动物机体生长。本实验室在研究生 长抑素DNA疫苗优化构建上梁爱屯、等构建了真核pGM-CSF/SS生长抑素基因疫苗（专利号： ZL 200610125580. 2)并在小鼠生长上进行口服免疫观察对其生长的影响，结果显示SS基 因免疫可W有效提高小鼠的体增重，且增重与产生的抗生抑素抗体呈显著相关关系。同时 利用佐剂来提高生长抑素免疫原性，薛春林等利用CpGDNA序列的核酸佐剂可W提高GH及 IGF-1的分泌水平，促进生长抑素DNA疫苗的免疫效果。严婷等（2006)构建含化sA评S S 的减毒沙口氏菌口服SS基因疫苗，结果表明该疫苗进入体内不仅表达皿SPSS融合蛋白， 刺激机体产生SS抗体促进动物生长，还一定程度上产生增强免疫作用。Han等（2008) W VP22作为佐剂构建生长抑素祀GS2SS-V疫苗，证实小鼠试验实验组体增重方面提高14. 1 % (P < 0. 05)。由于DNA载体疫苗的抗性基因引起的生产成本高、导致临床抗药菌株的播散 及被免疫动物的过敏不良反应的问题，本实验梁爱屯、等成功构建非抗性筛选菌生长抑素真 核表达质粒PGS/2SS (专利号；ZL 200810197981. 8)，采用肌肉注射和口服两种方式免疫B a化/C鼠，且采用了不同剂量组、不同免疫次数来验证生长抑素DNA疫苗效果。其结果发现， 肌肉注射免疫效果要比口服注射的免疫效果IgA、IgG、IgGl、gG2a抗体水平反应强烈，且增 重效果增加。
[0004] 生长抑素DNA疫苗发展到现阶段，选用了单表达SS真核质粒，无论是在质粒载体 上的选择，SS基因片段数目（单拷贝和双拷贝）W及通过增加佐剂提高生长抑素DNA疫 苗促生长效果都做了大量的研究工作，在该些基础上，生长抑素DM疫苗在免疫小型动物 的免疫应答和增重效果方面取得了较好的效果，但在大动物中免疫裸质粒的效果却不是很 佳。
[0005] 皮质抑素（cortistatin, CST)是de Lecea等1996年在哺乳动物大脑皮质中发 现的能够抑制皮质活动的神经肤，在结构上与生长抑素SS具有高度同源性。CST能够与 S种受体相结合；生长抑素受体（somatostatin rec巧tors, SSTRs)、生长激素促分泌物 觉体 la(grow hor mone secretagogues rec巧torla,細SRla)和 Mas 相关基因 X2 觉体 (Mas-related geneX化e c巧tor,化巧2)。CST的初级表达产物前皮质抑素原由116个 氨基酸残基组成，其序列同前生长抑素原具有高度同源性。前皮质抑素含有N-末端分泌 信号序列和成对的碱性氨基酸残基是激素原转化酶的作用位点。去信号肤序列后，皮质 抑素原进一步裂解产生成熟的CST肤：在大鼠和小鼠位14肤的CST(CST-14)和29肤的 CST(CST-29)。CST-14与SS-14由11个氨基酸残基相同，其中包括FWKT四聚体结构（FWKT 四聚体是SS与其受体结合的关键性结构）和两个同源性脱氨酸残基。研究表明CST-14 和SS-14均相似程度地抑制正常人的生长激素佑H)、膜岛素和曲relin的分泌。CST-14 和SST-14也均能相似程度的抑制生长激素释放激素（GHRH)的促GH释放反应。化relin 比GHRH具有更强的促細释放能力，而且能够被CST-14或SS-14抑制炬roglio F，Arvat E，Benso A，et al. Endocrin e activities of cortistatin-Hand its interaction with GHRH and 組relin in humans. J Clin Endocrinol Metab. 2002;87:3783-90.)。由 于生长抑素DM疫苗在前期的研究主要处在生长抑素SS和其他生长因子的融合蛋白的作 用机理研究，但从内分泌调控通路着手，通过利用有IRES元件的双表达载体PIRESKat. No. 631605)将与SS相似生理作用的CST和SS共通构建双表达DM疫苗，从单个融合蛋白 的表达到SS和CST两种融合蛋白的双表达，从一种内分泌生长调控途径的变成两种，双表 达皮质抑素-生长抑素DNA疫苗促生长作用的研究国内外尚无类似报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供了一种皮质抑素生长抑素双表达的质粒PIRES-S/ CST14-S/2SS，该质粒可作为DM疫苗免疫动物。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供了 一种促进动物生长的DNA疫苗菌株 D册a(pIRES-S/CST14-S/2S巧；该菌株已于2014年11月20日送至中国典型培养物保藏中 屯、保藏，分类命名；大肠杆菌巧scherichia coli)D册a(pIRES-S/CST14-S/2S巧，保藏编号； CCTCC NO ;M2014583,该菌株通过SDS碱裂解法抽提即可得到PIRES-S/CST14-S/2SS质粒。 [000引本发明的最后一个目的是提供一种皮质抑素生长抑素双表达的质粒pIRES-S/ CST14-S/2S S或包含其的大肠杆菌在制备促进动物生长疫苗中的应用，将该质粒作为疫苗 直接免疫动物或与DNA疫苗佐剂混合后免疫动物，可促进动物生长。
[0009] 本发明通过如下技术方案实施：
[0010] 一种皮质抑素生长抑素双表达的DNA疫苗，是将合成好的皮质抑素14肤基因片段 CS T14融合己肝表面抗原基因的融合基因（S/CST14)酶切回收后插入到质粒pIRES上获 得pi RES-S/CST14质粒，再从质粒PCS/2SS扩增到含有双拷贝生长抑素14肤的己肝表面 抗原融合基因片段（S/2S巧插入到质粒PIRES-S/CST14中，获得皮质抑素生长抑素双表达 DM质粒PIRES-S/CST14-S/2SS，该质粒即为本发明的DM疫苗。
[0011] 具体如下：
[001 引 1)根据 cortistatin (Mus mus州lus)基因序列 GenBank(NM_007745. 3)，合成 coi~tistatin-14(CST-14)的cDNA序列其两端的酶切位点为Nde I和EcoR I，获得CST14 片段；W含化P atitis B virus s1:rain Huashan 己肝表面抗原片段 GenBank (抓926424) 的质粒pVAXl-S(将S片段佑enBank(抓926424)插入到pVAXl质粒。）为载体，通过碱基合 成方法将CST14片段克隆到己肝表面抗原5'端后酶切位点Nde I，获得能够表达皮质抑素 14肤融合己肝表面抗原质粒PVAX1-S/CST14。
[0013] 2)将PVAX1-S/CST14和pIRES两个质粒进行Mie I和EcoR I酶切，连接，获得质 粒 pIRES _ S/CST14。
[0014] 3)利用PCS/2SS质粒通过PCR克隆获得生长抑素融合基因片段S/2SS，上下游引 物为：
[00巧]P1 ;5, -ATAAGAATGCGGCCGCAATTCCCTGCGCTGAACATG-3,；
[0016] P2 ; 5 > -GCGTCGACCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCTAC-3 >。
[0017] 4)S/2SS基因片段和真核表达质粒载体pIRES - S/CST14进行Not I和Sal I双 酶切，连接，即获得皮质抑素生长抑素双表达DNA质粒PIRES-S/CST14-S/2SS。
[001引将该质粒PIRES-S/CST14-S/2SS转化到大肠杆菌D册a中，获得了一株含有双 表达皮质抑素生长抑素双表达质粒的重组大肠杆菌巧scherichia coli)D册a(pIRES-S/ CST14-S/2SS)，该菌株已于2014年11月20日送至中国典型培养物保藏中屯、保藏，分类命 名：大肠杆菌巧 scherichia coli)D册a(pIRES-S/CST14-S/2S巧，保藏编号；CCTCC NO; M2014583,该菌株通过SDS碱裂解法抽提即可得到PIRES-S/CST14-S/2SS质粒。
[0019] 大肠杆菌巧scherichia coli)D册a(pIRES-S/CST14-S/2S巧为含有双表达皮质抑 素生长抑素真核表达质粒PIRES-S/CST14-S/2SS的混合培养物，通过SDS碱裂解法抽提即 可得到P IRES-S/CST14-S/2SS质粒。培养基；1L LB固体培养基组成；lOg氯化钢、5g酵母 提取物、lOg膜蛋白腺、1.5g琼脂粉。培养条件；PH;6.8-7.8,温度；37°C，为Amp+抗性；在 LB固体培养基中用平板划线法检测该培养物是否存活。
[0020] 一种皮质抑素生长抑素双表达的质粒PIRES-S/CST14-S/2SS在制备促进动物生 长疫苗中的应用，将该质粒作为疫苗直接免疫动物或与DNA疫苗佐剂混合后免疫动物。
[0021] 更详细的技术方案见《【具体实施方式】》。
[0022] 本发明的有益效果是：
[0023] 1、双表达皮质抑素生长抑素DNA质粒PIRES-S/CST14-S/2SS，该质粒能够表达免 疫原性较强的生长抑素（S巧和皮质抑素（CST)两种蛋白。
[0024] 2、双表达皮质抑素生长抑素DNA质粒PIRES-S/CST14-S/2SS通过肌肉注射免疫小 鼠后，其生长抑素和皮质抑素联合作用免疫协调促进小