关于黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及黑色素瘤细胞粘附分子括抗剂多肤及其应用，具体设及特异性抑制肿 瘤组织的血管内皮细胞的增殖和迁移，抑制肿瘤血管生成，治疗恶性肿瘤的多肤。
【背景技术】
[0002] 1971年化化man提出肿瘤生长和转移依赖新生血管生成。并认为实体瘤形成后， 其发展可分为无血管期和血管期两个阶段。无血管期，微小肿瘤的存在依靠周围间质弥散 供血，生长速度呈线性，肿瘤限制在1mm~2mm之内，瘤细胞数少于10 5~10 6个，迫使肿瘤 处于"休眠状态";进入血管期后，肿瘤组织为灌注性供血，瘤体呈指数性生长，2周后可增大 1. 6万倍。新生血管不仅提供肿瘤所需要的营养和氧气，排除代谢产物，而且是远处转移的 途径。因此，阻断肿瘤新生血管形成就可能阻止肿瘤生长和转移，抗新生血管疗法也成为肿 瘤治疗的手段之一。
[0003] 血管内皮与基质细胞黏附分子对肿瘤血管生成的作用越来越受到关注。黑色素瘤 细胞粘附分子（melanoma cell a化esion molecule，MCAM)是重要的细胞黏附蛋白，研究报 道黑色素瘤细胞粘附分子是一个新的肿瘤血管标志分子，特异表达在肿瘤新生血管并参与 肿瘤血管生成。黑色素瘤细胞粘附分子具有膜受体的功能，参与VEGF调节血管生成过程。 研究发现肿瘤分泌物中的某种因子能够诱导黑色素瘤细胞粘附分子二聚化，通过P38MAPK 信号通路活化NF- K B，上调多种促血管生成基因（VEGF、比-8、ICAM-1、MMP9)的表达，从而 促进肿瘤血管的生成。动物实验表明，CD146中和抗体AA98或CD146siRNA都能够显著抑 制血管内皮细胞的增殖和迁移，W及多种肿瘤（肝癌、黑色素瘤、肉瘤）的生长和转移。因 此，抑制黑色素瘤细胞粘附分子可W有效抑制肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤生长，使肿瘤处 于"休眠状态"。
[0004] 目前，没有成熟开发的黑色素瘤细胞粘附分子括抗剂多肤问世，用于治疗恶性肿 瘤。
[0005] 本专利中的黑色素瘤细胞粘附分子括抗剂多肤已证明在治疗黑色素瘤中有效，具 有在其他肿瘤模型中开发的前景。
【发明内容】
[0006] 发明目的
[0007] 本发明提供全新的序列，该序列为黑色素瘤细胞粘附分子括抗剂多肤，特异性抑 制肿瘤组织的血管内皮细胞的增殖和迁移，对恶性肿瘤具有很好的疗效。
[0008] 技术方案
[0009] 黑色素瘤细胞粘附分子括抗剂多肤，其特征在于其序列为 VAGVPELGLDVELEVT化沈P。
[0010] 所述的黑色素瘤细胞粘附分子括抗剂多肤在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。
[0011] 一种检测黑色素瘤的试剂盒，其含有所述的黑色素瘤细胞粘附分子括抗剂多肤。
[0012] 所述的试剂盒，其特征在于还有
[0013] (1)包被液；pH9. 6的0. 05mol/L碳酸盐缓冲液；
[0014] (2) PBS缓冲液；pH7. 4的0. 02mol/L磯酸盐缓冲液；
[00巧]做抗体稀释液；pHL 4 的 0.〇2mol/LPBS 和 0. 2% BSA ;
[0016] (4)封闭液；pH9. 6的0. 05mol/L碳酸盐缓冲液和2. 0% BSA
[0017] (5)洗漆液；0. 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0. 05% Tween-20 ;
[0018] (6)底物液；可溶性单组份TMB底物溶液；
[0019] (7)终止液；2mol/L硫酸溶液；
[0020] (8)黑色素瘤细胞粘附分子抗体；
[0021] (9)山羊抗小鼠IgG。
[00过有益效果
[0023] 利用固相合成法化学合成黑色素瘤细胞粘附分子括抗剂多肤，该多肤具有全新的 序列，该多肤可祀向识别肿瘤内皮细胞，并在体外抑制血管内皮细胞的增殖，治疗恶性肿 瘤，如黑色素瘤。我们发现的黑色素瘤细胞粘附分子括抗剂多肤可W同时抑制血管内皮细 胞迁移活力，并在体内试验中提高荷瘤小鼠生存率，具有潜在的新药开发价值。也可W作为 检测试剂盒检测肿瘤发生。
【具体实施方式】
[0024] 本发明设及的多肤由上海生工合成。
[0025] 实施例1
[0026] 黑色素瘤细胞粘附分子括抗剂多肤人血管内皮细胞迁移的作用。
[0027] 采用划痕实验。先用marker笔在24孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每 隔0. 5~1cm -道，横穿过孔。每孔穿过3条线；将成对数生长的HUVEC细胞，W 1. 0X 1〇5 加入24孔培养板中，培养2化。第二天用10 y 1枪头比着直尺，垂直于背后的横线划痕，W 划痕和背后横线的交叉点为固定观察位点；实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的 实验药物黑色素瘤细胞粘附分子括抗剂多肤（上海生工合成）和阳性对照药物长春新碱； 空白组加入相同体积的溶剂，每孔设五个复孔；放入37 °C、5 % C〇2培养箱，培养。按0，6，12， 24，36小时，拍照；测量0，6，12，24，3化划痕宽度。W不同的时间点，记录每孔S个固定位置 处划痕宽度的变化，即为细胞迁移距离。按照公式计算迁移率（migration rate,MR);迁移 率（MR)=(实验第n小时的划痕宽度一实验第0小时的划痕宽度）X 100% /实验第0小时 的划痕宽度。结果，随黑色素瘤细胞粘附分子括抗剂多肤浓度增加，迁移抑制率逐渐下降， 说明黑色素瘤细胞粘附分子括抗剂多肤能够抑制人血管内皮细胞迁移，抑制率为87. 2%。 [002引实施例2
[0029] 黑色素瘤细胞粘附分子括抗剂多肤对体外培养人血管内皮细胞的生长和存活 IC50。
[0030] 采用MTT比色法。将对数生长的人血管内皮细胞HUVEC，W 1. 0X 105加入96孔培 养板中，培养2化，实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物黑色素瘤细胞粘 附分子括抗剂多肤（上海生工合成）和阳性对照药物紫杉醇；空白组加入相同体积的溶剂。 每孔设五个复孔，培养4她，分别在化、2h、她、1化、2化、2化、3化、，4她每孔加入MTT，作用化 后，加入DMSO,解育30min，在酶标仪620nm处测定吸光度A值，按公式HUVEC生长抑制率= (1-实验组吸光值/对照组吸光值）X 100%。计算出实验药物的IC50为4. 31 uM。
[00引]实施例3
[0032] 用肿瘤模型检测黑色素瘤细胞粘附分子括抗剂多肤的体内活力。
[0033] 建立黑色素瘤肿瘤模型，阳性对照药物紫杉醇；空白组加入相同体积的溶剂，实验 组多肤（上海生工合成）设3个剂量；0. 75、1.5、3mg/Kg。21天后，观察小鼠存活数量，计 算存活率。结果显示，黑色素瘤细胞粘附分子括抗剂多肤可有效地保护小白鼠，提高荷瘤小 鼠的生存率，生存率达到87. 46 %。
[0034] 实施例4含有黑色素瘤细胞粘附分子括抗剂多肤的化ISA试剂盒检测：
[0035] 酶连免疫吸附实验巧LISA)试剂盒包括如下试剂：
[003引 （1)包被液；0. 05mol/L碳酸盐缓冲液（P册.6)。称取0. 75g碳酸钢，1. 46g碳酸氨 钢，加去离子水定容至500ml ;
[0037] (2)PBS缓冲液；0. 02mol/L磯酸盐缓冲液（pH7. 4)。称取0. 2g磯酸二氨钟，2. 90g 磯酸氨二钢，8g氯化钢，加去离子水定容到1000ml ;
[0038] (3)抗体稀释液；0. 02mol/LPBS (pH7. 4)和0. 2% BSA。称取0. 2浊SA加入配好的 0. 02mol/L磯酸盐缓冲液溶解定量至100ml ;
[0039] (4)封闭液；0. 05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9. 6)和2. 0% BSA。2. 0浊SA加配好的 0. 05mol/L碳酸盐缓冲液溶解定量至100ml ;
[0040] (5)洗漆液；0. 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0. 05 % Tween-20。将 50ulTween-20 溶入 lOOml0.0 2mol/L磯酸盐缓冲液中，震荡混匀；
[0041] (6)底物液；可溶性单组份TMB底物溶液；
[0042] (7)终止液；2mol/L硫酸溶液。10ml98%浓硫酸加入60ml双蒸水中，定容至 100ml，室温保存；
[0043] (8)黑色素瘤细胞粘附分子括抗剂多肤
[0044] (9)黑色素瘤细胞粘附分子抗体购自上海一研生物科技有限公司
[004引 （10)二抗（山羊抗小鼠IgG)购自艾美捷科技有限公司
[004引使用方法；1、血清样本制备：取3只荷瘤裸鼠，进行眼眶取血，每只200化，迅速 离屯、12000巧m 3min，取上清，按体积比1 ;2加PBS，80°C水浴30min，12000巧m 3min取上 清，-20°C冻存备用。2、黑色素瘤细胞粘附分子抗体为包被抗体，将黑色素瘤细胞粘附分子 抗体溶于包被稀释液中，浓度为100yg/mL。96孔酶标板每孔加入100y^4°C包被过夜。 弃去包被液，加入封闭液200 y以37°C封闭比。弃去封闭液，分别加入样品稀释液稀释的血 清样本100 y L(稀释比1 ;50)和黑色素瘤细胞粘附分子括抗剂多肤100 y L(l0 y g/ml)及 上述血清样本50 y L和黑色素瘤细胞粘附分子括抗剂多肤50 y L的混合物，分成3组，37°C 解育比。弃去血清，PBST和自来水间隔洗漆S次。洗漆后，每孔加入样品稀释液稀释酶标 二抗100化（稀释比1:10000)，37°C解育比。弃去二抗，洗漆。洗漆后，每孔加入100化 底物液（50yL底物A，50yL底物B)，37°C反应30min后，加入50yL 2M肥S04终止反应， 用酶标仪在450nm波长测定每孔的光密度值0D450nm。结果；黑色素瘤细胞粘附分子括抗 剂多肤可W和黑色素瘤细胞粘附分子抗体结合，并可W竞争血清中黑色素瘤细胞粘附分子 括抗剂，故说明黑色素瘤细胞粘附分子括抗剂多肤用竞争法检测黑色素瘤细胞粘附分子括 抗剂，实现肿瘤预测；
[0047]
【主权项】
1. 黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽，其特征在于其序列为VAGVPELGLDVELEVTLLSEP。
2. 如权利要求1所述的黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽在制备治疗黑色素瘤药物 中的应用。
3. -种检测黑色素瘤的试剂盒，其含有权利要求1所述的黑色素瘤细胞粘附分子拮抗 剂多肽。
4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于还有 (1) 包被液：p!19. 6的0? 05mol/L碳酸盐缓冲液； (2)PBS缓冲液：pH7. 4的0? 02mol/L磷酸盐缓冲液； (3) 抗体稀释液：pH7. 4 的 0? 02mol/LPBS和 0? 2%BSA; (4) 封闭液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸盐缓冲液和2. 0%BSA (5) 洗涤液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 05%Tween-20 ; (6) 底物液：可溶性单组份TMB底物溶液； (7) 终止液：2mol/L硫酸溶液； (8) 黑色素瘤细胞粘附分子抗体； (9) 山羊抗小鼠IgG。
【专利摘要】关于黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽及其应用。本发明涉及药物领域，具体涉及抑制肿瘤血管生成，治疗恶性肿瘤的多肽。其序列为VAGVPELGLDVELEVTLLSEP是全新的序列，它们可以在体外特异性抑制肿瘤组织的血管内皮细胞的增殖和迁移，抑制肿瘤血管生成，并在体内试验中提高荷瘤小鼠生存率，具有潜在的新药开发价值，也可以作为试剂盒检测肿瘤的发生。
【IPC分类】A61P35-00, G01N33-68, G01N33-574, C07K14-00, A61K38-16
【公开号】CN104725489
【申请号】CN201510158903
【发明人】罗瑞雪
【申请人】苏州普罗达生物科技有限公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年4月6日