=1: 4 ;再次酸化萃取时饱和NaCl的稀HCl溶液的体积的体积为首次取得的乙酸乙酯层体积的30% ；
(5)将上步所得粗品胆红素用温度为60-70°C的浓度为95%的无水乙醇进行2次以上溶解洗涤，降温冷却结晶得胆红素精制品；
所述步骤I中，在向过滤后的新鲜牛胆汁中加入扩增菌液前，向已经过滤的新鲜牛胆汁中依次加入质量浓度为0.5%的乙二胺四乙酸钠溶液和质量浓度为1%的抗氧化剂；
所述抗氧化剂为抗坏血酸或亚硫酸氢钠，所述乙二胺四乙酸钠溶液和抗氧化剂的体积与新鲜牛胆汁的体积比均为1:100。
[0016]所述步骤2中酶解的同时利用超声波对发酵液进行处理。
[0017]所述步骤2中，发酵液裂解的同时加入质量浓度为1-2%的巯醇类还原剂溶液； 所述的巯醇类还原剂溶液与裂解液的体积比为1: 50。
[0018]所述巯醇类还原剂为β -巯基乙醇或二硫苏糖醇。
[0019]最终得到胆红素的产率为0.0102%，纯度为93%。
[0020]实施例2
(1)将产气荚膜梭状芽胞杆菌的菌株在液体培养基中进行扩大培养24h，得到扩增菌液；向过滤后的新鲜牛胆汁中加入扩增菌液在温度为32°C条件下进行发酵48h，得到发酵液，发酵过程中维持发酵液的PH为6 ;所述扩增菌液的体积为新鲜牛胆汁体积的11% ;
(2)向上步所得的发酵液中加入溶菌酶，在温度为37-38度条件下进行酶解50min后，调节其PH值为7.5，得到裂解液；
所述溶菌酶在发酵液中的质量体积浓度为0.25g/lL;
(3)向上步所得裂解液中加入浓度为10%的NaOH溶液，调节其pH为12，得到皂化液；
(4)将上步所得皂化液加热煮沸3min，过滤，收集滤液，冷却至室温后向滤液中依次加入抗氧化剂溶液、乙酸乙酯，然后加入混合酸调节其PH为5.5，充分搅拌后静置分层，首次取乙酸乙酯层；用饱和NaCl的HCl溶液对前述乙酸乙酯层进行二次酸化萃取，静置分层后再次取乙酸乙酯层进行蒸馏回收，得到的粗品胆红素；
所述抗氧化剂为抗坏血酸或亚硫酸氢钠，抗氧化剂溶液的质量浓度为1%，抗氧化剂溶液与滤液的体积比为1:100 ;
所述乙酸乙酯的体积为滤液体积的60%，所述混合酸为HCl和HAc，其中HCl和HAc的体积比为HCl:HAc=1: 5 ;再次酸化萃取时饱和NaCl的稀HCl溶液的体积为首次取得的乙酸乙酯层体积的30% ；
(5)将上步所得粗品胆红素用温度为60-70°C的浓度为95%的无水乙醇进行2次以上溶解洗涤，降温冷却结晶得胆红素精制品；
所述步骤I中，在向过滤后的新鲜牛胆汁中加入扩增菌液前，向已经过滤的新鲜牛胆汁中依次加入质量浓度为0.5%的乙二胺四乙酸钠溶液和质量浓度为1%的抗氧化剂；
所述抗氧化剂为抗坏血酸或亚硫酸氢钠，所述乙二胺四乙酸钠溶液和抗氧化剂的体积与新鲜牛胆汁的体积比均为1:100。
[0021]所述步骤2中酶解的同时利用超声波对发酵液进行处理。
[0022]所述步骤2中，发酵液裂解的同时加入质量浓度为2%的巯醇类还原剂溶液；
所述的巯醇类还原剂溶液与裂解液的体积比为1: 60。
[0023]所述巯醇类还原剂为β -巯基乙醇或二硫苏糖醇。
[0024]最终得到胆红素的产率为0.014%，纯度为92%。
[0025]上述实施例中菌体的筛选和培养均为现有技术。
[0026]上述实施例中步骤I中发酵过程用于维持发酵液PH值的溶剂可以为盐酸和氢氧化钠。
【主权项】
1.一种利用发酵法从牛胆汁中提取胆红素的方法，其特征在于:步骤如下: (1)将产气荚膜梭状芽胞杆菌的菌株在液体培养基中进行扩大培养22-24h，得到扩增菌液； 向过滤后的新鲜牛胆汁中加入扩增菌液在温度为28-32°C条件下进行发酵45-48h，得到发酵液，发酵过程中维持发酵液的PH为5-6 ;所述扩增菌液的体积为新鲜牛胆汁体积的9-11% ； (2)向上步所得的发酵液中加入溶菌酶，在温度为37-38度条件下进行酶解30-50min后，调节其PH值为6.8-7.5，得到裂解液； 所述溶菌酶在发酵液中的质量体积浓度为0.2-0.25g/L; (3)向上步所得裂解液中加入浓度为10%的NaOH溶液，调节其pH为11_12，得到皂化液； (4)将上步所得皂化液加热煮沸l_3min，过滤，收集滤液，冷却至室温后向滤液中依次加入抗氧化剂溶液、乙酸乙酯，然后加入混合酸调节其pH为5-5.5，充分搅拌后静置分层，首次取乙酸乙酯层；用饱和NaCl的HCl溶液对前述乙酸乙酯层进行二次酸化萃取，静置分层后再次取乙酸乙酯层进行蒸馏回收，得到的粗品胆红素； 所述抗氧化剂为抗坏血酸或亚硫酸氢钠，抗氧化剂溶液的质量浓度为1%，抗氧化剂溶液与滤液的体积比为1:100 ; 所述乙酸乙酯的体积为滤液体积的50-60%，所述混合酸为HCl和HAc，其中HCl和HAc的体积比为1: (4-5);再次酸化萃取时饱和NaCl的稀HCl溶液的体积为首次取得的乙酸乙酯层体积的30% ； (5)将上步所得粗品胆红素用温度为60-70°C的无水乙醇进行2次以上溶解洗涤，降温冷却结晶得胆红素精制品。
2.如权利要求1所述的利用发酵法从牛胆汁中提取胆红素的方法，其特征在于:所述步骤I中，在向过滤后的新鲜牛胆汁中加入扩增菌液前，向已经过滤的新鲜牛胆汁中依次加入质量浓度为0.5%的乙二胺四乙酸钠溶液和质量浓度为1%的抗氧化剂； 所述抗氧化剂为抗坏血酸或亚硫酸氢钠，所述乙二胺四乙酸钠溶液和抗氧化剂的体积与新鲜牛胆汁的体积比均为1:100。
3.如权利要求1所述的利用发酵法从牛胆汁中提取胆红素的方法，其特征在于:所述步骤2中酶解的同时利用超声波对发酵液进行处理。
4.如权利要求1所述的利用发酵法从牛胆汁中提取胆红素的方法，其特征在于:所述步骤2中，发酵液裂解的同时加入质量浓度为1-2%的巯醇类还原剂溶液； 所述的巯醇类还原剂溶液与裂解液的体积比为1: (50-60)。
5.如权利要求4所述的利用发酵法从牛胆汁中提取胆红素的方法，其特征在于:所述巯醇类还原剂为巯基乙醇或二硫苏糖醇。
【专利摘要】本发明提供一种利用发酵法从牛胆汁中提取胆红素的方法，主要包括牛胆汁的发酵、牛胆汁发酵液的灭菌、胆红素的形成、胆红素的提取与精制等四个步骤。本发明主要将高产β-葡萄糖醛酸苷酶且耐胆汁的产气荚膜梭状芽胞杆菌加入到动物胆汁中并进行发酵，通过加入巯醇类还原剂起到提高β-葡萄糖醛酸苷酶的活性和抗氧化剂的作用，在特殊条件的控制下使得整个工艺得到极大的优化，提高生产效率，降低成本，最终得到胆红素产品的收率在0.010-0.014%之间，其纯度达到92%以上。
【IPC分类】C12R1-07, C12P17-16
【公开号】CN104774885
【申请号】CN201510199371
【发明人】李幼鹤, 罗张龙, 何福艳
【申请人】武汉健民大鹏药业有限公司
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月24日