科院小麦研究所提供或由 市场购得； 及其他引物序列均由上海生工生物有限公司合成提供； 2XTaqPCRMix购于北京汇天东方科技有限公司； PCR反应在BI0-RADS1000-PCR仪(美国伯乐公司）上运行。 实施例
[0013]由于本发明的难点及关键点在于针对周麦23号小麦品种的特异性引物序列 啸]筛选获得，因此本实施例对于该引物序列的筛选过程简要介绍如下。
[0014] 一、特异性引物序列的初步筛选 初步筛选过程包括如下步骤： USSR引物选择 SSR引物选用覆盖小麦21条染色体的340对简单重复序列（simplesequencer巧eat,SSR)引物，包括BARC、CFA、C抑、GDM，WMC系列的SSR引物及CWM、KSUM、C肥M、S肥S，和CNL 系列的EST-SSR引物。引物序列信息在GrainGenes2.0 (ht1:p://wheat.pw.usda.gov/)查 阅获得。
[0015] 相关引物序列均由上海生工生物有限公司合成提供。
[0016] 2、DNA提取、PCR扩增及扩增产物的电泳 W周麦23号及其亲本周麦13号、新麦9号为检测材料进行引物的初步筛选，具体步骤 如下： (1) 采用单巧粒DNA提取法，分别对每个品种的小麦种子提取DNA; (2) W步骤（1)中提取的小麦种子的DNA为模板，分别W步骤1中的SSR引物为引物序 列，分别进行PCR扩增； 15化PCR扩增反应体系设置如下； 2XI'aqPCRMix(含Taq酶 0. 1U/ML、dNTPs500 帕ol/L、Tris-肥 1 20mmol/L、KCl100mmol/L、MgCl23mmol/L) 7. 5 化， 引物（10帕ol/L)，上游序列、下游序列各1化， 步骤（1)提取的DNA模板，1. 5化， 超纯水4化； PCR扩增程序；94°C预变性 5min;94°C变性 1min，55°C退火 1min，72°C延伸 1min， 35个循环；72°C延伸7min;PCR扩增产物置于4°C保存备用； (3) 电泳，电泳前，加入指示剂，W步骤（2)中15化PCR扩增产物为例，加入3uL变性 上样指示剂；94°C变性lOmin后，立即放入冰水混合物中冷却lOmin;然后取处理后的样品 6. 5yL在质量浓度为6%的变性聚丙締酷胺凝胶中电泳分离，银染显色； 所述变性上样指示剂组分为；98%无离子甲酯胺、lOmMEDTAp服.0,0. 1 %漠酪藍和 0. 1 %二甲苯青； (4)对步骤（3)显色后样品进行带型统计，最终根据电泳结果，筛选出PCR扩增的周麦 23号的带型与其亲本周麦13号和新麦9号均不相同的引物对。
[0017]筛选结果表明，周麦23号的带型与其亲本周麦13号和新麦9号均不相同的引物 对有7个，具体如下表所示，初步电泳图如图1和图2所示。
【主权项】
1. 一种鉴定周麦23号小麦品种的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： (1) 采用单籽粒DNA提取法，分别对周麦23号小麦和待测小麦种子提取DNA; (2) 以步骤（1)中提取的周麦23号小麦和待测小麦种子的DNA为模板，以Zc勝成5为引 物序列，分别进行PCR扩增； 所述Ic引物序列为： 上游序列，TCAITGGTGTCATCCCTCGTGT ; 下游序列，GAATAATGCCTTGACCCTGGAC ; (3) 对步骤（2)所得PCR扩增产物进行电泳，电泳前，加入指示剂，电泳结束后显色； (4) 对步骤（3)所得显色后样品进行带型统计，对比判定，如果待测小麦种子的PCR扩 增样品电泳结果与周麦23号小麦的PCR扩增样品结果带型一致，表明待测小麦种子为周麦 23号品种；如果不一致，则表明待测小麦种子非周麦23号品种。
2. 如权利要求1所述鉴定周麦23号小麦品种的方法，其特征在于，步骤（2)中PCR扩 增反应设置如下： 15 ML PCR扩增反应体系设置如下： 2XTaq PCR Mix 7.5 ML，其中包含：Taq 酶 0.1 U/ML、dNTPs 500 Mmol/L、Tris-HCl 20 mmol/L、KCl 100 mmol/L、MgCl2 3 mmol/L ； 引物Ic騰你以10 Mmol/L计，上游序列、下游序列各I ML， 步骤（1)提取的DNA模板，1. 5ML， 超纯水4 ML ; PCR 扩增程序：94°C预变性 5 min;94°C变性 I min，55°C退火 I min，72°C延伸 I min， 35个循环；72°C延伸7 min ;PCR扩增产物置于4°C保存备用。
3. 如权利要求1所述鉴定周麦23号小麦品种的方法，其特征在于，步骤（3)中所述 指示剂为变性上样指示剂，所述变性上样指示剂组分为：98%无离子甲酰胺、IOmMEDTA pH8. 0、0? 1%溴酚蓝和0? 1%二甲苯青。
4. 如权利要求3所述鉴定周麦23号小麦品种的方法，其特征在于，所述步骤（3)具体 为：取步骤（2)所得15MLPCR扩增产物，加入3yL变性上样指示剂；94°C变性IOmin后，立 即放入冰水混合物中冷却IOmin ;然后取处理后的样品6. 5 yL在质量浓度为6%的变性聚 丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色。
【专利摘要】本发明属于小麦种质资源品种鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定周麦23号小麦品种的方法。该方法包括提取DNA、以Xcwm65为引物序列，PCR扩增、电泳、显色、带型统计、对比判定等步骤。本发明利用SSR技术，通过对小麦21条染色体上的340个SSR引物进行筛选，确认Xcwm65引物序列针对周麦23号小麦品种具有较好的特异性，可以用于周麦23号品种的检测、鉴定。总体而言，本发明技术成熟，快速、简便、准确度较高，能够较为便捷、有效的鉴定出周麦23号品种，有利于新品种推广和种质资源保护，同时也为其他小麦品种的推广利用和保护提供了较好的应用借鉴。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104774934
【申请号】CN201510151029
【发明人】殷贵鸿, 邹少奎, 唐建卫, 韩玉林, 李楠楠, 李顺成, 黄峰, 王丽娜, 张倩, 高艳
【申请人】周口市农业科学院
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月1日