一种用于抗菌药物筛选的新载体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于抗菌药物筛选的载体，具体是一种用于筛选对铜绿假单胞菌 的致病性和耐药性有明显抑制作用的抗菌药物的筛选载体。
【背景技术】
[0002] 铜绿假单胞菌是一类机会致病菌，是引起医院内感染的主要原因，在免疫系统缺 陷的的病人比如HIV病人、重度烧伤患者和肺囊肿纤维化病人中常常造成比较高的发病率 和死亡率。
[0003] 近年来，铜绿假单胞菌对几乎所有抗菌药物的耐受性都有所增加。一方面是由于 不合理的使用抗生素，使得菌体产生了适应性耐药；另一方面是因为铜绿假单胞菌自身存 在的较强的内在耐药机制发挥作用。铜绿假单胞菌对抗生素耐受性的不断增加使得临床 上选用合适的治疗策略来治疗铜绿假单胞菌的感染变得十分困难，导致了越来越高的死亡 率，因而发现新型的有效的抗菌物质迫在眉睫。
[0004] 中药在防止慢性感染中己逐渐显示出独特的优势。我国具有丰富的中草药资源， 来源广、价格低廉、毒副作用小、较少会出现耐药性且在细菌细胞内作用途径多样化，能产 生多方面药理效应，因此可以作为潜在的抗铜绿假单胞菌的药物进行研宄。
[0005] 新的抗菌药物的筛选方法是发现新型抗菌物质的关键因素。传统的抗生素筛选方 法缺点是作用靶点不明确、机制不清晰、不灵敏、筛选过程有随机性。基因标记方法是当前 筛选方法中最先进的技术之一，通过标记特殊基因，寻找相关生物活性物，优点是灵敏、可 检测低效物、可用于化学改进、易筛选、高通量。
[0006] 抗生素除了传统意义上的抑菌和杀菌作用，还表现出其它活性，特别是在低于最 小抑制浓度下，外界抗菌物质可以对基因的表达具有调节作用，可以调节致病因子的表达， 诱导病原菌的抗药性，影响微生物群体中细胞间的相互作用等。利用抗生素的这一特性，可 以通过构建特定基因的表达载体来筛选对该基因具有调节作用的新型抗菌物质。
[0007] 类脂A是脂多糖（LPS)的重要结构之一，与LPS其他成分间相互作用形成外膜的 有效屏障；当LPS结构装置缺损，LPS的结构就会被破坏，随之LPS层出现裂口，磷脂分子就 会从外膜内层迀移到有裂口的地方，进行修补，即在外膜中形成了磷脂双分子层斑，导致外 膜的屏障作用受损，从而可使疏水的抗生素和有害物质自由通透，细菌对抗生素或有害物 质变得敏感。此外，类脂A还是LPS的内毒素组分，内毒素耐热而且稳定，是细菌的重要的 致病物质。
[0008] 铜绿假单胞菌中PA0011基因编码2-OH-酰基转移酶参与到类脂A的合成过程， 团队通过前期研宄发现：PA0011对于铜绿假单胞菌的生理生化功能、耐药性和致病能力都 具有十分重要的作用，PA0011功能缺失后对四环素、庆大霉素、多粘菌素、利福平、羧苄青霉 素、卡纳霉素，碳青霉烯类抗生素的抗性都明显降低，而且导致铜绿假单胞菌对HeLa细胞 的侵染力降低，对果蝇的致死率也明显降低。而且，在其他菌株中也有类似的发现，例如，沙 门氏菌中htrB为铜绿假单胞菌PA0011的同源基因，htrB的突变体内毒素活性降低，突变 体致病性也受到影响。因此，PA0011可以作为一个很好的药物靶点，用于筛选新型抗菌物 质。对于其它致病菌的用药治疗也有借鉴作用。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种抗菌药物筛选的载体，具体是以铜绿假单胞菌中的一 个耐药基因为靶点，构建该基因的启动子-报道子的检测载体，以解决上述【背景技术】中提 出的问题。
[0010] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0011] 一种用于抗菌药物筛选的载体，所述载体为PKD-PA0011，主要用于筛选对铜绿假 单胞菌的致病性和耐药性有明显抑制作用的抗菌药物。所述载体的构建方法为：以耐药 及致病双相关基因PA0011作为药物靶点，以带有缺失启动子的报道基因luxCDABE的质粒 PMS402为载体，将PA0011基因的启动子区域经PCR扩增、酶切克隆到报道质粒pMS402所带 的荧光素酶luxCDABE操纵子前，构成启动子-报道子融合载体pKD-0011 ;利用电转化技术 将重组质粒PKD-0011转入野生型的铜绿假单胞菌中，通过检测pKD-0011的发光情况来筛 选获得抑制PA0011表达的抗菌物质。
[0012]作为本发明进一步的方案：包含启动子在内的耐药基因PA0011的引物序列为：
[0013]上游引物为 5' -TATctcgagCAGGACTGCGACCGTTACG-3'，
[0014]下游引物为 5' -CTCggatccCACATCAGCCAGCCTATG-3 '。
[0015] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明从"抗耐药"角度构建了一种利用 荧光素酶基因（luxCDABE)作为报道子的高通量基因表达检测技术，筛选对铜绿假单胞菌 中的一个重要的耐药及致病双相关基因PA0011的启动子有抑制作用的抗菌物质。该载体 可以实现高通量筛选；利用相关筛选设备，操作简单，经济实用；筛选得到的药物能有效的 铜绿假单胞菌的致病性及耐药性，且作用机制清晰明确。
【附图说明】
[0016] 图1为载体pKD-0011示意图；
[0017] 图2为不同药物的水提物对pKD-0011发光的影响示意图，发光越弱表明对所述载 体抑制程度越高；
[0018] 图3为以不加任何药物的培养基的对照组与添加对pKD-0011有抑制作用的淡竹 叶水提物的培养基药物处理组对比图；
[0019] 图4为图3中对照组与淡竹叶水提物的药物处理组果蝇存活率曲线图；
[0020] 图5为白菜感染模型检测淡竹叶水提物的药物处理组和无药物处理的对照组中 铜绿假单胞菌的致病性。
【具体实施方式】
[0021] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0022] 实施例1
[0023] 新型抗菌药物筛选载体pKD-0011的构建：请参阅图1。pMS402质粒中含有荧光 素酶基因luxCDABE，但是荧光素酶基因序列前缺失启动子，因此在未连接启动子时，pMS402 质粒不能发荧光。基于PMS402质粒的这一特性，将耐药及致病双相关基因PA0011的启动 子连接于PMS402质粒的luxCDABE之前，使其能够有效启动luxCDABE基因，从而成功构建 PA0011基因表达报道载体。
[0024] 请参阅图1，首先，设计包含启动子在内的PA0011基因引物：
[0025]上游引物为 5' -TATctcgagCAGGACTGCGACCGTTACG-3'，
[0026]下游引物为 5' -CTCggatccCACATCAGCCAGCCTATG-3'，
[0027] 经PCR扩增后用Xhol和BamHI进行酶切，纯化后连接到pMS402荧光素酶基因报 道子前的Xhol和BamHI酶切位点，过夜连接16小时，采用电转化的方法，将菌液涂布于含 50ug/mL卡那霉素的LB固体培养基上，培养12小时后挑取一些单克隆进行划线培养，经过 PCR验证，最后得到验证正确的启动子-报道子融合载体即为抗耐药筛选载体pKD-0011。
[0028] 实施例2
[0029] 采用抗耐药筛选载体pKD-0011，通过多孔板酶标仪BioTeksynergy2可以实现对 耐药及致病双相关基因PA0011有明显抑制作用的抗菌药物的高通量筛选。
[0030] 外界抗菌药物在低于最小抑制浓度下即在亚抑制浓度时，不影响菌体的生长，同 时可以对基因的表达具有调节作用。实施方案以各药物的亚抑制浓度为例，黄芩苷、阿魏酸 的浓度分别为30mg/ml和50mg/ml，实验用到的其它中药提取物的浓度为100mg/ml，研宄各 种中药物质在不影响细菌生长的条件下对耐药及致病双相关基因PA0011表达的影响。
[0031] 具体通过酶标检测仪进行基因表达检测：将检测菌株在LB固体培养基上划线、 37°C过夜培养；挑取单克隆接种到含100 y LLB培养基的白色96孔板中，37°C、200rpm培养 12h ;然后按5 %接种量转接到新鲜LB培养基中，活化3h，取95 y L含有亚抑制浓度或不含 有药物成份的新鲜LB培养基作为对照组于已灭菌的黑色底部透明的96孔板中，同时加入 5 y L活化后的菌液；最后每孔用50 y L矿物油覆盖，置于多功能酶标仪上，每隔0. 5h测定 其CPS值和0D600值，共测24h。实验初步筛选了 20种中药成分，各药物对pKD-0011的影 响如表2所示：
[0032] 表2各药物对pKD-0011的影响
【主权项】
1. 一种用于抗菌药物筛选的载体，所述载体为PKD-0011，主要用于筛选对铜绿假单 胞菌的致病性和耐药性均有明显抑制作用的抗菌药物。其特征在于，所述载体的构建方法 为：载体以耐药及致病双相关基因PAOOll作为药物靶点，以带有缺失启动子的报道基因 IuxCDABE的质粒pMS402为载体，将PA0011的启动子区域经过PCR扩增、酶切克隆到质粒 PMS402的荧光素酶操纵子基因luxCDABE前，构成启动子-报道子融合载体pKD-0011，即 抗菌药物筛选载体；利用电转化技术将重组质粒转入野生型的铜绿假单胞菌中，通过检测 pKD-0011的发光强弱来筛选获得抑制PA0011表达的抗菌物质。筛选获得的抗菌物质能够 同时明显降低铜绿假单胞菌的耐药性和致病性。
2. 根据权利要求1所述的用于抗菌药物筛选的载体，其特征在于：包含启动子在内的 耐药基因PA0011的引物序列为： 上游引物为 5' -TATctcgagCAGGACTGCGACCGTTACG-3'， 下游引物为 5' -CTCggatccCACATCAGCCAGCCTATG-3 ' 〇
【专利摘要】本发明公开了一种用于抗菌药物筛选的新载体，所述载体为pKD-0011，主要用于筛选对铜绿假单胞菌的致病性和耐药性有明显抑制作用的抗菌药物。载体以耐药性及治病性双相关基因PA0011作为药物作用靶点，通过带有缺失启动子的报道基因luxCDABE的质粒pMS402，将耐药及致病双相关基因PA0011的启动子区域通过PCR扩增、酶切克隆到报道质粒pMS402荧光素酶操纵子基因前，构成启动子-报道子融合载体pKD-0011；利用电转化技术将重组质粒转入野生型的铜绿假单胞菌中，利用载体pKD-0011的发光强弱可以筛选得到抑制PA0011表达的抗菌物质。该载体可以实现高通量筛选，利用相关筛选设备，操作简单，经济实用。
【IPC分类】C12N15-66, C12Q1-02, C12N15-63
【公开号】CN104789582
【申请号】CN201510176236
【发明人】沈立新, 王波波, 吴宪军, 李博, 吴依哲, 梁鹰
【申请人】西北大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月14日