骤期间与捕获寡核苷酸显著（或实质上）结合。
[0080] 任选地，茎环引物的第一与第二茎环序列由间隔区间隔开。间隔区可以任选地包 括一种或多种核苷酸或可以完全由非核苷酸基部分组成。在一些实施例中，间隔区包括无 法由聚合酶复制的不可复制部分。此类不可复制部分可以包括无法负载由聚合酶进行的基 于模板的核苷酸聚合的任何部分。举例来说，不可复制部分可以包括非核苷酸基部分（例 如，PEG或其它碳基间隔子、氨基酸或不被用以执行引物延伸的聚合酶识别的核苷酸类似 物，例如尿嘧啶，结合DNA依赖性DNA聚合酶等）。当茎环引物用作用于通过聚合酶进行的 模板依赖性核酸合成的模板时，聚合酶无法使合成的核酸链延伸超出不可复制部分。这典 型地导致在茎环寡核苷酸的某一部分已经复制到相对链中之后停止或终止核酸合成，使茎 环寡核苷酸的剩余部分保持单链。合成或复制的链可以保持与茎环寡核苷酸碱基配对，形 成部分双链并且部分单链的茎环引物延伸产物。单链区任选地包括茎环引物的某一部分。
[0081] 在一些实施例中，茎环引物延伸产物的单链区包括可以与捕获寡核苷酸中的对应 捕获序列结合的捕获序列。任选地，茎环寡核苷酸的捕获序列与捕获寡核苷酸的捕获序列 至少70%互补。在一些实施例中，茎环寡核苷酸和捕获寡核苷酸的捕获序列与彼此完全互 补。
[0082] 在一些实施例中，茎环寡核苷酸在高于茎环解链温度的温度（"第二解链温度"） 下主要是单链的。在低于茎环解链温度的温度（"第一解链温度"）下，寡核苷酸的茎环形 式占绝大多数。
[0083] 任选地，所述组合物进一步包括标靶核酸分子。标靶核酸分子可以包括与茎环寡 核苷酸的序列至少部分互补的序列。
[0084] 任选地，所述组合物进一步包括捕获寡核苷酸。
[0085] 在一些实施例中，标靶核酸分子可以包括与茎环寡核苷酸的序列至少部分互补的 序列。
[0086] 在一些实施例中，标祀核酸分子和捕获寡核苷酸各自分别地包括与第一和/或第 二茎环序列至少部分互补的序列。
[0087] 在一些实施例中，所公开的方法可以包括使样品中的一群标革巴核酸分子与发夹引 物在非允许条件下杂交以形成一群发夹引物-标靶复合物，和使发夹引物以模板依赖性方 式延伸以形成发夹引物延伸产物。在一些实施例中，所述方法可以进一步包括使引物延伸 混合物经历允许条件以诱导通过实质上全部未延伸的发夹引物形成发夹。这确保未延伸的 发夹引物不会在后续捕获步骤期间与捕获寡核苷酸显著（或实质上）结合。
[0088] 任选地，发夹引物的第一与第二发夹序列由间隔区间隔开。间隔区可以任选地包 括一种或多种核苷酸或可以完全由非核苷酸基部分组成。在一些实施例中，间隔区包括无 法由聚合酶复制的不可复制部分。此类不可复制部分可以包括无法负载由聚合酶进行的基 于模板的核苷酸聚合的任何部分。举例来说，不可复制部分可以包括非核苷酸基部分（例 如，PEG或其它碳基间隔子、氨基酸或不被用以执行引物延伸的聚合酶识别的核苷酸类似 物，例如尿嘧啶，结合DNA依赖性DNA聚合酶等）。当发夹引物用作用于通过聚合酶进行的 模板依赖性核酸合成的模板时，聚合酶无法使合成的核酸链延伸超出不可复制部分。这典 型地导致在发夹寡核苷酸的某一部分已经复制到相对链中之后停止或终止核酸合成，使发 夹寡核苷酸的剩余部分保持单链。合成或复制的链可以保持与发夹寡核苷酸碱基配对，形 成部分双链并且部分单链的发夹引物延伸产物。单链区任选地包括发夹引物的某一部分。
[0089] 在一些实施例中，发夹引物延伸产物的单链区包括可以与捕获寡核苷酸中的对应 捕获序列结合的捕获序列。任选地，发夹寡核苷酸的捕获序列与捕获寡核苷酸的捕获序列 至少70 %互补。在一些实施例中，发夹寡核苷酸和捕获寡核苷酸的捕获序列与彼此完全互 补。
[0090] 在一些实施例中，发夹寡核苷酸在显著高于发夹解链温度（"发夹Tm"）的温度下 主要是单链的。在显著低于发夹解链温度（"发夹Tm"）的温度下，寡核苷酸的发夹形式占 绝大多数。
[0091] 任选地，所述组合物进一步包括标靶核酸分子。标靶核酸分子可以包括与发夹寡 核苷酸的序列至少部分互补的序列。
[0092] 任选地，所述组合物进一步包括捕获寡核苷酸。
[0093] 在一些实施例中，标靶核酸分子可以包括与发夹寡核苷酸的序列至少部分互补的 序列。
[0094] 在一些实施例中，标革E核酸分子和捕获寡核苷酸各自分别地包括与第一和/或第 二发夹序列至少部分互补的序列。
[0095] 在一些实施例中，可以选择捕获Tm以允许两种捕获序列在允许条件下杂交，其中 两种捕获序列在非允许条件下变性。允许条件可以包括显著低于捕获Tm的任何温度（例 如，室温或更低）。在一些实施例中，允许条件包括高盐浓度（例如，NaCl是0.IM或更高， 典型地0. 25M，甚至更典型地0. 5M或更高）。在允许条件下捕获之后，可以任选地洗涤捕获 的产物以去除非特异性结合的污染物。然后可以将经纯化的引物延伸产物经由暴露于非允 许条件（例如，显著高于捕获Tm的温度和/或低盐浓度）从捕获寡核苷酸洗脱。因为用 以执行捕获的捕获寡核苷酸的量是限制的，所以经纯化的引物延伸产物的量将与用以执行 捕获的捕获寡核苷酸分子的数目成正比。当使用相同数目的捕获寡核苷酸对多个样品平行 执行此类捕获时，从每个样品获得的经纯化的产物分子的数目应与分析中所用的捕获寡核 苷酸分子的数目成正比。在一些实施例中，从每个样品回收的经纯化的产物分子的数目与 彼此实质上相等。
[0096] 在一些实施例中，本发明大体上涉及用于使一种或多种标靶核酸分子从样品正规 化的试剂盒，其包含：包括引物的容器，所述引物具有第一引物序列和第二引物序列。任选 地，引物可以包括不可复制部分。引物可以任选地包括抑制第一引物序列在第二解链温度 下与第二引物序列杂交的任何适合二级结构。在一些实施例中，引物还任选地包括使得第 一引物序列能够在第一解链温度下与第二引物序列杂交的任何核酸序列。在一些实施例 中，试剂盒进一步包括包含捕获寡核苷酸的相同容器（或不同容器）。任选地，引物包括与 捕获寡核苷酸的序列至少85%、90 %、95 %、98 %或更多互补的序列。在一些实施例中，试剂 盒可以包括与捕获寡核苷酸的捕获部分选择性结合的任何适合结合剂。
[0097] 在一些实施例中，本发明大体上涉及用于使核酸样品正规化的试剂盒，其包含：包 括发夹寡核苷酸的容器。发夹寡核苷酸可以包括本文中所公开的任何发夹寡核苷酸。在 一些实施例中，试剂盒进一步包括包含捕获寡核苷酸的相同容器（或不同容器）。任选地， 发夹寡核苷酸包括与捕获寡核苷酸的序列至少85%、90%、95%、98%或更多互补的捕获序 列。
[0098] 在一些实施例中，本发明大体上涉及用于使核酸样品正规化的试剂盒，其包含：包 括茎环寡核苷酸的容器。茎环寡核苷酸可以包括本文中所公开的任何茎环寡核苷酸。在 一些实施例中，试剂盒进一步包括包含捕获寡核苷酸的相同容器（或不同容器）。任选地， 茎环寡核苷酸包括与捕获寡核苷酸的序列至少85%、90%、95%、98%或更多互补的捕获序 列。
[0099] 在一些实施例中，本发明大体上涉及用于从引物延伸反应混合物纯化引物延伸产 物的方法（和相关组合物、试剂盒、系统和设备），其包含：使引物与样品内的标靶核酸（或 一群标靶核酸分子）杂交。任选地，引物包括第一引物序列和第二引物序列。第一和第二引 物序列可以与彼此实质上或完全互补。第一与第二引物序列之间形成的杂交物的Tm( "发 夹Tm"）可以是约50°C或更低。所述方法可以任选地包括形成包括引物和一种或多种标靶 核酸分子的引物延伸反应混合物。所述方法可以包括使引物与样品的一种或多种标靶核酸 分子在非允许温度下杂交，在所述温度下实质上全部（或显著部分）的引物呈线性或延伸 形式。在一些实施例中，所述方法进一步包括使引物在允许条件下以标靶依赖性方式延伸 以形成一种或多种延伸的引物产物。在一些实施例中，所述方法进一步包括使包括一种或 多种延伸的引物产物的引物延伸反应混合物经历非允许条件，使得实质上全部（或显著部 分）的未延伸的引物呈实质上抑制引物与捕获寡核苷酸杂交的形式。所述方法可以进一步 包括使延伸的引物与捕获寡核苷酸在允许捕获寡核苷酸与延伸的引物杂交的条件下接触。 在一些实施例中，延伸的引物是部分双链并且部分单链的，并且捕获寡核苷酸与延伸的引 物的单链部分内的序列杂交。在一些实施例中，引物可以是发夹或茎环引物。在一些实施 例中，引物可以是具有二级结构的引物序列，所述二级结构实质上抑制引物在第一解链温 度下与捕获寡核苷酸杂交并且使得引物序列能够在第二解链温度下与捕获寡核苷酸杂交。
[0100] 在一些实施例中，本发明大体上涉及一种用于从引物延伸反应混合物纯化引物延 伸产物的方法（和相关组合物和试剂盒），其包含：使引物与一种或多种标祀核酸分子杂 交。任选地，引物包括由不可复制部分间隔开的第一引物序列和第二引物序列。在一些实 施例中，第一与第二引物序列可以由不可复制部分间隔开。在一些实施例中，所述方法进一 步包括使引物以模板依赖性方式延伸以形成引物延伸产物，其具有包括第一引物序列的单 链区。在一些实施例中，引物可以是发夹或茎环引物。在一些实施例中，引物可以是具备具 有二级结构的序列的引物，所述二级结构实质上抑制引物在第一解链温度下与捕获寡核苷 酸杂交；同时使得引物序列能够在第二解链温度下与捕获寡核苷酸杂交。
[0101] 在一些实施例中，所述方法进一步包括使引物延伸产物与捕获寡核苷酸杂交，所 述捕获寡核苷酸包括捕获部分。
[0102] 在一些实施例中，所述方法进一步包括使用结合剂选择性捕获引物延伸产物，所 述结合剂与捕获部分选择性结合。
[0103] 在一些实施例中，捕获寡核苷酸包括与引物延伸产物的单链区的至少一部分实质 上互补的序列。
[0104]在一些实施例中，捕获寡核苷酸包括与第一引物序列的至少一部分实质上互补的 序列。
[0105] 在一些实施例中，延伸在显著高于引物Tm的温度（"延伸温度"）下执行，使得引 物的第一和第二引物序列在延伸温度下不与彼此实质上杂交。在一些实施例中，延伸在显 著高于发夹引物的解链温度的温度下执行，使得第一和第二发夹引物序列在延伸温度下不 与彼此实质上杂交。在一些实施例中，延伸在显著高于茎环引物的解链温度的温度下执 行，使得第一和第二茎环引物序列在延伸温度下不与彼此实质上杂交。
[0106] 在一些实施例中，引物延伸产物在显著低于引物Tm的温度（"捕获温度"）下与捕 获寡核苷酸杂交，使得实质上全部未延伸的引物寡核苷酸在捕获温度下呈未延伸的形式。 在一个实施例中，引物延伸产物在显著低于发夹Tm的温度（"捕获温度"）下与捕获寡核苷 酸杂交，使得实质上全部未延伸的发夹引物寡核苷酸在捕获温度下呈发夹未延伸的形式。 在另一个实施例中，引物延伸产物在显著低于茎环Tm的温度（"捕获温度"）下与捕获寡核 苷酸杂交，使得实质上全部未延伸的茎环寡核苷酸在捕获温度下呈茎环未延伸的形式。
[0107] 在一些实施例中，本发明大体上涉及用于使用捕获寡核苷酸分离标靶核酸分子的 试剂盒，以及相关组合物、方法、系统和设备。在一些实施例中，试剂盒（和相关组合物、系 统、设备和方法）包括能够与一群标靶核酸分子的成员中的一者或某一部分选择性结合的 捕获寡核苷酸。在一些实施例中，试剂盒可以任选地包括与可以与捕获寡核苷酸选择性结 合的标靶核酸分子群体相比有限量或可以经稀释以便以限制数目存在的量的捕获寡核苷 酸。在一些实施例中，捕获寡核苷酸可以按小于样品中能够与捕获寡核苷酸结合的标靶核 酸分子的数目的50 %、25 %、20 %、10 %、5 %或1 %的量存在。在一些实施例中，捕获寡核苷 酸包括与结合剂选择性结合的捕获部分。举例来说，捕获部分可以包括结合对的第一成员， 并且结合剂可以包括相同结合对的第二成员。在一些实施例中，试剂盒可以进一步包括一 种或多种具有二级结构的引物，所述二级结构实质上抑制引物在第一解链温度下与捕获寡 核苷酸杂交；同时使得引物能够在第二解链温度下与捕获寡核苷酸杂交。在一个实施例中， 具有如下二级结构的引物包括发夹或茎环引物，所述二级结构实质上抑制引物在第一解链 温度下与捕获寡核苷酸杂交；同时使得引物能够在第二解链温度下与捕获寡核苷酸杂交。 发夹或茎环引物可以包括本文中所公开的任何发夹或茎环引物。在一些实施例中，发夹引 物包括与彼此互补并且在显著低于发夹Tm的温度下将与彼此杂交（形成发夹结构）的第 一发夹序列和第二发夹序列。在一些实施例中，茎环引物包括与彼此互补并且在显著低于 茎环Tm的温度下将与彼此杂交（形成茎环结构）的第一茎环序列和第二茎环序列。任选 地，试剂盒可以进一步包括与捕获寡核苷酸选择性结合的结合剂。
[0108] 在一些实施例中，所述方法（和相关试剂盒、系统、设备和组合物）可以适用于多 种下游过程，例如核酸测序，包括但不限于从头测序、靶向重测序和合成组配；基因分型； 法医分析；单核苷酸多态性（SNP)分析；表观遗传分析；拷贝数变异分析；基因表达分析； 基因突变分析，包括但不限于检测、预后和/或诊断、检测和分析稀有或低频率等位基因 突变。在另一个实施例中，如本文中所描述制备的捕获的标靶核酸分子可以经测序以从一 群标靶核酸分子检测和/或识别生殖系或体细胞突变。
[0109] 在一些实施例中，所述方法（以及相关试剂盒、组合物、设备和系统）可以适用于 从一个或多个来源分析标靶核酸分子，所述来源例如基因组DNA或福尔马林固定的石蜡包 埋的（FFPE)DNA。在另一个实施例中，所述方法（以及相关试剂盒、组合物、设备和系统）可 以适用于分析相同样品中的两个或更多个来源的基因组物质。
[0110] 实例
[0111] 实例1 :图1描绘如实例2中所描述的正规化方法的非限制性例示性实施例，其中 将标靶核酸分子使用PCR使用正向引物（对于正向链合成）和反向引物（对于反向链合 成）扩增。引物包括与彼此互补并且在允许温度（例如，显著低于引物Tm的温度）下和 /或在允许盐浓度下将与彼此杂交的第一引物序列和第二引物序列。引物还包括不可复制 间隔子，其包含碳-18 (C18)间隔子。扩增产物包括寡核苷酸，其一部分保持单链。扩增产 物的单链区包括捕获序列，所述捕获序列与生物素化的捕获寡核苷酸