73] 取0. 05mol实施例4制得的特立帕肽肽树脂，加入体积百分比为90%的TFA、体积 百分比为5%的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解（混合酸解液IOmL/克特立帕肽树 脂），搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用 少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽 干得类白色粉末即为特立帕肽粗品，粗品纯度为85. 7%。
[0074] 实施例8 :特立帕肽粗品的制备
[0075] 取0. 05mol实施例5制得的特立帕肽肽树脂，加入体积百分比为85%的TFA、体积 百分比为7. 5%的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解（混合酸解液15mL/克特立帕肽树 脂），搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用 少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽 干得类白色粉末即为特立帕肽粗品，粗品纯度为86. 9%。
[0076] 实施例9 :特立帕肽粗品的制备
[0077] 取0. 05mol实施例6制得的特立帕肽肽树脂，加入体积百分比为85%的TFA、体积 百分比为7. 5%的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解（混合酸解液15mL/克特立帕肽树 脂），搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用 少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽 干得类白色粉末即为特立帕肽粗品，粗品纯度为87. 7%。
[0078] 实施例10 :特立帕肽粗品纯化
[0079] 取实施例7所得特立帕肽粗品，加水搅拌溶解，溶液用0. 45 μπι微孔滤膜过滤，纯 化备用；
[0080] 采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10 μ m的反相C18,流动相系统 为0. 1 % TFA/水溶液-0. 1 % TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用 梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸 去乙腈后，得特立帕肽纯化中间体浓缩液；
[0081 ] 取特立帕肽纯化中间体浓缩液，用0. 45 μ m滤膜滤过备用；
[0082] 采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1 %醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色 谱填料为10 μ m的反相C18, 77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上 样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并 用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到特立帕肽醋酸水溶液，冷冻干燥， 得特立帕肽纯品98. 8g，总收率为47. 3%，分子量：4178. 8 (100% M+H)，纯度：99. 4%，最大 单一杂质0. 11 %。
[0083] 实施例11 :特立帕肽粗品纯化
[0084] 取实施例8所得特立帕肽粗品，加水搅拌溶解，溶液用0. 45 μπι微孔滤膜过滤，纯 化备用；
[0085] 采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10 μ m的反相C18,流动相系统 为0. 1 % TFA/水溶液-0. 1 % TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用 梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸 去乙腈后，得特立帕肽纯化中间体浓缩液；
[0086] 取特立帕肽纯化中间体浓缩液，用0. 45 μ m滤膜滤过备用；
[0087] 采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1 %醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色 谱填料为10 μ m的反相C18, 77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上 样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并 用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到特立帕肽醋酸水溶液，冷冻干燥， 得特立帕肽纯品102. 7g，总收率为49. 2%，分子量：4178. 6(100% M+H)，纯度：99. 5%，最大 单一杂质〇. 10%。
[0088] 实施例12 :特立帕肽粗品纯化
[0089] 取实施例9所得特立帕肽粗品，加水搅拌溶解，溶液用0. 45 μπι微孔滤膜过滤，纯 化备用；
[0090] 采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10 μ m的反相C18,流动相系统 为0. 1 % TFA/水溶液-0. 1 % TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用 梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸 去乙腈后，得特立帕肽纯化中间体浓缩液；
[0091 ] 取特立帕肽纯化中间体浓缩液，用0. 45 μ m滤膜滤过备用；
[0092] 采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1 %醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色 谱填料为10 μ m的反相C18, 77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上 样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并 用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到特立帕肽醋酸水溶液，冷冻干燥， 得特立帕肽纯品101. 3g，总收率为48. 5%，分子量：4178. 6(100% M+H)，纯度：99. 1%，最大 单一杂质〇. 13%。
[0093] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种合成特立帕肽的方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1、N端偶联有保护基的Phe在偶联试剂和活化试剂作用下和HMPLinker树脂进 行酯化反应，得到肽树脂1 ; 步骤2、按照特立帕肽氨基酸序列C端到N端的顺序，从肽树脂1出发，在缩合试剂和活 化试剂作用下，将其余保护氨基酸进行逐一延伸偶联，每次延伸偶联后均得到对应的肽树 月旨，最终获得特立帕肽树脂，然后酸解获得特立帕肽粗品，特立帕肽粗品纯化转醋酸盐得到 特立帕肽纯品。2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述HMPLinker树脂为HMPLinkerAmide 树脂、HMPLinkerBHA树脂或HMPLinkerMBHA树脂。3. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述N端偶联有保护基的Phe和HMPLinker 树脂的摩尔比为1-6:1。4. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，每次延伸偶联时所述保护氨基酸和对应肽 树脂的摩尔比为1-6:1。5. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述缩合试剂为N，N-二异丙基碳二亚 胺、N，N-二环己基碳二亚胺，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有机碱、 2-(7-氮杂-IH-苯并三氮唑-1-基）-1，1，3, 3-四甲基脲六氟磷酸酯/有机碱、苯并三氮 唑-N，N，N'，N' -四甲基脲六氟磷酸盐/有机碱、O-苯并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基脲四氟 硼酸酯/有机碱中的一种。6. 根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述有机碱为N，N-二异丙基乙胺、三乙胺或 N-甲基吗啡啉。7. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述活化试剂为1-羟基苯并三唑或N-羟 基-7-氮杂苯并三氮唑。8. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述偶联试剂为N，N-二异丙基碳二亚胺 /4-二甲氨基吡啶双体系偶联试剂。9. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述酸解采用由体积百分比为80-95%的 TFA、体积百分比为1-10%的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解。10. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述纯化转醋酸盐步骤为： 特立帕肽粗品，加10%醋酸溶液溶解，溶液用〇.45ym微孔滤膜过滤，纯化备用； 采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为IOum的反相C18,流动相系统为 0. 1 %TFA/水溶液-0. 1 %TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度 系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙 腈后，得特立帕肽纯化中间体浓缩液； 取特立帕肽纯化中间体浓缩液，用〇. 45ym滤膜滤过备用； 采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1 %醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填 料为10ym的反相C18, 77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方 法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分 析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到特立帕肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得特 立帕肽纯品。
【专利摘要】本发明涉及医药合成领域，公开了一种合成特立帕肽的方法。所述方法将N端偶联有保护基的Phe在偶联试剂和活化试剂作用下和HMP Linker树脂进行酯化反应，得到肽树脂1；按照特立帕肽氨基酸序列C端到N端的顺序，从肽树脂1出发，在缩合试剂和活化试剂作用下，将其余保护氨基酸进行逐一延伸偶联，每次延伸偶联后均得到对应的肽树脂，最终获得特立帕肽树脂，然后酸解获得特立帕肽粗品，特立帕肽粗品纯化转醋酸盐得到特立帕肽纯品。本发明选择合适的合成方案，选择HMP Linker树脂作为载体树脂，并优化了整个合成工艺，获得了高纯度产品，提高了特立帕肽的总收率，并且对任何环境无危害。
【IPC分类】C07K1/04, C07K1/20, C07K14/635, C07K1/06
【公开号】CN104910269
【申请号】CN201510295556
【发明人】文永均, 郭德文, 曾德志, 马中钢
【申请人】成都圣诺生物科技股份有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月2日