等级划分。具体来说，步骤3. 1)中的 抗性等级划分为：A值为I X IO8或者TmaxG小于33的确认为高感品种；A值为I X 10 7或者 TmaxG大于43的确认为感病品种；步骤3. 2)中的抗性等级划分为：斜率小于30的确定为 尚抗品种，斜率大于30的确定为中抗品种。
[0032] 另外步骤2)中的玉米苗期周期时间点为RBSDV传毒后3-35天内均匀分布的3-5 个时间点；待测玉米品种特定位置为顶部第一个叶片。具体来说，步骤2)中的待测玉米品 种为人工带毒玉米植株，该人工带毒玉米植株的培育过程为：2. 1)无毒灰飞虱继代繁殖： 春季采集灰飞虱成虫，而后饲养在小麦幼苗上并产卵，收集刚孵化的1龄若虫即为无毒灰 飞虱，之后在小麦幼苗进行人工饲养继代繁殖；2. 2) RBSDV毒源：从田间采集症状表现为绿 矮病的小麦病株，带回实验室检测证明小麦病株体内寄生病毒为RBSDV并将带毒的小麦病 株作为RBSDV毒源小麦，而后利用无毒灰飞虱在毒源上饲毒而后传毒于麦苗上进行毒源繁 殖，且标准品制备过程中采用的RBSDV亦来源于此；2. 3)带毒灰飞虱获得：将室内人工饲养 的无毒灰飞虱，置于RBSDV毒源小麦上，饲毒处理后移除毒源，将灰飞虱转移到新鲜健康小 麦幼苗上饲养25-30天度过循回期即为带毒灰飞虱；2. 4)带毒灰飞虱传毒接种：带毒灰飞 虱在开始传毒接种前，需要随机抽取一定数量的带毒灰飞虱进行RT-PCR检测RBSDV以计算 带毒灰飞虱的带毒率；玉米幼苗长至一叶一心期后，按照每株玉米幼苗接种10-15头灰飞 虱，并采用80目尼龙网封口的透明玻璃圆筒罩上玉米幼苗在25°C室温下进行传毒接种，三 天后移除带毒灰飞虱；2. 5)待测玉米植株取样及RNA提取：移除带毒灰飞虱后开始计算，按 周期采集待测玉米品种植株上部第一个叶片并提取RNA。 实施例
[0033] 本实施例首先说明待测玉米品种植株的带毒培育过程，然后再对该快速检测鉴定 方法进行说明。
[0034] 首先待测玉米品种植株的带毒培育过程为：a)无毒灰飞虱继代繁殖：2014年春 季从郑州郊区田间麦苗和杂草中采集灰飞虱成虫，而后饲养在小麦幼苗上并产卵，收集刚 孵化的1龄若虫即为无毒灰飞虱，之后在小麦幼苗进行人工饲养继代繁殖。灰飞虱人工大 量饲养在专用养虫室内进行，养虫室内保持25°c恒温，利用加湿器调节室内湿度值为灰飞 虱适宜湿度，大概80%左右；养虫室内放置三层培养架，长宽高为I. 2mX0.8mXl. 2m，层高 0. 4m，每层五排日光灯，保证足够光强，每天光照12h ;灰飞虱饲养材料用周麦22小麦幼苗， 每钵种60株左右，用透明玻璃圆筒罩上，80目尼龙网封口；一般5-7天换一次幼苗，每钵 苗饲养500头灰飞虱。b) RBSDV毒源保存：从田间采集症状表现为绿矮病的小麦病株，带 回实验室检测，证明小麦病株体内寄生病毒为RBSDV，以该发病小麦作为RBSDV毒源，用实 验室繁殖的无毒灰飞虱饲毒3d，度过循回期后传毒于小麦上，表现绿矮症状的病株即为感 染RBSDV，保存于25°C温室中，利用无毒灰飞虱在毒源上饲毒而后传毒于麦苗上进行毒源 繁殖。c)带毒灰飞虱获得：将室内人工饲养的无毒灰飞虱，置于RBSDV毒源小麦上，饲毒处 理48h后移除毒源，将饲毒灰飞虱转移到新鲜健康小麦幼苗上饲养28天度过循回期即为 带毒灰飞虱，用作饲喂带毒灰飞虱的小麦幼苗5-7天更换一次，确保带毒灰飞虱寄主新鲜、 健康，减少灰飞虱死亡率，灰飞虱饲毒和度过循回期过程均在25°C温室中进行。d)灰飞虱 传毒接种：在带毒灰飞虱在开始传毒接种前需要测试带毒率，经过饲毒的灰飞虱度过28天 循回期后则成为有效带毒虫态，每饲毒处理随机取30头灰飞虱，提取单头灰飞虱RNA用RP 和RBSDV-R引物进行RT-PCR扩增检测后，经1%琼脂糖凝胶电泳查看灰飞虱的带毒情况：30 头灰飞虱中，有7头扩增出339bp大小的片段，其余23头未扩增出目的条带，计算出灰飞 虱的带毒率为23. 3%，而琼脂糖凝胶电泳检测结果则如图3所示，电泳图谱中所用Maker为 5〇131^〇的02000 0嫩1^(1(161'，谱带大小分别为200(^口、100(^口、75(^口、50(^口和25(^口；带 毒率测定后，选取C7-2、P138、丹340、478、XH6、Mol7、郑58和郑单958共八种玉米品种作 为待测玉米品种进行传毒接种，当待测玉米品种的幼苗长至一叶一心期后开始传毒接种， 每株幼苗接种10头灰飞虱，用透明玻璃圆筒罩上，80目尼龙网封口，在25°C室温下进行传 毒接种，三天后移除带毒灰飞虱。e)待测玉米植株取样及RNA提取：移除带毒灰飞虱后开 始计算，第7d、14d、21d、28d、35d分别采集每个玉米植株上部第一个叶片，并提取RNA进行 荧光定量RT-PCR检测。
[0035] 该快速检测鉴定方法的过程为：1)荧光定量PCR反应获取RBSDV病毒含量标准曲 线：1. 1)标准品制备：利用引物RBSDV-F :5'-AGA GCT CTT CTA GTT ATT GCG-3'和RBSDV-R : 5' -TCA GCA AAA GGT AAA GGA ACG-3' 扩增 RBSDV 病毒的 S7 片段，并回收连接于 pMD18-T 载体，经测序确认为该S7片段的重组质粒DNA后作为标准品，用Nano drop 2000测得标 准品的质粒浓度并计算出标准品起始拷贝数为2. 98X IO8Copy/ μ I ;1. 2)制备梯度标准品： 将步骤I. 1)获得的标准品作为标准品I，依次按照下述稀释方法稀释：Iv原液(标准品I ) +9v稀释缓冲液，得标准品II ;Iv标准品II +9v稀释缓冲液，得标准品III ;Iv标准品III +9v 稀释缓冲液，得标准品IV ; Iv标准品IV +9v稀释缓冲液，得标准品V ; Iv标准品V +9v稀 释缓冲液，得标准品VI ; Iv标准品VI +9v稀释缓冲液，得标准品W ; Iv标准品W +9v稀释 缓冲液，得标准品VID ;最终获得二个重复的梯度标准品溶液：标准品I、标准品II、标准品 III、标准品IV、标准品V、标准品VI、标准品W和标准品VID，且标准品I、标准品II、标准品 III、标准品IV、标准品V、标准品VI、标准品W和标准品VID的拷贝数分别为：2. 98X IO7copy/ μ 1、2· 98 X IO6Copy/ μ 1、2· 98 X IO5Copy/ μ 1、2· 98 X IO4Copy/ μ 1、2. 98 X IO3Copy/ μ 1、 2. 98Χ IO2Copy/ μ 1、2. 98Χ IOcopy/ μ I ;1. 3)对步骤I. 2)获得的梯度标准品皆采用引物 RBSDV-R 和 RP :5' -GCT CCT ACT GAG TTG CCT GTC-3' 进行荧光定量 RT-PCR 扩增，由于 标准品VDI的扩增结果不稳定，故在绘制标准曲线时弃用标准品W，以标准品I、标准品II、 标准品III、标准品IV、标准品V、标准品VI、标准品W的模板拷贝数的对数值为横坐标值、 以标准品I、标准品II、标准品III、标准品IV、标准品V、标准品VI、标准品W测得的Ct值 为纵坐标值，绘制出标准曲线如图1所示，故本实验的检测灵敏度为298copy/μ 1，说明本 申请提供的快速检测鉴定方法的灵敏度非常高。图1中标准曲线的线性回归方程为：y= -3. 17x+39. 38 (R2=O. 997)，其中y代表所测样品的Ct值，X代表标准品起始拷贝数的对 数值；由图1得知标准曲线的相关系数为〇. 997,即该标准曲线符合线性计算要求的准确 度；将测得的未知样品的Ct值代入标准曲线线性公式即可得到未知样品中的具体核酸拷 贝数。2)玉米样品RNA获取：移除带毒灰飞虱后开始计算，第7d、14d、21d、28d、35d分别采 集每个玉米植株上部第一个叶片并提取RNA。3)玉米样品病毒拷贝数获取及鉴定：对步骤 2)中提取的RNA进行荧光定量RT-PCR检测获得不同时间样品的Ct值，再利用步骤1)中 的标准曲线计算出相应的病毒拷贝数，以取样时间点为横坐标值、与取样时间点相对应的 病毒拷贝数的对数值为纵坐标值，即可获得不同玉米品种体内RBSDV病毒积累动态曲线图 如图3所示，其中带实心菱形符号的曲线为玉米品种478体内的RBSDV病毒积累动态曲线、 带实心矩形符号的曲线为玉米品种XH6体内的RBSDV病毒积累动态曲线、带实心三角形符 号的曲线为玉米品种郑单958体内的RBSDV病毒积累动态曲线、带叉形符号的为玉米品种 M〇17体内的RBSDV病毒积累动态曲线、带星形符号的为玉米品种郑58体内的RBSDV病毒 积累动态曲线、带圆圈符号的为玉米品种C7-2体内的RBSDV病毒积累动态曲线、带空心矩 形符号的为玉米品种丹340体内的RBSDV病毒积累动态曲线、带空心三角形符号的为玉米 品种P138体内的RBSDV病毒积累动态曲线，简单来说，当特定玉米品种体内RBSDV病毒积 累动态曲线位于该RBSDV病毒积累动态曲线图上方时则该玉米品种为感病品种，当特定玉 米品种体内RBSDV病毒积累动态曲线位于该RBSDV病毒积累动态曲线图下方时则该玉米品 种为抗病品种，从而快速确定该玉米品种的玉米粗缩病种质抗性。从图3能够看出，荧光定 量RT-PCR表明RBSDV病毒在不同抗性玉米材料中增殖曲线明显分为两大类，第一类是感病 类，植株体内病毒含量远高于第二类，其病毒呈现出直线增长趋势，第二类是抗病类，植株 体内病毒含量低，病毒增长缓慢而且存在平台期。5个病毒增殖较快的感病类材料中玉米品 种478、Mol7和XH6的病毒量最高，因此鉴定为高感，玉米品种郑58和郑单958病毒含量次 之，鉴定为感病；3个抗病类玉米品种中P138病毒含量最低且增殖最为缓慢，鉴定为高抗， C7-2和丹340病毒含