一种小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物及其制备方法和应用
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物；本发明还涉及所述纳米 复合物的制备方法及其催化邻苯二胺的应用。
【背景技术】：
[0002] 蛋白质与无机纳米粒子的组装在生物催化、生物医学诊断和生物传感器等领域具 有广泛的基础和应用研宄价值。生物无机界面组装涉及到范德华力、疏水亲合作用、静电相 互作用和氢键等作用。虽然无机纳米粒子固定蛋白质后会提高它们的性能，但被固定的蛋 白质可能由于一些不合适的界面组装条件而变性失活。为了使固定的蛋白质保持其原有的 二级结构和生物活性，寻找生物相容性好、活性位点多的无机纳米材料显得尤为重要。
[0003] 类水滑石是一类二维纳米阴离子粘土，又叫层状双金属氢氧化物（Layered Double Hydroxides, LDH)，组成通式可表不为[Μ^+Μ/νΟΗ)；^+(An0x/n · mH20,其中 M(OH)6 八面体共用棱而呈现开放的片层堆积结构，每个八面体单元由六配位的中心金属离子M和 位于顶点的OH-形成，由于部分M2+被M 3+取代会使片层带结构正电荷，层间存在可交换 的阴离子使电荷达到平衡。与其他无机材料相比，类水滑石不仅容易被人工合成，原料来 源非常丰富，而且具有表面积大、离子交换容量高、插层空间和电荷密度可调、生物相容性 好、热稳定性和化学稳定性高等特点，是氨基酸、DNA、核苷单磷酸酯、多糖、蛋白质、多肽和 酶等生物分子良好的绿色固定材料 [Liu C X，Hou W G, Li L F, Li F, Liu S J. Synthesis and characterization of 5-fluorocytosine intercalated Zn - Al layered double hydroxide. J. Solid State Chem., 2008, 181, 1792-1797.]。但研宄表明，类水滑石上述性能 及应用与其粒径大小和粒径分布范围有着密切关系[Choy J-H，Kwak S-Y，Park J-S，Jeong Y-J, Portier J. Intercalative Nanohybrids of Nucleoside Monophosphates and DNA in Layered Metal Hydroxide. J. Am. Chem. Soc. , 1999, 121, 1399 - 1400.]，其中小粒径均一分 散的类水滑石纳米粒子能更好地固定生物分子，并能保持其结构和生物活性，提高其潜在 的应用价值。
[0004] 传统共沉淀法合成类水滑石纳米粒子时，可通过调节金属离子浓度、过饱和度、滴 料方式等方法对成核过程施加影响。由于盐和碱的混合通过搅拌方式实现，通常混合很不 充分，反应界面小，存在浓度梯度，反应速度和扩散速度慢，即先期形成晶核的生长与后期 晶核的形成共存，导致产物的粒径分布较大，难以控制粒径大小，且有聚集现象。目前制备 单分散、尺寸可调的类水滑石纳米粒子的方法主要有：向晶化介质中加入有机溶剂，改变 固-液界面张力，制备小粒径纳米粒子；采用微乳液反胶团法，通过控制微乳反应器的水核 半径控制晶粒大小；采用成核和晶化过程分开法制备粒径分布范围窄的类水滑石纳米颗 粒。但是这些方法要么增加了新的原料，要么步骤繁琐，操作复杂，与绿色化学的要求仍有 很大距离。利用T-形微反应器限域效应和反应物间快速充分混合的特性，便可以有效克服 传统方法的不足，通过简便的实验操作，得到粒径分布范围窄，颗粒较小，分散性好纳米粒 子[Ying Y, Chen G W, Zhao Y C, et al. A high throughput methodology for continuous preparation of monodispersed nanocrystals in microfludic reactors. Chem Eng J, 2008, 135:209-215. ] 〇
[0005] 生物分子模板诱导法是制备生物无机杂化物的常用方法之一。一般情况下，生物 分子首先与金属阳离子结合，形成蛋白质-金属离子配合物的形式，金属离子在生物分子 上作为成核位点，在生物分子诱导和模板作用下与阴离子反应生成生物分子-无机纳米杂 化物。如Ge Jun等以牛血清蛋白为诱导分子，先通过蛋白分子中的氨基与Cu2+形成配位 键，所得配合物作为无机纳米初晶成核的位点，在生物分子诱导下，磷酸根慢慢与Cu 2+结合 生长成了生物分子纳米初晶的聚集体，聚集体表面的磷酸铜初晶在生物分子的诱导下可控 生长，形成了单独的花瓣，最后生物分子诱导小花瓣形成了花瓣分支，同时它作为分子胶将 这些花辦连接起来[Ge J, Lei J, Zare R N. Protein - inorganic hybrid nanoflowers. Nature Nanotechnology. 2012, 7(7) :428-432.]。所得生物酶-无机纳米复合粒子的生物 催化活性得到了明显提高。因此，生物分子模板诱导法制备有机无机纳米粒子具有粒径和 形貌可控、比表面积大、生物相容性好等优点。但目前还未见以氧化还原蛋白质为生物分子 模板，采用T型微反应器共沉淀法制备小粒径蛋白质/类水滑石纳米复合物及其生物催化 方面的报道。
【发明内容】
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[0006] 针对现有技术的不足以及本领域研宄和应用的需求，本发明的目的是提供一种小 粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物及其制备方法和催化邻苯二胺的应用。
[0007] 本发明所提供的一种小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物，是以血红蛋白为生 物分子模板，以二价金属盐Mg (NO3)2和三价金属盐Al (NO3)3混合溶液为金属离子来源，以氢 氧化钠溶液为碱源，在血红蛋白模板分子诱导下，采用T型微反应器共沉淀法制得的，其制 备方法如下：
[0008] 分别称取MgCl2 · 6H20和AlCl3 · 9H20,加入去离子水，配制总金属离子浓度为5~ 50mmol/L的MgCljP AlCl 3混合盐溶液，向其中加入一定量的血红蛋白，混合均匀后记为溶 液A ;配制一定浓度的氢氧化钠溶液，记为溶液B ;打开T型微反应器，将溶液A、溶液B分别 加入T型微反应器的盐液管和碱液管中，控制流速，保持反应混合液的pH在9. 0左右，在 混合液出口处接收反应产物；反应混合液在N2保护条件下，低温搅拌24h，结束后将混合液 12000rpm下离心10min，超纯水将沉淀洗涤3次，得血红蛋白/类水滑石纳米复合物胶状 物。
[0009] 其制备方法中所述的MgCldP AlCl 3混合盐溶液中MgCl 2和AlCl 3的摩尔比为3 : 1 ;血红蛋白加入量控制在使其浓度为0. 2g/L ;配制的氢氧化钠溶液浓度为0. 02mol/L ;所 述T形微反应器的微通道尺寸分别为宽0· 3mm，高0· 2mm，长20mm，流速为10mL/min ;低温是 指0~10 °C的冰盐浴条件。
[0010] 所述的一种小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物，其形貌呈海绵状和不定型的 小颗粒状，具有大的比表面积；平均粒径小于40nm，厚度小于5nm ;Zeta电位在+16mV到 +30mV之间。
[0011] 所述的一种小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物，血红蛋白分子均匀地吸附在 类水滑石粒子表面，并保持了蛋白质原有的二级结构。
[0012] 所述的小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物催化邻苯二胺的应用，特别是高温 条件下催化邻苯二胺的应用。
[0013] 本发明以血红蛋白为生物分子模板，以二价金属盐Mg(NO3)2和三价金属盐 Al (NO3) 3混合溶液为金属离子来源，以氢氧化钠溶液为碱源，在血红蛋白模板分子诱导下， 采用T型微反应器共沉淀法制备了一种小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物，本发明与 现有技术相比，主要的有益效果和优点在于：
[0014] 1)本发明所述的血红蛋白模板分子诱导下，T型微反应器共沉淀制备小粒径血红 蛋白/类水滑石纳米复合物的方法，具有粒径小、粒径分布范围窄、比表面积