(SEQ ID NO: 2) (GAG2 接头）至少 50% (例如至 少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相 同的序列。在一些实施方案中，接头或间隔子包含与GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGG GGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(SEQ ID NO:3) (GAG3 接头）至少 50% (例如至少 55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相同的序列。
[0124] 产生抗Flt-I抗体和抗原结合片段
[0125] 适于本发明的重组抗Flt-I抗体或抗原结合片段可通过任何可用手段来产生。举 例来说，可通过利用被工程化来表达重组抗Flt-I抗体或抗原结合片段编码核酸的宿主细 胞系统来重组产生重组抗Flt-I抗体或抗原结合片段。
[0126] 当重组产生抗体时，可使用任何表达系统。仅举几例来说，已知表达系统包括例如 卵、杆状病毒、植物、酵母或哺乳动物细胞。
[0127] 在一些实施方案中，适于本发明的重组抗Flt-I抗体或抗原结合片段是在哺 乳动物细胞中产生。可根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括但不限 于BALB/c小鼠骨髓瘤株系（NS0/1，ECACC编号：85110503);人成视网膜细胞（PER. C6， CruCell，Leiden，The Netherlands);由 SV40 转化的猴肾CVl 株系（C0S-7，ATCC CRL1651) 〇
[0128] 在一些实施方案中，本发明提供由人细胞产生的重组抗Flt-I抗体或抗原结合片 段。在一些实施方案中，本发明提供由CHO细胞产生的抗Flt-I抗体或抗原结合片段。
[0129] 药物组合物和施用
[0130] 本发明进一步提供一种药物组合物，其含有本文所述的抗Flt-I抗体或抗原结合 片段以及生理可接受的载体或赋形剂。
[0131] 适合药学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液（例如NaCl)、盐水、缓冲盐水、 醇、甘油、乙醇、阿拉伯胶（gum arabic)、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物（如 乳糖、直链淀粉或淀粉、糖（如甘露糖醇、蔗糖或其它糖、右旋糖））、硬脂酸镁、滑石、硅酸、 粘稠石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等以及其组合。必要时，药物 制剂可与不有害地与活性化合物反应或干扰它们的活性的助剂（例如润滑剂、防腐剂、稳 定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳族物质等）混 合。在优选实施方案中，使用适于静脉内施用的水溶性载体。
[0132] 必要时，适合的药物组合物或药剂也可含有少量湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。组 合物可为液体溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末。组合物也可用传 统粘合剂和载体（如甘油三酯）配制成栓剂。口服制剂可包括标准载体，如医药级甘露糖 醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
[0133] 可根据常规程序将药物组合物或药剂配制成适合于向人类施用的药物组合物。举 例来说，在一些实施方案中，用于静脉内施用的组合物通常是于无菌等张水性缓冲液中的 溶液。必要时，组合物也可包括增溶剂和局部麻醉剂以减轻注射部位处的疼痛。通常，分开 或以单位剂型混合在一起来将成分供应于如安瓿或药囊的指示活性剂的量的气密容器中， 所述单位剂型例如呈干燥冻干粉末或无水浓缩物形式。当组合物待通过输注施用时，它可 用含有无菌医药级水、盐水或右旋糖/水的输注瓶分配。当组合物是通过注射施用时，可提 供含无菌注射用水或盐水的安瓿以使成分可在施用之前加以混合。
[0134] 施用途径
[0135] 本文所述的抗Flt-I抗体或抗原结合片段（或含有本文所述的抗Flt-I抗体或抗 原结合片段的组合物或药剂）是通过任何适当途径施用。在一些实施方案中，抗Flt-I抗体 或抗原结合片段蛋白质或含有其的药物组合物经胃肠外施用。胃肠外施用可为静脉内、皮 内、鞘内、吸入、经皮（局部）、眼内、肌肉内、皮下、肌肉内和/或经粘膜施用。在一些实施方 案中，抗Flt-I抗体或抗原结合片段或含有其的药物组合物是皮下施用。如本文所用，术语 "皮下组织"定义为紧靠在皮肤下的一层松散、不规则结缔组织。举例来说，皮下施用可通过 向包括但不限于大腿区域、腹部区域、臀区域或肩胛区域的区域中注射组合物来进行。在一 些实施方案中，抗Flt-I抗体或其抗原结合片段或含有其的药物组合物是静脉内施用。在 一些实施方案中，抗Flt-I抗体或抗原结合片段或含有其的药物组合物经口服施用。必要 时，可同时使用一种以上途径。
[0136] 在一些实施方案中，施用仅在个体中产生局部作用，而在其它实施方案中，施用遍 及个体的多个部分产生作用，例如全身性作用。通常，施用导致向一种或多种靶标组织递送 抗Flt-I抗体或抗原结合片段，所述组织包括但不限于肾、肝、脑、脊髓、肠道、眼、肺、脾、心 脏、横纹肌和平滑肌。
[0137] 在一些实施方案中，横纹肌选自由三头肌、胫骨前肌、比目鱼肌、腓肠肌、四头肌和 膈肌组成的组。
[0138] 在一些实施方案中，平滑肌选自由组成的组。
[0139] 剂型和给药方案
[0140] 在一些实施方案中，组合物是以治疗有效量和/或根据与特定所需结果相关（例 如与治疗或降低如杜兴氏肌营养不良的肌营养不良的风险相关）的给药方案施用。
[0141] 待根据本发明施用的特定剂量或量可例如随以下而变化：所需结果的性质和/或 程度、施用途径和/或时序的细节、和/或一种或多种特征（例如重量、年龄、个人史、遗传 特征、生活方式参数、心脏缺陷的严重性和/或心脏缺陷的风险水平等或其组合）。所述剂 量或量可由普通技术人员确定。在一些实施方案中，适当剂量或量是根据标准临床技术确 定。或者或另外，在一些实施方案中，适当剂量或量是通过使用一种或多种体外或体内测定 以帮助鉴定待施用的合乎需要或最优剂量范围或量来确定。
[0142] 在各种实施方案中，抗Flt-I抗体或其抗原结合片段是在治疗有效量下施用。通 常，治疗有效量足以达成对受试者有意义的益处（例如治疗、调节、治愈、预防和/或改善潜 伏疾病或病状）。在一些特定实施方案中，待施用的适当剂量或量可根据由体外或动物模型 测试系统获得的剂量-反应曲线外推。
[0143] 在一些实施方案中，提供的组合物是以药物制剂形式提供。在一些实施方案中，药 物制剂是或包含单位给药量以根据与达成如杜兴氏肌营养不良的肌营养不良的发生率或 风险降低相关的给药方案来施用。
[0144] 在一些实施方案中，包含本文所述的抗Flt-I抗体或抗原结合片段的制剂是以单 次剂量形式施用。在一些实施方案中，包含本文所述的抗Flt-I抗体或抗原结合片段的制 剂是在定期间隔下施用。如本文所用，在某一"间隔"下施用指示治疗有效量是定期施用 (不同于一次性给药）。可通过标准临床技术确定间隔。在一些实施方案中，包含本文所述 的抗Flt-I抗体或抗原结合片段的制剂每两月、每月、每月两次、每三周、每两周、每周、每 周两次、每周三次、每日、每日两次或每6小时加以施用。视个体的需要而定，用于单一个体 的施用间隔无需是固定间隔，而是可随时间变化。
[0145] 如本文所用，术语"每两月"是指每两个月施用一次（即每两个月一次）；术语"每 月"是指每个月施用一次；术语"每三周"是指每三周施用一次（即每三周一次）；术语"每 两周"是指每两周施用一次（即每两周一次）；术语"每周"是指每周施用一次；并且术语 "每日"是指每天施用一次。
[0146] 在一些实施方案中，包含本文所述的抗Flt-I抗体或抗原结合片段的制剂是在定 期间隔下无限期施用。在一些实施方案中，包含本文所述的抗Flt-I抗体或抗原结合片段 的制剂是在定期间隔下施用确定时期。
[0147] 在一些实施方案中，施用抗Flt-I抗体或其抗原结合片段会降低至少一种DMD征 象或症状的强度、严重性或频率或延迟其发作。在一些实施方案中，施用抗Flt-I抗体或其 抗原结合片段会降低至少一种DMD征象或症状的强度、严重性或频率或延迟其发作，所述 征象或症状选自由肌肉萎缩、骨骼变形、心肌病、肌肉缺血、认知损害和呼吸功能受损组成 的组。
[0148] 在一些实施方案中，施用抗Flt-I抗体或其抗原结合片段会改进临床结果，如通 过6分钟行走测试、定量肌肉强度测试、定时运动表现测试、Brooke和Vignos肢体功能量 表、肺功能测试（用力肺活量、1秒内的用力呼气量、峰值呼气流速、最大吸气和呼气压力）、 健康相关的生活质量、膝和肘屈肌、肘伸肌、肩部外展、抓握强度、自仰卧位到起身的时间、 North Start动态评估、定时10米行走/奔跑、Egen分类量表、Gowers计分、Hammersmith 运动能力、手持式肌力量度器、活动范围、测角术、高碳酸血、婴儿和学步儿发育的Nayley 量表和/或照顾者负担量表所测量。
[0149] 组合疗法
[0150] 在一些实施方案中，抗Flt-I抗体或抗原结合片段是与一种或多种当前用于治疗 肌营养不良的已知治疗剂（例如皮质类固醇）组合施用。在一些实施方案中，已知治疗剂 是根据它的标准或核准给药方案和/或时程施用。在一些实施方案中，已知治疗剂是根据 相较于它的标准或核准给药方案和/或时程被改变的方案施用。在一些实施方案中，所述 改变的方案在以下方面不同于标准或核准给药方案：一个或多个单位剂量的量被改变（例 如降低或增加），和/或给药的频率被改变（例如单位剂量之间的一个或多个间隔被扩大， 从而导致频率较低，或所述间隔被降低，从而导致频率较高）。 实施例
[0151] 实施例L产生和表征高亲和力抗Flt-I抗体
[0152] 抗体 01A04
[0153] 使用传统小鼠单克隆抗体方法针对可溶性Flt-I产生抗体。简要来说，用重组人 可溶性Flt-I (购自ABCAM)免疫Balb/c小鼠。在免疫后第20天，通过ELISA来滴定动物 的抗sFlt-1产量（图1)。发现一只小鼠是高滴度反应者；随后用抗原使这个动物加强免 疫，并且在5天后处死。使来自这个动物的脾和淋巴结细胞融合于小鼠骨髓瘤伴侣以产生 杂交瘤。相对于sFlt-Ι抗原筛选杂交瘤上清液，并且按比例扩大阳性反应者并再测定其与 人sFlt-Ι与小鼠 sFlt-Ι两者的结合，以及与sFlt-Ι竞争结合VEGF的能力。不存在可结合 人sFlt-Ι与小鼠 sFlt-Ι两者的交叉反应性杂交瘤。然而，在人sFlt-Ι反应性杂交瘤之中， 通过竞争ELISA鉴定出若干sFlt-1: VEGF拮抗剂（对于代表性实验，参见图2)。使这些拮 抗剂中的最强力拮抗剂融合伴侣01A04经受三轮单细胞克隆以获得单克隆抗体01A04。进 一步表征这个抗体对sFlt-Ι抗原的结合亲和力（ELISA、BIACORE和FACs);在sFlt-1 :VEGF 竞争ELISA中的IC50 ;以及在基于细胞的测定中的性能。
[0154] 抗体01A04表征-结合
[0155] 在克隆和亚克隆融合伴侣亲本之后，01A04亲本的多个亚克隆显示与固定的可溶 性Flt-I结合（图3)。选择这些亚克隆中的一个（即单克隆01A04-02B10-02G07)用于 按比例放大以及基于抗原结合、克隆形态和活力进行细胞存库。通过表面等离子体共振方 法（BIAC0RE，参见图4)测定01A04-02B10-02G07对sFlt-Ι抗原的结合常