Cd44质粒的新用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及⑶44质粒的新用途。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是世界范围内女性最常见的恶性肿瘤。大量证据表明正是由于乳腺癌干细 胞（BreastCancerStemCell,BCSC)的存在导致其容易转移，复发且对放化疗抵抗。而近 年来兴起的过继细胞免疫疗法（adoptivecellimmunotherapy,ACI)是一种针对放化疗不 敏感肿瘤的新疗法，临床前景广阔，获得越来越多的重视。
[0003]CSC的存在是影响乳腺癌治疗效果和预后最重要的因素之一，目前临床上应用 的放化疗通常只能消除普通乳腺癌细胞，而对放化疗抵抗的残存BCSC仍能不断增殖，导 致乳腺癌复发转移，所以寻找一种行之有效的杀灭CSC的方法成为乳腺癌治疗的新方向。 ACI是一种依赖自体效应性免疫细胞的体外扩增进行肿瘤细胞有效杀灭的新型疗法，其 首先应用于恶性白血病的治疗，后逐步推广至包括乳腺癌、结肠癌、肺癌等在内的实体肿 瘤。ACI的效应细胞主要包括细胞因子诱导的杀伤细胞（CIKs)，淋巴因子激活的杀伤细胞 (lymphokine-activatedkillercells,LAKs)，肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocytes,TILs)、细胞毒性了淋巴细胞（cytotoxicTlymphocytecells,CTLs)及新近 提出的嵌合抗原受体的T细胞（chimericantigenreceptorTcells,CAR-T)等。而作为 体内功能最强大的专职抗原提呈的DC也是ACI重要的组成部分。
[0004] CIK细胞具有增殖快速、杀瘤力强、杀瘤谱广、对正常细胞无杀伤作用、对耐药肿瘤 敏感等优点，是目前已知的活性最高的非特异性杀伤免疫效应细胞。DC能够将肿瘤抗原提 呈给免疫活性细胞，促进其增殖活化，增强对肿瘤细胞的杀伤活性。有研宄表明，负载肿瘤 干细胞抗原的DC免疫表型较前成熟，而将其与CIK细胞共同培养后，DC-CIK免疫表型进一 步成熟且分泌细胞因子水平相应提高。
[0005] ⑶44是乳腺癌干细胞最重要的分子标记，它是一种单跨膜糖蛋白，通过与多种配 体的结合在细胞粘附和迀移等行为中发挥关键作用。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题在于提供⑶44质粒的新用途。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0008] CD44质粒在增强DC-CIK对乳腺癌干细胞的体外杀伤作用方面的应用。
[0009] 优选的，上述0)44质粒的应用，以0)44质粒冲击DC(dendriticcell)后与 CIK(cytokine-inducedkiller)细胞联合培养使DC-CIK对乳腺癌干细胞的体外杀伤效果 增强。
[0010] 优选的，上述⑶44质粒的应用，所述⑶44质粒的序列为序列表〈400>1所示序列。
[0011] 本发明的有益效果是：
[0012] CD44质粒在增强DC-CIK对乳腺癌干细胞的体外杀伤作用方面具有重要应用价 值。
【附图说明】
[0013] 图1是MDA-MB-231细胞传代培养和微球体培养图，其中，A:微球培养第三天 MDA-MB-231细胞形态（X200)，B:微球培养第十天MDA-MB-231细胞形态（X200);
[0014] 图2是目的基因和目的质粒的鉴定结果图，其中，A:PCR后CD44(sl-s5)条带（1: CD44(sl-s5) ;M:100bpmarker) ;B:CD44 质粒经过双酶切后片段PCDNA3.1+-CD44(sl-s5) (1 :不消化的质粒；2 :消化的质粒；Ml:lkbmarker;M2 :100bpmarker);
[0015] 图3是⑶44质粒测序结果图；
[0016] 图4是⑶44蛋白表达的免疫印迹法（westernblotting)结果图；
[0017] 图5是转染CD44质粒后的293T细胞，其中，A:显微镜下293T细胞（X100)，B:显 微镜下293T荧光细胞（X100)。
【具体实施方式】
[0018] 为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合【具体实施方式】 对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
[0019] 实施例1
[0020] 1材料与方法
[0021] 1. 1主要材料DMEM培养基、胎牛血清、青链霉素、淋巴细胞分离液购自天津灏洋生 物制品科技有限公司；B27因子、重组表皮生长因子（EGF)、碱性成纤维生长因子（bFGF)购 自美国PeproTech公司；粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子（GM-CSF)、白细胞介素（IL)-4， (IL)-2,肿瘤坏死因子（TNF)-a，干扰素（IFN)-y，单克隆抗体⑶3均购自美国Gibco公 司；RNA提取试剂盒购自Qiagen公司；RT-PCR试剂盒购自Takara公司；琼脂糖凝胶回收、 小提质粒、大提质粒试剂盒均购自天根生化科技有限公司。乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自 ATCC〇
[0022] 1. 2 方法
[0023] 1. 2. 1MDA-MB-231的传代培养细胞培养基的配制：DMEM445ml、10%胎牛血清 50ml、双抗5ml。将冻存的乳腺癌细胞MDA-MB-231放入37°C水浴中融解后，在超净台内直 接加入到盛有lOmlDMEM全培养基的25ml培养瓶内，于37°C、5%C02、饱和湿度的培养箱中 培养，次日观察细胞生长情况，并全量换液，之后每2-3d换一次液。
[0024]1. 2. 2MDA-MB-231的微球培养干细胞培养基的配制：DMEM98ml、EGF2yg(终浓度 20ng/mL)、bFGF1yg(终浓度10ng/mL)、2% (体积分数）B272ml。待上述乳腺癌细胞长至对 数生长期，收集细胞，加入3ml干细胞培养基重悬后计数，以5X103个/ml密度接种至25cm2 培养瓶中，加入l〇ml干细胞培养基，于37°C、5%C02、饱和湿度的培养箱中培养，每2-3d换 一次液。
[0025] 1. 2. 3PCDNA3.l+-CD44(sl-s5)质粒的构建根据GeneBank中人CD44(sl-s5) (登录号：NM-001001391. 1)基因序列，利用Oligo软件设计酶切引物，送公司合成后，以 MDA-MB-231细胞中提取的RNA反转录生成的cDNA为模板进行PCR，产物与载体TCDNA3. 1+ 分别进行双酶切后连接，转化JM109感受态细胞进行扩增，小量提取质粒后分别以酶切电 泳及测序进行鉴定，结果正确的菌液接大瓶后进行质粒的大量提取，储存于-20°C备用。
[0026] 1. 2. 4⑶44质粒转染293T细胞检测转染效率从上述构建好的 P⑶NA3. 1+-⑶44 (sl-s5)质粒上切下目的片段，亚克隆进入绿色荧光载体pEGFP-C3,构建真 核表达质粒PEGFP-C3-⑶44 (sl-s5)。常规培养293T细胞，待长至对数生长期，调整细胞数 为5 X 105个/孔进行铺孔，设置复孔并补加相应量无双抗培养基，24h后将上述绿色荧光质 粒与转染试剂按照l:4(m/v)的比例加入到标记孔中，混合均匀，5h后吸除原有培养基并换 成含双抗的完全培养基，48h后收集细胞进行Western blot检测转染效率。
[0027] 1. 2. 5DC和CIK细胞的制备采集并分离正常人脐血单个核细胞，PBS清洗后常规条 件下培养4h。分别收集贴壁细胞和悬浮细胞。前者诱导成为DC:吸除原有培养基，加入含 GM-CSF600U/ml和IL-4 500U/ml的无血清培养基常规培养，每3d半量换液，并补足细胞因 子。在培养的第6d加入TNF-a500U/ml，诱导DC成熟；后者诱导成为CIK:离心后以含有 IFN-y1000U/ml的无血清培养基重悬，24h后加入CD350ng/ml单抗及IL-2 300U/ml，每3d 半量换液，并补足IL-2,于第7d收获CIK细胞备用。
[0028] 1. 2. 6DC的抗原负载于DC诱导培养的第5d调整DC数为5 X 105个/孔进行铺孔， 设置复孔，补加相应量无双抗培养基后分别将CD44质粒和PCDNA3. 1+空载体与转染试剂按 照l:4(m/v)的比例加入到相应标记孔中，混合均匀，5h后吸除原有培养基并换成含双抗的 完全培养基，48h后收集实验孔细胞备用。
[0029] 1. 2. 7负载抗原的DC与CIK细胞共同培养将上述负载⑶44质粒和空载的DC和 CIK细胞按1:10的数目比例加入到含IL-2 300U/ml的无血清培养基中，每3d半量换液，并 补足IL-2,于第7d收集并计数细胞备用。
[0030] 1. 2. 8体外细胞杀伤试验以共培养7d的上述CD44-DC-CIK细胞和空载-DC-CIK细 胞为2组效应细胞，微球体培养法富集的MDA-MB-231细胞球为靶细胞，调整效应细胞和靶 细胞浓度，使效靶比依次为40:1、20:1、10:1，5:1每组分别设3个复孔。应用LDH释放法测 定细胞杀伤活性，以酶标仪检测492nm波长处的光吸收值（0D值）。
[0031] 按以下公式计算杀伤率：杀伤率（％)=(实验组0D值-效应细胞自发释放0D 值-靶细胞自发释放0D值）八靶细胞最大释放00值-靶细胞自发释放00值）乂100%
[0032] 1. 3统计学方法采用SPSS17. 0统计软件分析数据，计量资料数据用土S) 表示，均数之间比较采用两个独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析方法，P< 0. 05为差异有统计学意义。
[0033] 2 结果
[0034] 2. 1微球培养前后MDA-MB-231细胞形态变化图1A、B可见微球培养前细胞呈贴壁 生长，而培养后成球悬浮生长。
[0035] 2.2CD44(sl-s5)的PCR、质粒酶切及基因测序鉴定图2显示PCR后CD44(sl-s5) 条带大小与理论值相符且质粒经过双酶切后仍能切出该大小片段（图中箭头所指）。基因 测序结果如图3所示，所述CD44质粒的序列为序列表〈400>1所示序列。
[0036] 2. 3转染293T细胞后⑶44蛋白表达及转染结果图4A和B显示了在内参照Actin 表达水平相当的情况下，转染空载体组无⑶44表达，而转染⑶44质粒组⑶44蛋白正常表 达；图5A和B分别为转染完⑶44质粒常规显微镜及荧光显微镜下293T细胞图片。
[0037] 2. 4杀伤效果检测用LDH释放法检测在5:1、10:1、20:1、40:1四种效靶比时， ⑶44-DC-CIK细胞及空载-DC-CIK细胞对靶细胞，即乳腺癌干细胞的杀伤活性。
[0038] 表1各组细胞毒性百分比（％ )
[0039] 组别 效靶比5:1效靶比10:1效靶比20:1效靶比40:1 实I佥组 30. 45±10. 78 36. 21 ±11.39 49. 03±12. 33 65. 21 ±13. 10 对"，照组 10.21 ±7. 58 14. 89±6. 76 21. 11 ±9. 67 27. 72±11.31
[0040] 可见，⑶44质粒可以有效增强DC-CIK对乳腺癌干细胞的体外杀伤作用。
[0041] 上述参照【具体实施方式】对该CD44质粒的新用途进行的详细描述，是说明性的而 不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下 的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. CD44质粒在增强DC-CIK对乳腺癌干细胞的体外杀伤作用方面的应用。2. 根据权利要求1所述的CD44质粒的应用，其特征在于：以CD44质粒冲击DC后与CIK 细胞联合培养使DC-CIK对乳腺癌干细胞的体外杀伤效果增强。3. 根据权利要求2所述的CD44质粒的应用，其特征在于：所述CD44质粒的序列为序 列表〈400>1所不序列。
【专利摘要】本发明提供了CD44质粒的新用途，所述CD44质粒可有效用于增强DC-CIK对乳腺癌干细胞的体外杀伤作用。
【IPC分类】C12N5/0784, C12N5/0783, A61P35/00, C12N15/85
【公开号】CN104962518
【申请号】CN201510426392
【发明人】孙雯雯
【申请人】天津市第四中心医院
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年7月20日