自组装间充质干细胞团块的制备、诱导分化及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种自组装间充质干细胞团块的制备方法，向软骨细胞分化的方法，及其在关节软骨缺损修复中的应用。
【背景技术】
[0002]自体软骨细胞移植(AutologousChondrocytes Implantat1n，ACI)是目前治疗较大面积软骨缺损最先进的方法，是将患者自体软骨细胞在体外进行扩增，再与支架材料复合后进行三维培养，最后将“细胞一材料”复合物移植到软骨缺损部位。然而，软骨细胞是一种数量很少的终末分化细胞，传代培养困难且容易失去软骨表型。软骨细胞数量少、难增殖、去分化的缺点限制了自体软骨细胞移植技术在临床的应用。
[0003]间充质干细胞是一种来源于发育早期中胚层和外胚层的多潜能干细胞，存在于脂肪、骨髓、滑膜、脐带血等多种组织中。间充质干细胞具有在体外培养条件下快速增殖的能力，并且能在特定的条件下向软骨细胞分化。因此，间充质干细胞是关节软骨缺损修复中极具前景的细胞来源。
[0004]研宄发现，适当的生长因子组合和高密度三维动态培养是间充质干细胞向软骨细胞分化的关键因素。专利公布号为103223194A的中国专利公开了一种用于软骨损伤修复的软骨移植物及其制备方法，将脂肪间充质干细胞和软骨细胞植入I型胶原的三维基材中进行共培养，使脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化以弥补软骨细胞的不足。专利公布号为103966161A的中国专利公开了一种模拟体内微环境的干细胞培养体系，用琼脂糖构建三维支架材料，模拟体内微环境动态培养干细胞，使干细胞维持自我更新、增殖和定向分化。专利公布号为102858381A的专利公开了一种细胞三维构建体及制备方法，以及用于组织修复，该发明使用生物相容性良好的天然或非天然聚合物包裹干细胞，形成细胞三维构建体。
[0005]上述专利将间充质干细胞包裹在支架材料中进行三维培养，支架材料的组织相容性和降解产物会对细胞活性产生影响。同时，支架材料的孔径和孔隙率应当与细胞相匹配，否则会影响细胞的生长和外界营养物质交换。在使用培养后的间充质干细胞时，若直接以三维构建体进行移植，支架材料降解后形成的空隙则难以填补；若将间充质干细胞从支架材料中释放，则会对间充质细胞造成损伤。
[0006]专利号为ZL201210410047.6的中国专利公开了一种诱导间充质干细胞成为无支架软骨的制备方法，将间充质干细胞高密度接种在15 ml离心管中，离心后静置培养形成细胞团块。但是，离心形成的细胞团块，其中心部位的细胞结合紧密，不利于营养交换，细胞容易发生坏死。此外，成软骨细胞诱导液的刺激方法单一，造成间充质干细胞的分化能力弱，形成的软骨细胞表型不稳定。
【发明内容】
[0007]本发明针对间充质干细胞包裹支架材料进行三维培养，三维构建体移植以及向软骨细胞分化效果不理想的技术问题，提供了一种自组装间充质干细胞团块的制备方法以及诱导间充质干细胞团块向软骨细胞分化的方法。本发明还给出了其在关节软骨缺损修复中的应用。本发明无需使用支架材料以实现间充质干细胞的高密度三维动态培养。
[0008]为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案:
一种自组装间充质干细胞团块，可通过下述方法制备:
步骤一，多孔培养板的包被
在无菌条件下，使用水凝胶包被多孔培养板；
步骤二，间充质干细胞的扩增培养
将间充质干细胞接种在包被后的培养板中，将间充质干细胞扩增培养至第三代；
步骤三，自组装间充质干细胞团块的形成
取步骤二培养的第三代间充质干细胞，用团块形成诱导液配制成间充质干细胞悬液，向步骤一包被的多孔培养板的每一孔中加入100?250 μ I间充质干细胞悬液，使每一孔中细胞数量为I X 15?I X 10 6个，每天换团块形成诱导液一次，将多孔培养板置于细胞培养箱中培养4?7天后，形成直径为500?600 μπι的间充质干细胞团块。
[0009]优选地，上述步骤一包被多孔培养板的方法为:在无菌条件下，向孔直径为6?7mm、孔深度为10?12mm、底部为U型的多孔培养板的每一孔中加入30?60 μ I水凝胶，待凝胶凝固后，形成包被的多孔培养板。
[0010]所述水凝胶可以选用琼脂糖凝胶、海藻酸钠凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、PLGA凝胶中的任一种。PLGA凝胶即聚乳酸-轻基乙酸共聚物(poly (lactic-co-glycolic acid)，PLGA)。为避免水凝胶在包被前凝固，应该根据所选水凝胶凝固特征的不同，选择适宜的操作时机。本发明最优选的水凝胶是琼脂糖凝胶，使用浓度为1%?2% (W/V)。
[0011]上述步骤三所使用的团块形成诱导液由高糖DMEM、胎牛血清、维生素C和TGF- β 3组成，其中，胎牛血清的的体积分数为10%?15%，维生素C的浓度为10?100 mg/ml, TGF-β 3的浓度为10?50 ng/ml。TGF-β 3是一种转化生长因子，属于调节细胞生长和分化的TGF-β超家族。
[0012]上述步骤二所述间充质干细胞包括各种来源的间充质干细胞，可以选自骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、脐带血间充质干细胞中的任一种。间充质干细胞的扩增的培养以及使用的培养基可以参考已有技术。优选地，所使用的间充质干细胞优选为骨髓间充质干细胞。
[0013]另一方面，本发明还给出了诱导所述自组装间充质干细胞团块向软骨细胞的分化方法。
[0014]根据本发明优选的实施例，诱导分化自组装间充质干细胞团块的方法为:将间充质干细胞团块置于50 ml离心管中，加入成软骨细胞诱导液10?25 ml，密封离心管管口并横置于恒温气浴摇床中以75 r/min震荡培养，每天换成软骨细胞诱导液一次，连续诱导15天后收集细胞团块。
[0015]为了确认间充质干细胞团块分化为软骨细胞，可以使用免疫组织化学染色、蛋白含量检测、分子生物学检测等已有方法确定。
[0016]优选地，诱导间充质干细胞团块分化所使用的成软骨细胞诱导液由高糖DMEMJS牛血清、胰岛素、TGF-β 3、地塞米松、维生素C、IL-1 β、转铁蛋白和ΒΜΡ-6组成。其中，胎牛血清的的体积分数为10%?15%，胰岛素的浓度为I?10 μ g/ml，TGF-β 3的浓度为10?50 ng/ml，地塞米松的浓度为10?150 nmol/L，维生素C的浓度为20?70 mg/ml, IL-1 β的浓度为I?6ng/ml，转铁蛋白的浓度为4?8 mg/ml,BMP-6的浓度为300?500 ng/ml。IL-1 β是一种白细胞介素类细胞因子。ΒΜΡ-6是一种股形态发生蛋白。
[0017]还有，本发明还给出了自组装间充质干细胞团块在关节软骨缺损修复中的应用。
[0018]与现有技术相比，本发明的有益效果或优点:
(I)通过诱导，使间充质干细胞自组装形成三维细胞团块，无需使用支架材料，增加了细胞间的通讯和相互作用，有利于间充质干细胞向软骨细胞分化。
[0019](2)自组装形成的间充质干细胞团块紧密程度适中，处于中心部位的细胞可以顺利的与外界进行营养交换，不易发生凋亡和坏死，团块各个位置的间充质干细胞的分化程度更加均一。
[0020](3)恒温震荡培养实现了对间充质干细胞的力学刺激和低氧分压环境诱导，增加了间充质干细胞向软骨细胞分化的能力和表型维持能力。
[0021](4)所形成的间充质干细胞团块可以直接用于软骨缺损的移植，操作简单，间充质干细胞团块间可以在修复过程中通过持续分泌细胞外基质形成连接，填补团块间的缝隙，形成完整的修复组织。
【附图说明】
[0022]图1，实施例1扩增培养中的骨髓间充质干细胞。
[0023]图2，实施例1自组装形成的骨髓间充质干细胞团块。其中，图2Α所示为骨髓间充质干细胞在多孔培养板中自组装形成的细胞团块；图2Β所示为显微镜下骨髓间充质干细胞团块，其直径约为500?600 μ m。
[0024]图3，成软骨细胞诱导后的细胞团块。其中，图3A所示为成软骨细胞诱导后的细胞团块，可见团块被持续向外分泌的细胞外基质包围；图3B所示为成软骨细胞诱导后的细胞团块甲苯胺蓝染色结果，可见细胞团块中骨髓间充质干细胞分化均匀，团块中心没有坏死发生。
[0025]图4，实施例3成软骨细胞诱导后的细胞团块修复兔关节软骨缺损。其中，图4A所示为兔关节软骨缺损修复后大体图，结果显示，修复后缺损部位与周围软骨组织整合良好；图4B显示兔关节软骨缺损修复后HE染色结果，结果显示关节软骨缺损区域平整、光滑，团块间无空隙存在。
[0026]图5，实施例4成软骨细胞诱导后的细胞团块修复羊关节软骨缺损。其中，图5A所示为羊关节软骨缺损修复后效果，可见修复组织表面平整、光滑，与周围组织整合良好；图5B所示为羊关节缺损修复后HE染色结果，显示修复区域有新生软骨形成。
【具体实施方式】
[0027]实施例1，诱导骨髓间充质干细胞分化成软骨细胞步骤一、多孔细胞培养板的包被
称取琼脂糖粉末2 g，置于三角瓶中，向其中加入100 ml无菌去离子水，充分搅拌形成浓度为2 % (W/V)的琼脂糖溶液。将该三角瓶放置于微波炉中加热至沸腾，取出后于无菌条件下静置，待冷却至45°C时向孔径6.35 mm，深度10.03 mm的多孔培养板的每一孔中加Λ 50 μ I琼脂糖凝胶，静置待琼脂糖凝固后备用。
[0028]步骤二、骨髓间充质干细胞的分离和培养
取4?5月龄新西兰白兔，用1%戊巴比妥钠以3.5ml/Kg的计量耳缘静脉注射麻醉，于兔股骨处备皮。沿兔股骨上方表皮切开Icm切口，暴露股骨表面。取20ml注射器一只，吸取Iml肝素钠注射液，从股骨表面穿刺至骨髓腔中，不断变换角度吸取骨髓血10?15ml。
[0029]在一无菌50ml离心管中，加入4ml Ficoll人淋巴细胞分离液，将骨髓血沿离心管管壁缓慢加入上部分离液，于2000 r/min离心20 min后取出，缓慢吸取从上数第二层液体，置于一新50ml离心管中；加入PBS混勾后于800 r/min离心5 min，重复离心两次，弃掉上清液后加含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基3?4 ml，吹匀细胞，接种于培养瓶中，37°C恒温5% C02孵箱培养。
[0030]待细胞生长至底面积80%以上时，将细胞用0.25%胰蛋白酶进行消化，分散成单细胞，接种于新的培养瓶内，首次传代。规律换液，4?6天传代一次，培养至第三代。扩增培养中的骨髓间充质干细胞见图1。
[0031]步骤三、骨髓间充质干细胞团块的形成
使用胰蛋白酶消化获得上述第三代骨髓间充质干细胞