人骨骼肌中的褐色脂肪细胞祖细胞的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请号为200980129427. 9的中国专利申请的分案申请，原申请是2009 年05月27日提交的PCT国际申请PCT/US2009/003217于2011年1月26日进入中国国家 阶段的申请。
[0002] 本申请要求美国临时专利申请60/071，916的优先权，所述申请的内容通过引用 全文并入本文。
技术领域
[0003] 本公开内容涉及褐色脂肪组织、祖细胞、细胞分化和褐色脂肪组织解偶联蛋 白1。本公开内容还涉及代谢疾病，如肥胖症、2型糖尿病、胰岛素抗性和异常脂肪血症 (dyslipidemia)〇
【背景技术】
[0004] 肥胖症的流行与糖尿病、高血压、冠心病、癌症和其它疾病的流行紧密相关。白 色脂肪组织的作用是储存脂质，而且其与肥胖症相关。褐色脂肪组织（"brownadipose tissUe，BAT"）的作用实际上相反。其专门氧化脂质并以热量消耗能量。事实上，褐色脂肪 细胞含有很多线粒体（其中进行细胞氧化）并独有地表达BAT解偶联蛋白1("uncoupling protein-l，UCPl")。UCP1作为氧化磷酸化的解偶联剂起作用，导致能量以热量损耗。交感 神经系统刺激线粒体发生以及UCP1的表达和活性。在啮齿动物中，BAT相关的热产生在暴 露在低温时提高（例如，防止体温过低），或为由于过度进食而提高，燃烧过量摄取的脂肪 并防止体重增加。通过调节对体重增加的敏感性和消耗大量葡萄糖，BAT也提高胰岛素敏 感性。因此其在保持体温、能量平衡和葡萄糖代谢中有重要作用。
[0005] 转基因动物的实验证实了BAT潜在的抗肥胖症特性。例如，已报导BAT的遗传删 除可导致肥胖症，而据报道BAT量和/或功能（和/或UCP1表达）的遗传提高可导致瘦且 健康的表型。尤其地，与对照小鼠相比，BAT量更高的小鼠增加的体重更少而且对胰岛素更 敏感。最近，在小鼠肌肉中证实了BAT的异位贮存，认为其为防止体重增加和代谢综合征提 供了遗传机制。
[0006] 尽管已报道UCP1在啮齿动物中有控制能量平衡的作用，并且表达UCP1的BAT在 人新生儿中存在，但在长久以来都认为在成人中没有生理相关的UCP1表达。事实上，人们 认为表达BAT的UCP1在生命早期消失，并认为成人中没有BAT。
【发明内容】
[0007] 本申请人在多种组织中鉴定出了可分化为褐色脂肪细胞之细胞的存在。在一个方 面中，申请人在骨骼肌中鉴定了这种细胞群，申请人称其为BAT祖细胞。本公开内容提供了 从多种组织中分选细胞以鉴定和分离BAT祖细胞的方法。在一些实施方案中，从人骨骼肌 中分离BAT祖细胞。本公开内容提供了在体外和体内将BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞的 方法。在一些实施方案中，可在人受试者体内使BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞。
[0008] 在一些实施方案中，本公开内容的BAT祖细胞可在培养物中扩增。在另一个实 施方案中，可通过药剂提高已分化BAT祖细胞中UCPlmRNA的表达，所述药剂如细胞通透 性cAMP衍生物、过氧化物酶体增殖剂激活受体（peroxisome-proliferator-acticated rec印tor，PPARY)激动剂等。在一些实施方案中，已分化为褐色脂肪细胞的BAT祖细胞可 包含大量的线粒体转录因子A(mtTFA)和PPARy共激活子-1a(PGC-1a)，这两者都参与对 线粒体发生以及线粒体标志物细胞色素氧化酶IV(COXIV)的控制。分化的BAT祖细胞可 显示一个或多个以下特征：高水平的UCP1表达、高水平的解偶联呼吸作用、高代谢率。申请 人提供了可通过使氧化磷酸化解偶联而代谢葡萄糖、氧化脂肪酸以及作为热量消耗能量的 已分化细胞。
[0009] 本公开内容提供了在成人骨骼肌中检测UCPlmRNA的方法，以及在体内提高其表 达的方法。关于成人UCP1表达的现有研宄集中在白色脂肪组织中，但申请人公开了在人骨 骼肌中褐色脂肪祖细胞的存在及其分离，该细胞有表达UCP1的极大潜能。在一些实施方案 中，这种BAT祖细胞库可用于调节能量消耗和用于治疗肥胖症、糖尿病和代谢疾病。
[0010] 在一些方面中，本公开内容提供了在人骨骼肌中鉴定BAT祖细胞的方法，以及从 人骨骼肌样品中分离这些细胞的方法。还提供了在体外、体内或两者皆有的情况下促进这 些祖细胞分化为褐色脂肪细胞的条件和药剂（例如化合物、蛋白质、生物制品等）。提供了 使用这些条件和药剂治疗代谢疾病（如肥胖症、2型糖尿病、胰岛素抗性、异常脂肪血症等） 的方法。
[0011] 本公开内容提供了允许鉴定药剂（例如化合物、蛋白质、生物制品等）的测定方 法，所述药剂诱导UCP1基因表达、促使BAT祖细胞在体外分化为褐色脂肪细胞、促使BAT祖 细胞在体内分化为褐色脂肪细胞，或以上活性的组合。根据一些实施方案，用该方式鉴定的 药剂可用于治疗代谢疾病，例如肥胖症、2型糖尿病、胰岛素抗性、异常脂肪血症等。
[0012] 本文给出了本公开内容的这些特征和其它特征。
【附图说明】
[0013] 图1A显示了人胎儿肌肉中血管细胞的免疫组织化学描述。图1B显示了人胎儿 肌肉中血管细胞的FACS分析和分选。图1C显示了⑶34+/⑶146-/⑶45-/⑶56-(⑶34)、 CD34-/CD146+/CD45-/CD56-(CD146)以及未分选的总细胞的RT-PCR分析。图1A的比例尺 为 50yM。
[0014] 图2A显示了原代培养物（PC)的CD34+细胞。图2B和图2C显示了原代培养物 (PC)的⑶146+细胞。图2D显示了扩增多至3代（P3)的⑶34+细胞。图2E显示了原代 培养或扩增3代（P3)的⑶34+细胞中UCP1 (空心柱）和瘦素（灰色柱）mRNA表达的定量 RT-PCR测定。图2F显示了组织或全细胞提取物中UCP1和磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH)蛋白 的代表性蛋白印迹分析。图2A、B、C:相差图；比例尺：50yM。
[0015] 图3A显示了分离的胎儿肌肉CD34+细胞以及原代培养且刚进行胰酶消化的成人 白色脂肪细胞中的解偶联呼吸作用。图3B显示了cAMP衍生物在原代培养（PC)和扩增多至 3代的（P3)的⑶34+细胞中对UCP1mRNA表达的作用。图3C显示了lyM罗格列酮（Rosi) 对⑶34+PC或P3细胞中UCP1表达的作用。
[0016] 图4A显示了成人肌肉细胞在脂肪形成培养条件下的表征。图4B显示了UCP1 (空 心柱）和瘦素（灰色柱）mRNA表达的定量PCR测定。图4C显示了成人WAT细胞在脂肪形 成培养条件下的表征。图4A、C:相差图；比例尺：50yM。
[0017] 图5显示了罗格列酮对人骨骼肌中UCP1 mRNA表达的作用。
【具体实施方式】
[0018] 本公开内容提供了用于在多种组织中鉴定和分离BAT祖细胞的方法，在一些实施 方案中，其包括鉴定人骨骼肌中的普通褐色脂肪细胞祖细胞，并从人骨骼肌样品中分离该 细胞。在一些实施方案中，可通过对细胞表面标记的免疫组织化学分析来对细胞进行分选， 如分化/命名抗原簇（"⑶"）分子⑶34、⑶45、⑶56和⑶146。造血细胞和成肌祖细胞 (myogenicprogenitor)可分别基于其细胞表面的⑶45和0)56的鉴定来分选。0)34和 ⑶146可分别用于鉴定内皮细胞和周细胞。在一个方面中，⑶34的表达标志着细胞是褐色 脂肪细胞的祖细胞。
[0019] 流式细胞术、荧光激活细胞分选（"FACS"）和其它本领域已知的细胞分选技术可 用于分选从多种组织中获得的细胞，并用于将BAT细胞与其它细胞分开。包括其它本领域 已知的技术，多色FACS可用于鉴定⑶34+内皮细胞和⑶146+周细胞，并将它们彼此分开， 并与CD45+造血祖细胞和CD56+的成肌祖细胞分开。逆转录酶聚合酶链式反应（"RT-PCR"） 分析可用于证实在⑶34+和⑶146+细胞类群中无造血祖细胞和成肌祖细胞。
[0020] 申请人发现在骨骼肌中存在祖细胞类群，并且在一些实施方案中，该类群可见于 骨骼肌中，而不可见于白色脂肪组织中，并且在一些实施方案中，其只可见于骨骼肌中（即 不可见于其它组织中）。骨骼肌可为人或任何动物的骨骼肌，并且祖细胞类群可散布在骨骼 肌中或集中在离散的区域中。在一些实施方案中，BAT祖细胞可见于肌纤维之间。骨骼肌 BAT祖细胞可为固定不动的类群，或可在骨骼肌或其它组织中以及不同组织之间移动。此 外，BAT祖细胞可见于胎儿、幼龄和成体骨骼肌中。
[0021] 本教导内容提供了分离自多种组织的BAT祖细胞。例如，提供了分离自人骨骼肌 的BAT祖细胞。在一些实施方案中，BAT祖细胞可见于骨骼肌中，而不可见于白色脂肪组织 中，和/或仅可见于骨骼肌中。一些BAT祖细胞可表达UCP1、线粒体转录因子A(mtTFA)和 /或PPARy共激活子1a(PGC-1a)，以及一种或多种相应的mRNA。本公开内容提供了在成 人骨骼肌中检测BAT祖细胞和/或UCPlmRNA的方法。关于成人UCP1表达的现有研宄着眼 于白色脂肪组织，而申请人公开了褐色脂肪祖细胞在人骨骼肌中的存在和分离，其有表达 UCP1的高潜能。在一些实施方案中，BAT祖细胞在骨骼肌中的贮存可提供调节能量消耗以 用于治疗代谢性疾病（如肥胖症、糖尿病等）的机制。
[0022] 至少，在骨骼肌中存在的一部分祖细胞类群能够分化为真正的褐色脂肪细胞，并 且在一些实施方案中，在骨骼肌中存在的一部分祖细胞类群能够在体外分化为真正的褐色 脂肪细胞。本公开内容提供了扩增BAT祖细胞培养物的方法，以及将BAT祖细胞分化为真 正的BAT细胞的方法，其包括在脂肪形成培养基中分化之前分选之细胞的方法。在一些实 施方案中，可通过使用维持白色脂肪细胞分化的条件或者通过使用已确定可促进祖细胞分 化为褐色脂肪细胞的药剂，而将分选的祖细胞分化为褐色脂肪细胞。
[0023] -些实施方案利用了UCP1、线粒体转录因子A(mtTFA)，和/或PPARy共激活 子-1 a (PGC-1 a)及一种或多种相应的mRNA，来鉴定已开始至少部分分化的BAT祖细胞。 可使用以下来鉴定已开始至少部分分化的BAT祖细胞：高代谢率或高水平的解偶联呼吸作 用、葡萄糖利用、脂肪酸氧化或上述特征彼此的组合或与其他特征的组合。就本公开内容而 言，已开始至少部分分化成褐色脂肪细胞的BAT祖细胞被称为"已分化褐色脂肪细胞"。
[0024] 作为一个实例，已确定为表达⑶34标记的细胞（即⑶34+细胞）可在通过在以下 培养基中培养而分化为褐色脂肪细胞，所述培养基为含〇. 86yM胰岛素、10yg/ml转铁蛋 白、0. 2nM三碘甲腺原氨酸、1yM罗格列酮、lOOyM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1yM地塞米 松和1 %青霉素-链霉素的DMEM-Ham'sF-12培养基。还可用其它药剂促进祖细胞分化 为褐色脂肪细胞。在一些实施方案中，可使用根据本公开内容的教导而鉴定的药剂促进祖 细胞分化为褐色脂肪细胞。在一些实施方案中，已分化褐色脂肪细胞表现出高水平的UCP1 表达、高水平的解偶联呼吸作用和/或高代谢率。
[0025] 本公开内容提供了在BAT祖细胞、已分化褐色脂肪细胞或这两者中提高UCPlmRNA 表达的方法。例如，诸如细胞透过性cAMP衍生物和过氧化物酶体增殖剂激活受体 Y(PPARy)激动剂的药剂可用于提高BAT祖细胞、已分化褐色脂肪细胞或上述两者中 UCPlmRNA表达。UCP1表达的提高可通过本领域已知的方法确定，包括通过定量RT-PCR测 定UCPlmRNA。用于UCPlmRNA的RT-PCR分析的示例性引物在SEQIDN0S: 1-4和11-12中 提供。
[0026] 与不接触脂肪形成培养基的BAT祖细胞相比，接触脂肪形成培养基的BAT祖细胞 可含有更高水平的UCPlmRNA。亲环素的mRNA水平可作为评价细胞中UCPlmRNA丰度的归一 化数值（反映细胞数或RNA总量）。在一些实施方案中，不接触脂肪形成培养基的BAT祖细 胞中的UCPlmRNA水平无法用RT-PCR检测到，而已分化褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA水平则 可以检测到，并可根据亲环素mRNA的水平进行归一化。作为UCP1表达的比较测量，已分化 褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA水平可与培养的小鼠褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA水平相当。 本公开内容提供的已分化褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA水平约为培养的小鼠褐色脂肪细胞 中UCPlmRNA水平的25%。而在另一些实施方案中，UCPlmRNA水平约为培养的小鼠褐色脂 肪细胞中UCPlmRNA水平的25± 10%，或约15%至约30%。本公开内容所涉及的已分化褐 色脂肪细胞中的UCPlmRNA水平为培养的小鼠褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA水平的约5%至 约100%。在一些实施方案中，UCPlmRNA水平可超过培养的小鼠褐色脂肪细胞中UCPlmRNA 水平的100%。
[0027] 与同一物种或同一成体个体的骨骼肌活检中的细胞相比，已分化褐色脂肪细胞可 含显著更高水平的UCPlmRNA。此外，已分化褐色脂肪组织中UCP1蛋白的量可与同一物种或 同一胎儿个体的BAT中UCP1蛋白的量大致相同。本公开内容所涉及的人已分化褐色脂肪 细胞的UCPlmRNA水平与人体内褐色脂肪细胞的UCPlmRNA水平大致相同。在一些实施方案 中，人已分化褐色脂肪细胞的UCPlmRNA水平可为人体内褐色脂肪细胞的UCPlmRNA水平的 约1 %到高于后者很多倍。
[0028] 本公开内容提供了用于提高BAT祖细胞、已分化褐色脂肪细胞或上述两者中的 UCPlmRNA的方法。在一些实施方案中，提供了用于选择性提高BAT祖细胞、已分化褐色脂 肪细胞或上述两者中的UCPlmRNA的方法。PPARy激动剂可在骨骼肌和已分化褐色脂肪细 胞中刺激UCPlmRNA的生成。例如，在一些实施方案中，PPARy激动剂罗格列酮在骨骼肌或 已分化褐色脂肪细胞中刺激UCPlmRNA的生成。细胞透过性cAMP衍生物可在骨骼肌和已分 化褐色脂肪细胞中刺激UCPlmRNA的生成。例如，在一些实施方案中，细胞透过性cAMP衍生 物8-溴代-cAMP在骨骼肌或已分化褐色脂肪细胞中选择性刺激UCPlmRNA的生成，而在另 一些实施方案中，cAMP衍生物（4-氯代苯基硫）-cAMP在骨骼肌或已分化褐色脂肪细胞中 选择性刺激UCPlmRNA的生成。
[0029] 线粒体转录因子A(mtTFA)和过氧化物酶体增殖剂激活受体Y共激活剂 la( "PGC-la"）参与了线粒体发生的控制。已分化褐色脂肪细胞与未分化的BAT祖细胞 相比，可含有大量的mtTFA、PGC-1a或上述两者。本公开内容提供了与未分化的BAT祖细 胞相比，含更高水平的mtTFAmRNA、PGC-lamRNA或上述两者的已分化褐色脂肪细胞。线粒 体标志物细胞色素氧化酶IV(COXIV)参与了线粒体的呼吸链。本公开内容提供了与未分 化的BAT祖细胞相比，含显著提高水平的COXIVmRNA的已分化褐色脂肪细胞。
[0030] 根据一些实施方案，已分化褐色脂肪细胞有高水平的解偶联呼吸作用和/或高代 谢率。当质子通过线粒体内膜泄露，而不是通过三磷酸腺苷合酶（"ATP合酶"）驱动三磷 酸腺苷（"ATP"）的合成时，发生解偶联呼吸作用。质子在电化学质子梯度下的跨膜运动所 释放的能量作为热量消耗，而不是消耗在生成ATP的过程中。解偶联呼吸作用可作为不依 赖于ATP形成（通过ATP合酶）而发生的细胞呼吸作用（例如，氧消耗）的比例的函数来 衡量。例如，在寡霉素（阻断ATP合酶的功能）存在下氧化磷酸化电子转移链中的氧消耗 为解偶联呼吸作用提供了一种度量。
[0031] 本公开内容提供了与未分化的BAT祖细胞相比，解偶联呼吸作用水平显著升高的 已分化褐色脂肪细胞。在一些实施方案中，本公开内容提供了解偶联呼吸作用水平为总呼 吸作用的约50%的未分化褐色细胞。一些实施方案显示的解偶联呼吸作用水平为总呼吸作 用的约20%至约50%。以成体白色脂肪细胞中解偶联呼吸作用的水平作为比较标准，一些 实施方案显示的解偶联呼吸作用为成体白色脂肪细胞的约1. 5至约3. 5倍。在一些实施方 案中，解偶联呼吸作用水平为成体白色脂肪细胞的约2. 5倍。本公开内容还提供了可通过 氧化磷酸化的解偶联进行葡