腺或肺细胞中不表达UCPlmRNA，然而，在肝 细胞中检测到少量表达，为胎儿肌肉CD34+细胞中检测到的2% (结果未显示）。
[0060] 从4个成人（50-78岁）骨骼肌样品中分选并在脂肪生成条件下原代（PC)培养的 CD34+细胞也分化为多室细胞。在这些细胞中散布有其它类型的细胞，其中一些含有小脂滴 (图4(A))。UCPlmRNA的水平（370±132主观单位）为在原代培养的胎儿肌肉⑶34+细胞 的21%。与之相反，瘦素表达（75±69主观单位）为胎儿细胞中的7. 6倍。图4(B)显示了 UCP1 (空心柱）和瘦素（灰色柱）mRNA表达的定量PCR测定。所有细胞在EGM2培养基中 培养4-6天，而后置于材料和方法部分所述的脂肪生长培养基中培养8-12天。结果表示为 用对应的亲环素A值（n= 4-5)归一化的主观值的平均值土标准误。从4个成人（45-55 岁）WAT样品中分选的CD34+细胞也在脂肪生成条件下进行原代（PC)培养。它们部分地成 为多室细胞（图4 (C))，但是不表达UCPlmRNA。
[0061] 实施例7 :检测人肌肉中UCPlmRNA的表达和罗格列酮的体内作用
[0062] 成人骨骼肌的褐色脂肪细胞祖细胞可在体内分化并产生表达UCP1的细胞。使用 高灵敏度RT-PCR技术检测到成人骨骼肌中UCPlmRNA的存在，事实上，在10名清瘦个体的 腹直肌中检测到了低水平的UCPlmRNA(UCP1/亲环素A比例：24±9)。对PCR扩增的片段进 行测序，发现与人UCP1有100 %的同一性。成人肌肉中UCPlmRNA水平比培养的胎儿肌肉 ⑶34+细胞中的低75倍。
[0063] 因为在培养的肌肉CD34+细胞中PPARy激动剂罗格列酮为UCPlmRNA的强诱导 物，因此对该化合物在体内对人的作用进行了研宄。使用7位患2型糖尿病的肥胖症患者 的股外肌活检样品，所述患者用罗格列酮治疗他们的代谢综合征。在治疗前和用罗格列酮 治疗8周（每天2X4mg)后取得活检样品。罗格列酮的治疗使患者的胰岛素抗性和糖尿病 显著改善。在该研宄中，罗格列酮在提高胰岛素敏感性的同时，将UCP1的表达水平提高为 约1. 6倍。图5显示了 UCPlmRNA表达的定量RT-PCR测定。结果为用对应的亲环素A值归 一化的主观值的平均值土标准误（n= 7,与对照比*p< 0. 05)。因为所用的RT-PCR条 件不同，所以该图中的主观值不能与图2-4中的直接比较。
[0064] 在图5中显示了患者组（n= 7)中骨骼肌活检样品的UCPlmRNA水平，"对照"指 治疗前的水平，"Rosi"指用罗格列酮治疗（8周）后的水平。作为纵向研宄，测定了每个个 体中罗格列酮对UCP1水平的作用（比较"对照"前和"Rosi"后状态的个体值的比较）。用 (通过RNA的逆转录产生的）25ngcDNA起始反应，实时PCR中的检测阈值（Ct)UCPl为22， 亲环素为18。罗格列酮的作用（治疗结束时的UCP1水平与治疗前对比）如下：
[0065] 患者1 :提高50% (至150%，对照=437,Rosi= 652主观单位）
[0066] 患者2 :无变化（至100%，对照=444, Rosi=453主观单位）
[0067] 患者3 :提高80% (至180%，对照=378,Rosi= 677主观单位）
[0068] 患者4 :提高180% (至280%，对照=260,Rosi= 730主观单位）
[0069] 患者5 :提高8% (至108%，对照=553,Rosi= 600主观单位）
[0070] 患者6 :提高310%(至410%，对照=135, Rosi=556主观单位）
[0071] 患者7 :提高10% (至110%，对照=128,Rosi= 142主观单位）
[0072] 在7名患者中的4名中观察到了罗格列酮的强作用，为1.5-4. 1倍不等。该结果 提示，罗格列酮在患者骨骼肌中诱导褐色脂肪细胞的出现和/或增强已有褐色脂肪细胞中 UCP1基因的表达。PPARy激动剂的这种作用可在以该药剂为胰岛素增敏剂的治疗作用中 发挥重要作用。
[0073] 实施例8 :筛选人UCP1启动子/增强子区的潜在调节剂
[0074] 经鉴定和分离的⑶34+细胞可作为工具用于鉴定诱导这些细胞分化为褐色脂肪 细胞或调节UCP1表达的药剂（化合物、蛋白、生物制品等）。
[0075] 为了达到该目的，将人UCP1基因转录起始位点DNA上游（5'端）的大区域（6kb) (含有启动子/增强子区）克隆到报告子/MARGFP(绿色荧光蛋白）或萤光素酶中。用该 构建体转染CD34+细胞，将细胞培养在多孔板中，并筛选可增强细胞荧光（GFP)或发光（萤 光素酶）（这可反映出基因的表达（并因此反映提高UCP1的表达）的药剂。这可使得能 够鉴定出增强CD34+细胞分化为褐色脂肪细胞和/或通过以下方式增强UCP1表达的药剂， 所述方式包括：增强UCP1基因的转录和/或增强UCP1转录本的翻译，和/或稳定UCP1转 录本或蛋白。
[0076] 例如，可用PPARy调节剂或激活剂（如罗格列酮）来促进CD34+细胞分化为褐色 脂肪细胞（图3 (C)和5)。另一个例子是使用cAMP衍生物，如8-溴代-cAMP和/或（4-氯 代苯基硫）_cAMP)(图3(B))，或使用蛋白激酶A(PKA)激活剂或磷酸二酯酶抑制剂。另一个 例子是使用三碘甲腺原氨酸（T3)、其它甲状腺激素、甲状腺激素受体TRa和/或TR0拮抗 剂或调节剂。另一个例子为采用0肾上腺素能激动剂如异丙基肾上腺素（泛激动剂）或 特异性 3_激动剂或调节剂。另一个例子为使用候选受体的调节剂或这些受体 下游信号途径中目标基因的调节剂，所述候选受体通过基因芯片研宄得出。
[0077] 实施例9 :基因芯片研宄
[0078] 进行了基因芯片研宄以鉴定在CD34+祖细胞分化为褐色脂肪细胞中起作用和/或 诱导UCP1表达的分子途径。从人骨骼肌活检样品中分离CD34+细胞，并将它们用于以下两 项研宄中：（1)cAMP研宄：按照在材料中描述的（对照）或再加入载体（对照1样品）或 cAMP(cAMP样品）来分化CD34+细胞；以及（2)罗格列酮研宄：将CD34+细胞按照在材料中 表述的方法进行分化，只是在脂肪生成培养基中不加入罗格列酮（对照2样品）。在本研宄 中，罗格列酮只添加到第二个样品（罗格列酮样品）中。
[0079] 我们发现，这些化合物促使⑶34+细胞分化为褐色脂肪细胞并促进UCP1的表达 (见图 3(B)、（C))。
[0080] 从这些细胞中纯化总RNA，并用Illumina人WG_6BeadChip(Expression Analysis，Inc.，Durham，NC)评估转录谱。用IngenuityPathwayAnalysis7. 0(试用版 本）分析结果。用这些结果来确定参与CD34+细胞分化为褐色脂肪细胞的分子途径，并且 更重要的是，确定哪些分子靶标可用于开发促进褐色脂肪细胞出现和UCP1表达的药剂。
[0081] 该工作显示，以下作用/药剂可促进褐色脂肪细胞的发育：PPARy激活剂、调节剂 或抑制剂（例如罗格列酮），PPARa激活剂或调节剂（例如，GW9578)，PPARS激活剂或调 节剂（例如GW501516或GW0742)，PPARa和PPARS双激活剂或调节剂，泛PPAR(a、S、 Y)激活剂或调节剂（例如，GW4148)，TOE4抑制剂（例如咯利普兰或IBMX)，TOE7抑制剂 (如BMS586353 或BRL50481 或IBMX)，NRIP1 (RIP140)抑制剂、PTEN抑制剂（例如双过 氧化钾（双吡啶）氧钒酸盐或双过氧化二钾（5-羟基吡啶-2-羧基）氧钒酸盐），ai-肾 上腺素能完全或部分激动剂（如苯福林或西拉唑啉），RXRa激活剂或调节剂（例如LGD 1069 (塔革雷汀）或9-顺式视黄酸），PGC-1a激活剂；PGC-1 0抑制剂或激活剂，脂联素或 者脂联素受体AdipoRl和/或Adip〇R2激活剂，N0S抑制剂或激活剂（如2-乙基-2-异硫 脲或NG-硝基-L-精氨酸甲基酯（L-NAME)或腺苷），Rho激酶-ROCK抑制剂（例如，法舒地 尔），BDNF，单胺氧化酶（MAO)A抑制剂和/或MAOB抑制剂（例如，异卡波肼、吗氯贝胺、司 来吉兰），SRC激活剂，EGFR抑制剂（例如，埃罗替尼或ZD1839-吉非替尼或Argos蛋白），FAAH抑制剂（如，URB597)，MAPK1(如，PD98059)或2(如TO98059)或4或5 或7 或8(如， TO98059)的抑制剂，CDK9抑制剂（如，1，5,6,7_四氢-2-(4-吡啶基）-4H-吡咯并[3,2-c] 吡啶-4-酮盐酸盐），TGR5激动剂（如，齐墩果酸），AMPK激活剂（如，AICAR)，BMP-7,mTOR 抑制剂（如，雷帕霉素），腺苷酸环化酶激活剂（例如，毛喉素），或上述任何药剂的组合。
[0082] 材料和方法
[0083] 从 Sigma Chemical Co. (St Louis，MI)和 Gibco BRL(New York，NY)购得所有有 机和无机的分析级或分子生物学级化学品。
[0084] 人组织
[0085] 遵循机构审查委员会方案，从Pittsburgh大学Magee女子医院获得了（在自发、 自愿和治疗性妊娠终止后）的匿名人胎儿组织。通过测量足长度来估计发育阶段（怀孕 16至24周）。对所有情况均获得了患者对使用胎儿组织的知情同意。废弃的成人腹部皮 下WAT (其来自在胃旁路手术一年后进行整形手术的45-55岁患者）由Peter Rubin医生 (Division of Plastic Surgery，Pittsburgh 大学整形外科部）惠赠。从死亡后的 50-78 岁捐献者中获得了用于细胞分选的成人骨骼肌组织。用于第一组RT-PCR研宄的成人骨骼 肌在手术中（束胃带手术、腹股沟疝手术或子宫切除术）从10个清瘦的男性和女性个体的 腹直肌获得。所有受试者均同意在其手术中捐献肌肉样品，而且实验方案已经Deakin大 学的医学伦理审查委员会批准。平均年龄为45±3岁，平均体重指数为22.2±0.8。用于第 二组RT-PCR实验的成人骨骼肌获取自在治疗前和用罗格列酮治疗8周（每天2X4mg)后， 7位患2型糖尿病的男性和女性肥胖症患者的股外肌。平均年龄为63±4岁，并且平均身体 质量指数为29. 9±3. 8。在之前所发表文章中表述了患者的完整临床特点[18]。所有个体 均同意捐献肌肉样品，而且实验方案已经Maastricht大学的医学伦理审查委员会批准。
[0086] 小鼠
[0087] 将动物按照CentreM6dicalUniversitaire(GenSve)机构准则进行处理。将它 们在12小时光周期的房间中单独饲养，温度控制为24°C。允许它们随意食用水和标准实验 室饲料。切下4至6周龄雄性129Sv/ev小鼠的肩胛间BAT，分离其前体细胞并按照之前所 述进行培养[19]。
[0088] 免疫组织化学
[0089] 通过浸入用液氮冷却的异戊烷而逐步冰冻新鲜的胎儿和成体组织。在低温恒温器 (MicromHM505E)上切成5至7ym的切片，用50%丙酮和50%甲醇固定，在室温（RT)下 干燥5分钟，然后在磷酸盐缓冲液中清洗3次，每次5分钟。用5%山羊血清在RT下封闭非 特异结合位点1小时。将切片在4°C下用⑶34小鼠抗人抗体（Ser〇teCh，l: 50)孵育过 夜，然后，在润洗后，用山羊抗小鼠生物素化二抗（DAK0，1 : 1000)在RT孵育1小时，用链 霉亲合素_Cy3 (Sigma，1 : 1000)在RT下孵育30分钟，或用缀合的CD146-Alexa488小 鼠抗人抗体（Chemicon，l: 200)在室温下孵育2小时。在RT下用4'，6_二氨基-2-苯 基吲哚二盐酸盐（MolecularProbes，1 : 2000)对核染色5分钟。每步免疫染色都使用同 种型匹配的阴性对照。
[0090] 流式细胞术
[0091] 用流式细胞术分析胎儿骨骼肌、胰腺、肺和肝及成体肌肉和WAT中的血管细胞。在 含有20%胎牛血清（FBS)、1%青霉素-链霉素（PS)和胶原酶IA-S、II-S和IV-S(lmg/mL) 的高糖Dulbecco优化的Eagle培养基（DMEM)中，将新鲜的胎儿或成人肌肉以及胎儿胰腺、 肺和肝组织用手术刀切碎，而后在持续搅拌下在37°C下孵育75分钟（胎儿组织）或90 分钟（成体组织）。在毛玻璃片之间实现最终的细胞分离。将细胞用磷酸盐缓冲液清洗并 在350g下离心5分钟。将它们重悬在含20%FBS的DMEM中，100ym过滤，用台盼蓝染色， 并在除去死细胞后计数。按照Champigny等的表述[20]通过胶原酶消化制备WAT血管基 质级分。在lml含有20%FBS、1%青霉素-链霉素的DMEM中，在4°C下将细胞（分析使用 1〇5个，分选使用约30. 106个）用以下直接偶联的小鼠抗人抗体之一孵育15分钟：⑶45-APC Cy7(SantaCruzBiotechnologies,1 ； 200),CD56-PECy7(BDPharmigen1 ； 100), CD34-PE(DAK0，1 : 100)和CD146-FITC(Serotec，l: 100)。在清洗和离心后，将细胞与 7_氨基-放线菌素D(7-AAD，BDPharmigen，l: 100)孵育30分钟以去除死细胞，70Om 过滤，并在FACSAria流式细胞仪（BectonDickinson)上进行分析。作为阴性对照，将细胞 的等分试样与缀合有APCCy7(BDPharmigen，1 : 100)、PECy7(BDPharmigen，1 : 100)， ?￡(0^1111(3〇11，1:100)和？11'(：卬5 81〇1(^1〇31，1:100)的同种型匹配的小鼠1§6在相同 条件下孵育。
[0092] 细胞培养
[0093] 以2. 104个/cm2将细胞接种在0.2 %明胶包被的培养板上，37 °C下在EGM2培养 基（CambrexBioScience，Walkersville，MD)上培养直至汇合（4-6 天），并在Rodriguez 等[21]描述的修改的脂肪生成培养基中培养直至分化（再培养8-12天），所述培养 基为含有〇.86yM胰岛素、10yg/ml转铁蛋白、0. 2nM三碘甲腺原氨酸、lyM罗格列酮 (GlaxoSmithKline，ResearchTrianglePark，NC)、100yM3-异丁基-1-甲基黄嗓呤 (IBMX)、1yM地塞米松和1 %青霉素-链霉素的DMEM-Ham'sF-12培养基。为进行细胞扩 增研宄，通过用胰酶-EDTA在37 °C下处理3-5分钟而使仅在EGM2培养基中培养的汇合细胞 脱壁，而后以1 : 3传代，并按照上述培养。按照之前的描述[22]的获得在血氧定量法研 宄中使用的原代培养人白色脂肪细胞。
[0094] RT-PCR
[0095]用试剂盒NucleoSpin?RNAII(Clontech，Palo Alto, CA)或Extract-all溶 液（Eurobio，Courtaboeuf，France)制备细胞总RNA，并用生物光度测定法（生物光度测定 仪，Eppendorf)定量。含oligo-dT的cDNA第一链用Superscript?IIRNaseH逆转录试 剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA)和oligo-dT引物合成，或用HighCapacitycDNA逆转录 试剂盒（AppliedBiosystems，FosterCity，CA)和随机引物合成。使用ABI快速热循环系 统和SYBRGreenPCRmastermix(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)进行定量实时 PCR。用亲环素A作为对照，以补偿因逆转录效率而产生的任何变化。上游和下游寡核苷酸 引物选自内含子的两侧，以防止污染的基因组DNA发生扩增。
[0096] 在人细胞和小鼠褐色脂肪细胞中的实时定量PCR中使用的引物如下：
[0097]人UCP1
[0098]正向引物：5' -CCTCACCGCAGGGAAAG