AA-3'（SEQIDNO:1)
[0099]反向引物：5' -CTAACGACTGGAGGAGTGGCA-3'（SEQIDNO:2)
[0100] 扩增子位置：429-504
[0101]登记号：NM_021833
[0102]小鼠UCP1
[0103]正向引物：5，-CGATGTCCATGTACACCAAGGA-3，（SEQ ID NO :3)
[0104]反向引物：5' -ITGTGGCTTCmTCTGCGA-3' (SEQ ID NO :4)
[0105] 扩增子位置：996-1063
[0106]登记号：NM_009463. 2
[0107] 人痺素
[0108]正向引物：5' -CCAAAACCCTCATCAAGACAAIT-3'（SEQ ID NO :5)
[0109]反向引物：5' -AAGTCACCGGITTGGACTTCA-3(SEQ ID NO :6)
[0110] 扩增子位置：143-238
[0111]登记号：BC069323
[0112] 人亲环素A
[0113]正向引物：5' -CATCTGCACTGCCAAGACTGA-3'（SEQ ID NO :7)
[0114]反向引物：5' -GCAAAGTGAAAGAAGGCATGAA-3'（SEQ ID NO :8)
[0115] 扩增子位置：466-537
[0116]登记号：NM_203431
[0117] 小鼠亲环素A
[0118]正向引物：5，-CAAATGCTGGACCAAACACAA-3，（SEQ ID NO :9)
[0119]反向引物：5' -CCATCCAGCCAITCAGTCTTG-3' （SEQ ID NO :10)
[0120] 扩增子位置：343-412
[0121]登记号：NM_008907
[0122] 用于人骨骼肌的实时定量PCR的引物如下：
[0123] 人UCP1
[0124]正向引物：5，-TCCGGCTCCAGGTCCAA-3，（SEQ ID NO :11)
[0125]反向引物：5' -TGATTGTTCCCAGGACACCTTT-3' （SEQ ID NO :12)
[0126] 扩增子位置：240-311
[0127]登记号：NM_021833
[0128] 人亲环素A
[0129]正向引物：5' -CATCTGCACTGCCAAGACTGA-3'（SEQ ID NO :7)
[0130]反向引物：5' -GCAAAGTGAAAGAAGGCATGAA-3'（SEQ ID NO :8)
[0131] 扩增子位置：466-537
[0132]登记号：NM_203431
[0133] 分析性PCR中所用引物如下：
[0134] CD34
[0135]正向引物：5' -CATCACTGGCTATTTCCTGATG-3' (SEQ ID NO :13)
[0136]反向引物：5，-AGCCGAATGTGTAAAGGACAG-3，（SEQ ID NO :14)
[0137]扩增子位置：1172-1591
[0138]登记号：M81104
[0139] CD56
[0140]正向引物：5'-GTAmGCCTATCCCAGTGCC-3, (SEQ ID NO :15)
[0141]反向引物：5' -CATACTTCTTCACCCACTGCTC-3'(SEQIDNO:16)
[0142] 扩增子位置：542-873
[0143]登记号：BC014205
[0144]CD45
[0145]正向引物：5，-CATGTACTGCTCCTGATAAGAC-3'（SEQIDNO:17)
[0146]反向引物：5' -GCCTACACTTGACATGCATAC-3'（SEQIDNO:18)
[0147] 扩增子位置：940-1579
[0148] 登记号：Y00638
[0149] CD146
[0150]正向引物：5，-AAGGCAACCTCAGCCATGTCG-3，（SEQIDNO:19)
[0151]反向引物：5，-CTCGACTCCACAGTCTGGGAC-3'（SEQIDNO:20)
[0152] 扩增子位置：168-603
[0153]登记号：M28882
[0154] 肌动蛋白
[0155]正向引物：5' -CCTCGCCTTTGCCGATCC-3' （SEQ ID NO :21)
[0156]反向引物：5'-GGAATCCTTCTGACCCATGC-3' （SEQ ID NO :22)
[0157] 扩增子位置：25-229
[0158] 登记号：NM_001101
[0159] 通过以亲环素mRNA水平归一化的靶mRNA水平来确定主观单位（基于Ct)，其中 为了易于进行参照，先将亲环素的水平除以100, 〇〇〇。例如，靶mRNA与亲环素mRNA比值为 0. 01797,则表示为 1797。
[0160] 验证人UCP1扩增子
[0161] 通过T0P0-TA克隆系统（Invitrogen，Carlsbad，CA)将扩增的PCR片段克隆入 pCR2. 1-T0P0 载体，使用QiaprepSpinMiniprep(Qiagen，Hilden，Germany)对颜色选择的 集落进行纯化。在ABI3700自动测序仪（AppliedBiosystems，FosterCity，CA)上，采 用AppliedBiosystemBigDye测序试剂盒，在pCR2.1-T0P0上用M13反向寡核苷酸来测 定序列。
[0162] Western印迹
[0163] 在 200 y 1RIPA缓冲液（150mMNaCl，1%NonidetP-40,0. 5%脱氧胆酸钠，0? 1% SDS，1 : 200 蛋白酶抑制剂混合物（SigmaChemicalCo,StLouis，MI)和 50mMTris/ HC1pH8.0)中，用橡胶刮棒收集培养细胞。将人BAT和骨骼肌细胞在上述RIPA缓冲液 中勾衆。按照Lowry技术[23]测定蛋白含量。按照之前表述的方法[24]进行Western 印迹。使用B.Cannon博士（Stockholm，Sweden)惠赠的兔抗小鼠UCP1多克隆一抗，以 1/500稀释度检测UCP1蛋白。该抗体针对小鼠UCP1的C端十肽，所述十肽与人UCP1有 80 %的同一性，与UCP2和UCP3分别有0和10 %的同一性。用1/5000倍稀释的小鼠抗小 鼠GAPDH单克隆一抗（ChemiconInternational，Inc，Temecula，CA)检测磷酸甘油酸脱 氢酶（GAPDH)蛋白。使用了 1/5000倍稀释的山羊抗兔或抗小鼠的过氧化物酶标记的二抗 (Sigma-Aldrich，St.Louis，M0 或Bi〇-Rad，Hercules，CA)。使用SccBIlIC?Plus2 预染 标准梯度（Invitrogen，Carlsbad，CA)。用标准ECL试剂盒通过化学发光来检测蛋白信号， 并在HyperfilmECL上显影。
[0164] 高分辨率氧消耗测量
[0165] 氧消耗使用装备了Peltier恒温器、克拉克型电极和整合的电磁搅拌机的两压射 室呼吸计（（）r〇h〇r〇S⑨Oxygraph，Oroboros，Innsbruck，Austria)来测量。测量在 2ml DMEMF12、10%新生牛血清中，在37°C且持续搅拌下进行。在这些条件下，血清提供了维持 UCP1解偶联活性所需的脂肪酸。在每个氧消耗测量前，用空气平衡室里的培养基30分钟， 而后用将刚用胰酶消化的细胞转入呼吸计玻璃室中。在观察到稳态呼吸流量后，用寡霉素 (0. 25-0. 5mg/l)抑制ATP合酶，将细胞用解偶联剂羰基氰-3-氯-苯腙滴定到最佳浓度 (l-2uM)。用抗霉素A(lug/ml)抑制呼吸链。用DataGraph软件（Oroborossoftware) 计算氧消耗。
[0166] 基因芯片
[0167] 按照以上的表述制备培养至3代（4周）的胎儿肌肉⑶34+细胞和人肌肉活检样 品的总RNA。由ExpressionAnalysis，Inc. (Durham，NC)进行质量确认检测、制备cRNA革巴 标，以及用IlluminaHumanWG-6BeadChip进行基因芯片分析。用BeadStudio非参量方 法计算检测P值。数据分析
[0168] 数据用平均值土标志物表示。用未配对Studentt检验来评估显著性。用配对 Student'st检验确定罗格列酮对人骨豁肌UCPlmRNA水平的作用。显著性设定为p< 0. 05。
[0169] 克隆人UCP1启动子/增强子区：
[0170] 为了开发我们的筛选策略，按照以下所述进行人UCP1启动子/增强子的亚克隆：
[0171] 从CHORI(Oakland儿童医院研宄所）BAC-PAC资源服务获得含有人UCP1 (解偶联 蛋白1)启动子/增强子区的人BAC(细菌人工染色体）克隆#RP11-5K16(AC108019)。所选 的启动子/增强子区起始于人UCP1基因（登记号：NM_021833)5'UTR(非翻译区）上游-25 位。根据UCP1基因的起始密码子，完整克隆的启动子/增强子序列位于-149位到-6269 位之间。
[0172] 设计引物对扩增以下区域：
[0173] i)完整的靶标启动子/增强子区（6120bp，起始于UCP15'UTR上游-25位），左引 物：
[0174]5'-TCGTAAGCTTAGAGGCGGCGGCTGCAGACGGAGCGCGGTGTT-3'（SEQIDNO:23)
[0175] 右引物：
[0176] 5'-ACGAAGATCTCATTACCCCAAATAGCATCACA-3'（SEQ ID NO :24)
[0177] ii)近端靶标启动子/增强子区（3685bp，起始于UCP15'UTR上游-25位），左引 物：
[0178]5'-TCGTAAGCTTAGAGGCGGCGGCTGCAGACGGAGCGCGGTGTT-3'（SEQIDNO :25)
[0179] 右引物：
[0180] 5' -ACGAACCGGTCAGAAGTGGTGAAGCCAGCCTGC-3'（SEQ ID NO :26)
[0181] iii)远端目的启动子/增强子区（2435bp，近端目的启动子/增强子区域上游），
[0182] 左引物：
[0183] 5' -TCGTACCGGTACAGGCTCTGGGAAGTAGGAGAAAGT-3'（SEQ ID NO :27)
[0184] 右引物：
[0185] 5' -ACGAAGATCTCATTACCCCAAATAGCATCACA-3'（SEQIDNO:28)
[0186] 每个引物均含有限制性位点以便于随后克隆入哺乳动物表达载体中（见下文）。
[0187] 以500ng的BAC#RP11_5K16作为模板，用Takara Ex Taq DNA聚合酶试剂盒 (Clontech)在PCR反应中进行启动子/增强子的克隆。PCR程序按照以下设置：起始步骤， 92°C2分钟，其后是28个循环：变性92°C-30秒/退火：59°C-40秒/延伸：68°C-5分钟 30秒，最后延伸步骤为68°C-8分钟。
[0188] 随后将完整启动子/增强子、近端或远端启动子/增强子依次亚克隆到含有报告 子/MAR元件的载体pl_68_GFP中的Blgll/Hindlll位点，替换SV40启动子盒[25]。或者， 可用基于萤光素酶的pGL3基本载体（Promega)作为另一个报告子类型，用相同的Bglll/ Hindlll位点进行亚克隆。
[0189] 人UCP1启动子序列克隆通过生物技术公司FastensSA，Switzerland用现有技术 测序进行确认。人UCP1启动子序列在提供如下（SEQIDNO. 29):
[0190] 5' -
[0191] CATTACCCCAAATAGCATCACATTCTATCTCTGGATCACCATTTTTACACTTATCTAGAATTTGCCCAC CTGTAGTTTCCACTCTTCGGCACTAATTATTTTGCTTAATTGCGTACAGAACAAATCTACCCCGTCCACTGTCTATG CCTTCAAGTATCTGAGAACAGTAATGTCCTGTTCGGTAAGTCATTTTCTCCTTTTCACTCTCTGGTCCTTCCATGGG GCTTCAATCCCCATACACCTCTTTTTTCTAAATTTCATAGGTCAGTTTTCCTGTCTCTTCTACCAGGTTCTACTGAA GATGAAAAAAAGTGCTTTTTTAAACCAAAAGTATTGCAATGTTTATTTTATCTTTGTAAGTTCCTTAGTAATATATA CAAATCAAGTAAAAGATATATGTTGCATGTGATATTTTAACTTTTGATATGACTTATTGAAAAAATATATAAGGATA CATAGCCATTGTGTGTCTTCAAATCATAGGAAAGTATCATGTCGCGAATGTATTGGGAAGGCAGTTGGGGTATCACG TAGTAGTTGAGAGTTAGGGGGTCAGGCAGATCCTCAGTGTACCATTTACTGGTTCCGTGACCTAGGAGAAGTTATTT AACTTCTCTGAGCCTCTGAGTTTCCTCATCAGTGAAGTGGGAATAACAATAATATATGCCTCCAAAGGCCGCAATGA GGACTAACTGTGTTAAGTT TTGTAAAATGCCTAAAATATTATAGTGTCTGGCACTTGTTCAATGCTATGTATTTGT TAAATACATGACATGAATAAATCTTTCATTGAGTTATGAGGATTAGGTACATCAGGTGCTTAGCATAAAGAGTGATT TATTAATAAGAATAGGCTCATGATGCAGGAATATTCATCACATATGTAAATAATCTGAAGCTCAGAGAAGTTAAGTA ATTTGGCCATGCTTACCCAGTCAGTTATTATCTTAGTGAGAATTTGAACATGGGCCTCCTGGTCTCTTAATCACCAT GCTATACCACTTATATCAGCATAGAAATGGAATATTTTCTCCTTAACGCAGAGTTTGATAGTCTTTGTCTCTTTGTA TTGGGCTGGACTAAGAAAACCCAATCCTGTCCTCTTTCTACTTTTTCTCTGTTCCTAAGAGCACTCCCCTTTCTCT GTTGTATATCAGTTCCTAATGGTAGACACTTGAGCACCACTATTCTGTACAGCTCTCCGACAATCCCACATCTAGA TGCCAAGCTGAGGTTGGCATTCTCACTAATTTGCTGTTATAAATATTAAGCTATCATAAGCGTTAGCCTACATATG ACTCTTTCATATGTTAGTTAATTATTTTAGGGTAGAAATCCAAAAGTGGAGTTACCAGAAGTGGATATAGACATTCT GGCTGGGTGTGATGGTTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCAGAGGCAGGCGGATCACTTGAGGCCAGGAG TTTGAGATCAGCCTGGGCCAACACAGCGAAACCCCATCTCTACTAAAAATTCCAAAACTAGCCAGGCATAGTGGCAC ATGCCTGTACTCCCAGCTACTTGGGAGGC