。使用团块形成诱导液，重悬骨髓间充质干细胞，调整细胞浓度为I X 16个/ml ;吸取细胞悬液加入步骤一制备的多孔培养板中，每孔100 μ 1，置于37°C恒温5% C02孵箱培养，每天换团块形成诱导液一次。培养至第7天时，骨髓间充质干细胞形成直径为550 μπι球形团块，见图2。
[0032]本步骤三所使用的团块形成诱导液由高糖DMEM、胎牛血清、维生素C和TGF-β 3组成，其中，胎牛血清的的体积分数为10%，维生素C的浓度为70mg/ml，TGF-β 3的浓度为10ng/mlο
[0033]步骤四、骨髓间充质干细胞的成软骨细胞诱导
收集步骤三培养的骨髓间充质干细胞团块于50ml离心管中，加入成软骨细胞诱导液25ml，抒紧离心管盖，水平放置于恒温气浴摇床中，于37°C，75r/min震荡培养，每天换成软骨细胞诱导液一次。15天后收集细胞团块进行甲苯胺蓝染色，如图3B所示，紫色部分为软骨细胞。
[0034]诱导间充质干细胞团块分化所使用的成软骨细胞诱导液由高糖DMEM、胎牛血清、胰岛素、TGF-β 3、地塞米松、维生素C、IL-1 β、转铁蛋白和ΒΜΡ-6组成。其中，胎牛血清的体积分数为10%，胰岛素的浓度为5 μ g/ml, TGF-β 3的浓度为50ng/ml，地塞米松的浓度为10nmol/L，维生素C的浓度为50mg/ml，IL-1 β的浓度为4ng/ml，转铁蛋白的浓度为4mg/ml，ΒΜΡ-6 的浓度为 300ng/ml。
[0035]实施例2，诱导脂肪间充质干细胞分化成软骨细胞步骤一、多孔细胞培养板的包被
取无菌去离子水5.4 ml，浓度为30 % (W/V)的丙烯酰胺-双丙烯酰胺混合物2.0 ml，ρΗ8.8 的 1.5Μ Tris 溶液 2.5 ml，10% (W/V)过硫酸铵 0.lml，TEMED 8 μ I 充分混匀；制成1ml丙烯酰胺浓度为6% (W/V)的溶液后，迅速向孔径6.35mm，深度10.03mm的多孔培养板的每一孔中加入60 μ I上述溶液，静置待聚丙烯酰胺凝胶凝固后备用。
[0036]步骤二、脂肪间充质干细胞的分离和培养
从动物皮下获取脂肪组织，去除粘附的膜和血渍，使用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后用剪刀将脂肪组织分散，置于无菌50ml离心管内。将PBS配制的浓度为0.2%(W/V)的I型胶原酶溶液加入上述50ml离心管内，I型胶原酶溶液加入量为脂肪组织体积的5倍，于37°C消化1.5h，期间晃动离心管数次使脂肪组织充分消化。消化完成后将离心管于lOOOr/min离心5min，弃去上清液。向50ml离心管中加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基3?4ml，重悬细胞团块接种于培养瓶中，37°C恒温5% C02孵箱培养。
[0037]原代细胞培养4?5天，待细胞生长至底面积80%以上时，将细胞用0.25%胰蛋白酶进行消化，分散成单细胞，接种于新的培养瓶内，首次传代。规律换液，4?6天传代一次，培养至第三代。
[0038]步骤三、脂肪间充质干细胞团块的形成
使用胰蛋白酶消化获得上述第三代脂肪间充质干细胞。使用团块形成诱导液，重悬脂肪间充质干细胞，调整细胞浓度为I X 16个/ml ;吸取细胞悬液加入步骤一制备的多孔培养板中，每孔100 μ 1，置于37°C恒温5% (1)2孵箱培养，每天换团块形成诱导液一次。培养至第5天时，脂肪间充质干细胞形成直径约为500 μπι球形细胞团块。
[0039]本步骤三所使用的团块形成诱导液由高糖DMEM、胎牛血清、维生素C和TGF-β 3组成，其中，胎牛血清的的体积分数为10%，维生素C的浓度为50mg/ml，TGF-β 3的浓度为30ng/ml。
[0040]步骤四、脂肪充质干细胞的成软骨细胞诱导
收集脂肪间充质干细胞团块于50ml离心管中，加入成软骨细胞诱导液25ml，拧紧离心管盖，水平放置于恒温气浴摇床中，于37°C，75r/min震荡培养，每天换成软骨细胞诱导液一次。15天后收集细胞团块进行甲苯胺蓝染色。
[0041]诱导间充质干细胞团块分化所使用的成软骨细胞诱导液由高糖DMEM、胎牛血清、胰岛素、TGF-β 3、地塞米松、维生素C、IL-1 β、转铁蛋白和ΒΜΡ-6组成。其中，胎牛血清的体积分数为10%，胰岛素的浓度为10 μ g/ml，TGF- β 3的浓度为50ng/ml，地塞米松的浓度为10nmol/L，维生素C的浓度为50mg/ml，IL-1 β的浓度为5ng/ml，转铁蛋白的浓度为4mg/ml，ΒΜΡ-6 的浓度为 300ng/ml。
[0042]实施例3，成软骨细胞诱导后骨髓间充质干细胞团块修复兔关节软骨缺损
将得到的向软骨细胞诱导的骨髓间充质干细胞团块收集起来(图3A)，使用PBS清洗3遍后备用。
[0043]按实施例1中所述方法麻醉新西兰白兔，取仰卧位，于右膝关节处备皮。取内侧髌旁入路暴露膝关节股骨端，使用电动骨钻在关节滑车部位制造直径4.5mm，深度3mm的关节软骨缺损。将上述骨髓间充质干细胞团块填充至缺损部位，至接近关节面1/3处，使用纤维蛋白胶进行封闭，髌骨复位，分层缝合伤口并消毒。
[0044]三个月后处死实验动物，取完整右膝关节股骨端，观察缺损部位修复情况，如图4A所示，缺损表面光滑，与周围组织融合良好。经4%多聚甲醛固定、脱钙、石蜡包埋、切片后，进行HE染色，如图4B所示，缺损部位被软骨组织填充，其表面光滑，潮线完整。
[0045]上述观察显示，成软骨细胞诱导后的间充质干细胞团块能够有效修复关节软骨缺损。
[0046]实施例4，成软骨细胞诱导后脂肪间充质干细胞团块修复羊关节软骨缺损将得到的向软骨细胞诱导的脂肪间充质干细胞团块进行收集，使用PBS清洗后备用。
[0047]用1%戊巴比妥钠按35mg/kg静脉麻醉动物。取膝关节外侧髌旁入路，打开关节囊。将髌骨外置脱位，暴露关节软骨滑车部位，环钻造直径为6mm左右全层缺损，充分止血、冲洗，制成关节软骨缺损模型。将上述脂肪间充质干细胞团块填充至缺损部位，至接近关节面1/3处，使用纤维蛋白胶进行封闭，髌骨复位，分层缝合伤口并消毒。
[0048]24周后处死实验动物，可见缺损表面光滑，与周围组织融合良好(图5A)。经4%多聚甲醛固定、脱钙、石蜡包埋、切片后，进行HE染色，缺损部位被软骨组织填充，其表面光滑，潮线完整(图5B)。
[0049]上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
【主权项】
1.自组装间充质干细胞团块，其特征在于，通过下述方法制备: 步骤一，多孔培养板的包被 在无菌条件下，使用水凝胶包被多孔培养板； 步骤二，间充质干细胞的扩增培养 将间充质干细胞接种在包被后的培养板中，将间充质干细胞扩增培养至第三代； 步骤三，自组装间充质干细胞团块的形成 取步骤二培养的第三代间充质干细胞，用团块形成诱导液配制成间充质干细胞悬液，向步骤一包被的多孔培养板的每一孔中加入100?250 μ I间充质干细胞悬液，使每一孔中细胞数量为I X 15?I X 10 6个，每天换团块形成诱导液一次，将多孔培养板置于细胞培养箱中培养4?7天后，形成直径为500?600 μπι的间充质干细胞团块。2.根据权利要求1所述的自组装间充质干细胞团块，其特征在于，步骤一所述多孔培养板的包被方法为:在无菌条件下，向孔直径为6?7mm、孔深度为10?12mm、底部为U型的多孔培养板的每一孔中加入30?60 μ I水凝胶，待凝胶凝固后，形成包被的多孔培养板。3.根据权利要求1或2所述的自组装间充质干细胞团块，其特征在于，所述水凝胶选自琼脂糖凝胶、海藻酸钠凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、PLGA凝胶中的任一种。4.根据权利要求1所述的自组装间充质干细胞团块，其特征在于，所述水凝胶为琼脂糖凝胶，琼脂糖凝胶的浓度为I?2W/V%。5.根据权利要求1所述的自组装间充质干细胞团块，其特征在于，所述团块形成诱导液由高糖DMEM、胎牛血清、维生素C和TGF- β 3组成，其中，胎牛血清的的体积分数为10%?15%，维生素C的浓度为10?100 mg/ml, TGF-β 3的浓度为10?50 ng/ml。6.根据权利要求1所述的自组装间充质干细胞团块，其特征在于，所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、脐带血间充质干细胞中的任一种。7.根据权利要求6所述的自组装间充质干细胞团块，其特征在于，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。8.诱导权利要求1?2、4?7中任一项所述自组装间充质干细胞团块向软骨细胞的分化方法，其特征在于，将间充质干细胞团块置于50 ml离心管中，加入成软骨细胞诱导液10?25 ml，密封离心管管口并横置于恒温气浴摇床中以75 r/min震荡培养，每天换成软骨细胞诱导液一次，连续诱导15天后收集细胞团块。9.根据权利要求8所述的诱导分化方法，其特征在于，所述成软骨细胞诱导液由高糖DMEM、胎牛血清、胰岛素、TGF-β 3、地塞米松、维生素C、IL-1 β、转铁蛋白和ΒΜΡ-6组成，其中，胎牛血清的的体积分数为10%?15%，胰岛素的浓度为I?10 μ g/ml，TGF-f3 3的浓度为10?50 ng/ml，地塞米松的浓度为10?150 nmol/L，维生素C的浓度为20?70 mg/ml,IL-1 β的浓度为I?6ng/ml，转铁蛋白的浓度为4?8 mg/ml,BMP-6的浓度为300?500ng/mlο10.如权利要求1?2、4?7中任一项所述的自组装间充质干细胞团块在关节软骨缺损修复中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种自组装间充质干细胞团块的制备、诱导分化及应用。间充质干细胞团块通过下述方法制备：1）在无菌条件下，使用水凝胶包被多孔培养板；2）将间充质干细胞扩增培养至第三代；3）用团块形成诱导液将第三代间充质干细胞制成细胞悬液，向包被的多孔培养板的每一孔中加入细胞悬液，使每一孔中细胞数量为1×105～1×106个，每天换团块形成诱导液一次，将多孔培养板置于细胞培养箱中培养，形成直径为500～600μm的间充质干细胞团块。本发明无需使用支架材料实现间充质干细胞的高密度三维培养，增加成软骨细胞诱导间充质干细胞的均一性，可直接应用于关节软骨缺损修复。
【IPC分类】A61K35/28, C12N5/0775, A61P19/02, C12N5/077
【公开号】CN104962517
【申请号】CN201510453579
【发明人】魏菁
【申请人】西安芙金细胞科技有限公司
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年7月29日