变色，厚13 - 26ym，细胞黄色至澄褐色，厚壁，6-12X5-7ym;皮下层 为角胞组织，在K0H中不变色，细胞无色至淡黄色，薄壁，5 - 9X5 - 7ym;子囊壳下层为表 层组织，细胞无色，薄壁，（8 - ) 12 - 25 ( - 30)X(6 - ) 8 - 10 ( - 12)ym;子座基部为交错丝 组织，菌丝无色，厚壁，宽（2-)3-5(-6)ym。子囊壳埋生，瓶状或球形，210 - 289X131 -17川111鹿壁黄色至澄色，侧壁厚（4-)5-10(-12)^111，底部壁厚（6-)8-11(-14)^111; 孔口高巧4 - ) 62 - 79 ( -lowym，顶部宽39 - 53ym，平行或高于子座表面18 ( - 31)ym。 子囊圆柱状，基部渐窄，（86 -)92 - 101(- 105)X6 - 6. 5(- 7. 2)ym，柄长 13- 18(-20) ym。子囊抱子绿色，表面具扼，二态型，远基分子囊抱子近球形或楠球形，（3-)4-5(-6)X(3.5-)4-5(-5.5)ym，l/wl.0-1.2;近基分子囊抱子模形至圆柱形，（4-)4.5-5(-6)X3-3. 5(-4)ym，l/wl.3 - 1.5(图 1 至图 5)。
[0化4]在CMD培养基上，生长速度较快，15°C、25°C和30°C培养3天菌落半径分别为18-20mm，40 - 50mm和24 - 28mm;25°C时菌落3 - 4天铺满平板。菌落轮廓不规则，边缘波状或 叶状，气生菌丝稀疏。产抱簇（图9)初期白色，3 - 4天变为绿色，致密；瘤状突起垫状或半 球形，直径0. 5 - 4mm，高0. 5 - 2mm。2天后产生分生抱子梗（图10)，ve;rticillium-like， 菌丝宽2. 8 - 3. 5ym;瓶梗单生或3次轮生，烧瓶形，化-)8 - 10( - 12.WX2 - 3ym，1/ w(2-)3-4(-5)。分生抱子近球形（图11)，楠球形至卵形，绿色，表面平滑，（2.5-)3-4(-5. 5)X2. 5-3(-4)ym，l/w1.0-1.3。在CMD培养基上25°C条件培养7天的菌落形 态见图6。
[0化5] 在PDA培养基上，生长速度较快，15 °C、25 °C和30 °C培养3天菌落半径分别为 15 - 17mm，31 - 35mm和18 - 22mm;25°C时菌落3 - 4天铺满平板。气生菌丝大量，稀薄，形成 福射束；2 - 3天出现大量产抱簇和绿色分生抱子。在PDA培养基上25°C条件培养7天的菌 落形态见图7。
[0化6] 在SNA培养基上，生长速度稍慢，15 °C、25°C和30 °C培养3天菌落半径分别为 10 - 13mm，21 - 25mm和15 - 18mm。在W上S种培养基上，菌落均不产生色素，自溶现象不明 显，无特殊气味。在SNA培养基上25°C条件培养7天的菌落形态见图8。
[0057]依据上述形态学特征，该种与Trichodermaalni、T.brunneoviride、T.epimyces和T.par巧imyces均具有红栋色子座和绿色子囊抱子，其中与T.alni最为相似，但T.alni 的子囊较小[(67 - ) 80 - 96 ( - 113)X(4. 0 - ) 4. 5 - 5. 5 ( - 6. 5)ym]，瓶梗较长[巧-)9-15(-18)ym]，子座在K0H中颜色改变，通常WAlnusglutinosa为基物，因此，拟将该菌株 处理为新种，需进一步提供分子生物学证据。
[0化引（二）分子生物学鉴定值NA序列测定）：
[0化9] (1)真菌基因组的提取；采用CTAB法提取真菌基因组。
[0060] (2)ITS、ten和巧b2基因片段的扩增及测序：
[0061]PCR扩增引物和测序引物见表1 (ITS基因的测序引物与扩增引物相同），PCR反应 体系和反应条件分别见表2。反应结束后取2. 5y1扩增产物进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳检 巧。，紫外凝胶成像系统拍照、分析，ABI3730XL测序仪对扩增产物进行双向测序。
[006引表1PCR扩增引物和测序引物
[0063]
[0064] 表2PCR反应体系及反应条件
[00化]
[0066] 做序列分析
[0067] 利用Clustal X程序和Bioedit等软件对测序结果进行编辑与序列分析。
[0068] 用引物ITS4、ITS5测序拼接后得到的序列如SEQIDNO. 1所示。
[0069] 用引物RPB2-F、RPB2-R测序拼接后得到的序列如SEQIDNO. 2所示。
[0070] 用引物TEF-1和TEF-2测序拼接后得到的序列如SEQIDNO. 3所示。
[0071] 对序列进行比对分析，发现该种序列与木霉属内的任何已知种都不同，尤其是与 形态学最相似的Trichodermaalni的序列有很大差异。形态学特征和分子生物学特征的 综合分析表明，菌株P-T8155为一新种，命名为褐红木霉（Trichodermaru化brunneum)。
[0072] 实施例3木霉菌株的保藏
[0073] 将培养物保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏日期： 2015年4月1日，保藏编号为CGMCCNo. 10646。
[0074] 实施例4对時培养及重寄生作用观察
[0075] 在PDA培养基上活化培养褐红木霉P-T8155和五种祀标植病菌（灰葡萄抱、核盘 菌、瓜果腐霉、辣椒疫霉、立枯丝核菌），然后分别在菌落边缘取直径为5mm菌块，在直径线 上距两侧皿缘15mm的对称位置分别接种褐红木霉P-T8155和植病菌，同时，W只接种植病 菌作为空白对照，每处理设置3次重复，25°C恒温培养，逐日观察菌株的生长情况。待对照 长满培养皿时，测量祀标菌的对照生长量（菌落半径）和处理生长量（接种木霉菌后的抑 制生长半径），计算抑菌率。
[0076] 抑菌率（％ )=(对照生长量-处理生长量）/对照生长量X 100%
[0077] 采用载玻片培养法，用灭菌的解剖刀取15X10mm的PDA薄膜，置于灭菌的载玻片 中央，然后挑取等量褐红木霉P-T8155和植病菌的菌丝分别接种于PDA膜两平行边的中 点，25°C恒温保湿培养，逐日镜检观察两个菌的相互作用，并利用光学显微镜拍摄记录重寄 生现象。
[007引实施结果；连续30d的培养观察发现，褐红木霉P-T8155具有很强的生境竞争能 力，生长速度快，能迅速抢占有限的空间和营养，在植病菌表面产生大量的分生抱子，消解 植病菌菌丝，逐渐覆盖并最终导致植病菌死亡。褐红木霉P-T8155对五种植病菌抑菌作 用均很强，几乎能够完全抑制灰葡萄抱和瓜果腐霉的生长，对辣椒疫霉的抑菌效果也很强， 平均抑菌率为94%，对立枯丝核菌和核盘菌的抑菌效果稍差，平均抑菌率分别为88%和 85%，详见表3、图12至图22。
[0079] 表3褐红木霉P-T8155对五种植病菌的离体抑菌率
[0080]
[0081] 载玻片培养法结合光学显微镜对褐红木霉P-T8155重寄生能力观察发现，褐红 木霉P-T8155能够重寄生于灰葡萄抱、核盘菌、瓜果腐霉和立枯丝核菌，能够识别并趋向 植病菌菌体生长，并W菌丝卷须的吸附结构附着并逐渐缠绕于植病菌的菌丝上，然后通过 分泌的各种酶类及次生代谢物质溶解寄主细胞壁，产生溶解位点或侵入孔，侵入寄主菌丝 并在其内生长，最终导致植病菌菌丝凹陷、崩溃死亡，但是褐红木霉P-T8155对辣椒疫霉 的重寄生作用不明显。图23至26显示了光学显微镜下观察到的褐红木霉P-T8155的重 寄生作用。
[0082] 实施例5褐红木霉P-T8155产生的非挥发性物质活性测定
[0083] 采用圆盘滤膜法，在25 °C恒温培养3d的褐红木霉P-T8155的尖端菌丝处取直径 为5mm的菌块，然后将其接种于铺有玻璃纸的PDA平板内，置于25°C恒温培养，待木霉长满 培养皿时去除玻璃纸。在25°C恒温培养3d的植病菌的尖端菌丝处取直径为5mm的菌块， 将其分别接种于去除了玻璃纸的PDA培养基内，同时接种一个等质等量的植病菌块至新鲜 的PDA培养基内作为对照，每处理设置3次重复，然后分别置于25°C恒温培养（12小时光， 12小时暗），逐日观察记录菌落的生长状况，待对照长满培养皿时，测量祀标菌的对照生长 量（菌落直径）和处理生长量（接种木霉菌后的抑制生长直径），计算抑菌率。
[0084] 抑菌率（％ )=(对照生长量-处理生长量）/对照生长量X100%
[0085] 实施结果：褐红木霉P-T8155在生长过程中逐渐产生非挥发性物质，该些非挥 发性物质对五种植病菌的生长均存在不同程度的抑制作用，与对照相比，植病菌的生长直 径均减小，其中瓜果腐霉的菌丝几乎不能萌发或只有少量萌发，平均抑菌率为98%。对核盘 菌的抑菌效果次之，平均抑菌率为59%，详见表4,图27至图31。
[0086] 表4褐红木霉P-T8155非挥发性物质对五种植病菌的离体抑菌率
[0087]
[008引从农业生产角度讲，褐红木霉P-T8155菌株可迅速占据该五种植病菌的入侵位 点，降低他们侵入植株的机会，从而达到抑菌防病的效果，说明该木霉菌具有潜在的、可开 发的生物防治用途。
【主权项】
1. 一种褐红木霉（Trichoderma rufobrunneum)P_T 8155,保藏在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10646。2. 权利要求1所述的褐红木霉P-T 8155的分生孢子或菌丝体。3. 权利要求1所述的褐红木霉P-T 8155在抑制灰葡萄孢、核盘菌、瓜果腐霉、辣椒疫霉 和立枯丝核菌上的用途。4. 权利要求1所述的褐红木霉P-T 8155在重寄生灰葡萄孢、核盘菌、瓜果腐霉和立枯 丝核菌上的用途。5. -种产品，其活性成分为权利要求1所述的褐红木霉P-T 8155,所述产品具有如下 至少一种用途： 1) 抑制灰葡萄孢、核盘菌、瓜果腐霉、辣椒疫霉和立枯丝核菌上的用途； 2) 在重寄生灰葡萄孢、核盘菌、瓜果腐霉和立枯丝核菌上的用途。
【专利摘要】本发明涉及一株褐红木霉(Trichoderma rufobrunneum)P-T 8155，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10646。本发明的褐红木霉P-T 8155生境适应性强、生长速度快、产孢量大，可用于抑制灰葡萄孢、核盘菌、瓜果腐霉、辣椒疫霉和立枯丝核菌，并重寄生灰葡萄孢、核盘菌、瓜果腐霉和立枯丝核菌的菌丝，迅速、有效将其降解，还可产生非挥发性物质抑制上述植病菌。本发明的褐红木霉具有潜在的、可开发的生物防治价值。CGMCC No.1064620150401
【IPC分类】A01P3/00, C12R1/885, C12N1/14, A01N63/04
【公开号】CN104988069
【申请号】CN201510166631
【发明人】庄文颖, 秦文韬, 朱兆香, 宋霞
【申请人】中国科学院微生物研究所
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年4月9日