一种获得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物转基因技术领域，具体是一种获得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材 料的方法。
【背景技术】
[0002] 蓖麻是一种用途很广、经济效益很大的非食用油料作物。蓖麻种子用于榨油，种 子含油量在50%左右，蓖麻油及其深加工后产品的用途非常广泛，已经涉及到生产生活的 各个方面，因此，对蓖麻油的生物合成过程进行深入的研究，努力提高种子中蓖麻油（即粗 脂肪）含量具有非常显著的经济价值。蓖麻油的主要成分为高级脂肪酸的甘油三酸酯，蓖 麻油中有8种脂肪酸，棕榈酸、硬脂酸、花生酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生一烯酸和蓖麻油 酸。蓖麻油酸是蓖麻粗脂肪的主要成分，也是蓖麻油重要产品-癸二酸的原料。
[0003] 在中国，由于蓖麻产量低、收购价格低，导致蓖麻种植面积大量萎缩，蓖麻种子供 不应求，所以蓖麻的首要育种目标一直是高产，只是在最近几年才开始注重其品质，即含油 率，但是也只是以百粒重、种仁率、种仁中粗脂肪含量为指标的较多，少数品种提到粗脂肪 中蓖麻油酸的含量，这种评价不够直观。
[0004] 在国外，蓖麻油生物合成的相关研究起步较早。关于蓖麻油的生物合成过程，目前 已逐渐被Jiann-Tsyh Lin等人研究清楚，对蓖麻油的生物合成过程及其所涉及的关键酶的 研究相对较多，主要集中在油酰基-12-羟基化酶（leoyl-12-hydroxylase)，该酶催化2-油 酰基卵磷脂（2-oleoyl-PC)形成2-蓖麻油酰基-卵磷脂（2-Ricinoleoyl-PC)，也有报道通 过基因工程手段将该酶的基因转到其他植物中来验证酶功能的研究。尚未见通过转基因的 方式获得蓖麻油含量提高的蓖麻新材料的研究。
[0005] 磷脂酶C基因，也是功能基因，是蓖麻油生物合成过程中的关键酶的基因。磷脂酶 C在蓖麻油生物合成过程中催化2-油酰基卵磷脂（2-oleoyl-PC)形成1-酰基-2-油酰基 甘油（l-Acyl-2-oleoyl-sn-glycerol)，该酶被抑制后，可阻止非羟基脂肪酸进入三酰基甘 油，从而增加种子中蓖麻油酸的含量。但是，目前尚未见使蓖麻内源的磷脂酶C基因沉默， 提高种子内蓖麻油酸含量，从而提高蓖麻种子中蓖麻油含量的报道。
[0006] 与本发明相关的现有技术一：关于蓖麻转基因方面的研究，国外只有两例成功报 道，Sujatha等于2005年首次报道用农杆菌介导法获得了转结构基因的蓖麻植株，Malathi 等于2006年报道获得了转功能基因，即抗虫基因的蓖麻植株。国内，有3例进行蓖麻功能 基因的克隆和载体构建研究。高颖等克隆了蓖麻抗盐碱基因PAL ;黄凤兰等和陈永胜等分 别克隆了毒蛋白A链基因，并构建了用于共抑制的重复表达载体和用于RNAi的表达载体， 并对蓖麻进行了遗传转化；刘鹏等克隆了蓖麻矮化相关基因一一细胞色素P450基因，构建 了该基因的RNAi表达载体，并对蓖麻进行了遗传转化。
[0007] 现有技术一的缺点：国外两例蓖麻转基因成功的案例，都是使得外源基因（所转 的基因）在蓖麻这一植物体内表达，并且所转的基因一个是结构基因，另一个为抗虫基因。 国内进行蓖麻基因克隆和载体构建的研究，涉及的是功能基因，包括蓖麻抗盐碱基因PAL 斜体、毒蛋白A链基因、矮化相关基因P450。目前，尚未见通过转基因的方式获得蓖麻油酸 含量提高的蓖麻新材料的研究。
[0008] 与本发明相关的现有技术二：由于蓖麻育种的首要目标一直是高产，对品种的品 质即含油量的研究一直被重视得不够。在蓖麻品种审定时，多数品种以亩产、百粒重、种仁 率、种仁中粗脂肪含量为指标的较多，少数品种提到粗脂肪中蓖麻油酸的含量。在作物常规 育种中，通常通过单株选择的方式获得综合性状良好的材料，再利用这样的材料进行杂优 利用。在蓖麻的杂优利用过程中，首先注重的是产量性状，通常选择高产性状好、配合力良 好，并且含油量高的材料，再利用这样的材料进行杂优利用获得新品种。
[0009] 现有技术二的缺点：该技术对提高种子中蓖麻油含量的速度较慢，效果是逐渐才 能表现出来的。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于提供一种针对性强、效果显著的获得蓖麻油酸含量提高的蓖麻 新材料的方法，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0011] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0012] -种获得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法，具体步骤如下：
[0013] (1)分离磷脂酶C基因的两个片段；
[0014] (2)构建含有磷脂酶C基因的RNAi植物表达载体；
[0015] (3)含有磷脂酶C基因的RNAi植物表达载体转化农杆菌；
[0016] (4)用农杆菌介导法对蓖麻子叶节进行遗传转化，获得转基因抗性植株；
[0017] (5)对转基因抗性植株进行检测。
[0018] 作为本发明进一步的方案：所述步骤（1)中分离磷脂酶C基因的两个片段的方法， 具体步骤如下：
[0019] 1)用试剂盒法提取蓖麻种子中的总RNA ;
[0020] 2)用逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA;
[0021] 3)用Primer-premier5. 0软件设计引物：据NCBI中发布的蓖麻磷脂酶C基因 的mRNA序列号XM_002511121. 1，利用Primer-premier5. 0软件设计两对引物，分别命名 为CIS与C1X、C2S与C2X，应用DNAMAN软件分析基因序列内部的限制性酶切位点，并根据 pMD18-T-Simple-Vector、pHANNIBAL、pBI-121质粒上的多克隆位点的情况，以及引物前端 加酶切位点和保护碱基的原则，设计各条引物序列；
[0022] 4)用降落PCR的方法分离磷脂酶C基因的两个特异性片段；
[0023]5)用胶回收试剂盒回收特异性片段；
[0024] 6) Cl、C2特异性片段分别与pMD18-T-Simple-Vector克隆载体连接；
[0025] 7)连接产物转化大肠杆菌感受态细胞；
[0026] 8)用PCR和酶切的方法筛选大肠杆菌阳性克隆；
[0027] 9)大肠杆菌阳性克隆提交生物公司进行序列测序：测序结果表明蓖麻磷脂酶C基 因的Cl、C2片段碱基长度分别是803bp、458bp。
[0028] 作为本发明进一步的方案：所述步骤（2)中用逆转录试剂盒将mRNA逆转录成 cDNA的方法，具体步骤如下：
[0029] 1)用限制性内切酶和胶回收试剂盒从克隆载体上分别酶切、回收磷脂酶C基因两 个特异性片段；
[0030] 2)用限制性内切酶将内含子从pHANNIBAL载体上切下，用胶回收试剂盒回收；
[0031] 3)用限制性内切酶将植物表达载体质粒pBI-121线性化；
[0032] 4)用连接酶将磷脂酶C基因的两个特异性片段、内含子和pBI-121连接在一起；
[0033] 5)连接产物转化大肠杆菌感受态细胞；
[0034] 6)用PCR和酶切的方法筛选大肠杆菌阳性克隆：设计的引物上游在pBI-121的 35S启动子上，下游则在内含子和C1片段上，引物分别命名为NS1和NX1、C1S1和C1X1;
[0035] 7)大肠杆菌阳性克隆提交生物公司进行序列测序：经测序，证明所构建的含有磷 脂酶C基因的RNAi植物表达载体pBI-Cl-IN-C2结构正确。
[0036] 作为本发明再进一步的方案：所述步骤（4)获得转基因抗性植株的方法，具体步 骤如下：
[0037] 1)蓖麻子叶节预培养；
[0038] 2)用活化好的含有磷脂酶C基因RNAi表达载体质粒的农杆菌浸染蓖麻子叶节；
[0039] 3)农杆菌与子叶节共培养；
[0040] 4)用除菌剂除去子叶节上的农杆菌；
[0041] 5)用卡那霉素对子叶节进行抗性筛选；
[0042] 6)转基因抗性苗进行驯化移栽，得到转基因抗性植株的种子。
[0043] 作为本发明再进一步的方案：所述步骤（5)中对转基因抗性植株进行检测的方 法，具体步骤如下：
[0044]1)分子检测包括：DNA水平对转基因抗性植株叶片采用PCR检测，RNA水平对种子 采用荧光定量PCR检测，蛋白质水平对种子采用Western-Blot检测；
[0045]2)生物学检测：测定转基因抗性植株和对照非转基因植株种子中蓖麻油酸含量 和总蓖麻油含量，步骤包括：用乙醚萃取蓖麻籽油；油脂皂化后的脂肪酸采用三氟化硼-甲 醇溶液进行甲酯化；利用气相色谱_质谱-计算机联用技术分离、鉴定蓖麻油酸含量和总蓖 麻油含量。
[0046] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0047] 本发明通过RNAi技术，沉默蓖麻油生物合成过程中的关键酶基因-磷脂酶C基因 的表达，阻止非羟基脂肪酸进入三酰基甘油，增加种子中蓖麻油酸含量，针对性强，从而进 一步提高蓖麻种子中蓖麻油含量。提高蓖麻种子中蓖麻油含量的速度快，效果显著，种子 中粗脂肪含量为53. 61-56. 15%，提高了 2.54%;蓖麻油酸含量为46. 33-49. 31%，提高了 2. 98%〇
【附图说明】
[0048] 图1为本发明中磷脂酶C基因RNAi表达载体的构建示意图。
[0049] 图2为本发明中从蓖麻种子中提取蓖麻总RNA的结果示意图。
[0050] 图3为本发明中mRNA逆转录成cDNA的电泳检测结果示意图。
[0051] 图4为本发明中蓖麻磷脂酶C基因的片段Cl、C2的PCR扩增结果示意图。
[0052] 图5为本发明中重组质粒pMD-Cl的PCR结果示意图。
[0053] 图6为本发明中重组质粒pMD-Cl的Xbal、Kpnl双酶切结果示意图。
[0054] 图7为本发明中重组质粒pMD-C2的PCR结果示意图。
[0055] 图8为本发明中重组质粒pMD-C2的SmaI、HindIII双酶切结果示意图。
[0056] 图9为本发明中用EcoRI、HindIII将内含子从pHANNIBAL上酶切的结果示意图。
[0057] 图10为本发明中用SmaI、XbaI对表达载体pBI-121双酶切的结果示意图。
[0058] 图11为本发明中RNAi表达载体pBI-Cl-IN-C2的PCR检测结果示意图。
[0059] 图12为本发明中RNAi表达载体pBI-Cl-IN-C2酶切检测结果示意图。
[0060] 图13为本发明中RNAi表达载体pBI-Cl-IN-C2转化农杆菌后的PCR鉴定结果示 意图。
[0061] 图14为本发明中分子检测时DNA水平对转基因抗性植株叶片采用PCR检测示意 图。
[0062] 图15为本发明中分子检测时RNA水平对种子采用荧光定量PCR检测示意图。
[0063] 图16为本发明中分子检测时蛋白质水平对种子采用Western-Blot检测示意图。
【具体实施方式】
[0064] 下面结合【具体实施方式】对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
[0065] 请参阅图1-16, 一种获得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法，具体步骤如 下：
[0066] (1)分离磷脂酶C基因的两个片段：
[0067]1)用试剂盒法提取蓖麻种子中的总RNA :所用蓖麻材料为2129品系，从2129品系 种子中提取蓖麻总RNA的结果见图2 ;
[0068] 2)用逆转