据Li等2014年报道的方法评价黑胚病抗性（参考文献：Li Q Y，Qin Z，Jiang Y M, Shen C C, Duan Z B, and Niu J S. Screening wheat genotypes for resistance to black point and the effects of diseased kernels on seed germination. Journal of Plant Diseases and Protection，2014，121(2):79_88.):无病粒，属于免疫，计为 M;黑胚 率为0. 1~1.9%，属于高抗，计为HR;黑胚率为2.0~4. 9%，属于抗，计为R;黑胚率为 5. 0~14. 9 %，属于轻感，计为hS ;黑胚率为5. 0~30. 0 %，属于感，计为S ;黑胚率> 50 %， 属于高感，计为HS。
[0072] 大田种植情况下的鉴定结果与抗性评价结果详见表3,表3的结果表明：三年中， 用本发明方法鉴定的四个品种在不同年度、不同实验地点对B. sorokiniana叶枯病与黑 胚病的抗性评价结果一致；而自然环境条件下，四个品种的抗性评价在年度间不一致，如 LWX-285的黑胚率在三年间变化较大，抗性评价为高抗（2013年）或轻感（2014-2015年）， 表明由于不同年度间环境有变化，若采用自然发病率作为鉴定方法，将导致对同一小麦品 系抗性评价出现偏差；而采用本发明的鉴定方法，则在三年中的鉴定结果一致，保证了抗性 评价的一致性，另外，接菌鉴定的发病程度比自然情况严重，表明如果给予适宜环境，一些 在自然条件下鉴定为抗病的材料可能不是真正抗病的，所以用本发明方法采用花后6天接 菌，硫酸纸袋与塑料袋交替使用进行杂菌隔离与保湿，筛选出的抗病品种的结果更可靠。
[0073] 实施例3 :与实施例1基本相同，不同之处在于：
[0074] 步骤c中：将步骤b制备的B. sorokiniana孢子悬浮液加入吐温-20摇勾，吐 温-20的加入量占Bipolaris sorokiniana孢子悬浮液体积的0. 02%，摇勾后用喷壶将其 均匀喷洒在小麦穗部及旗叶（对照CK喷洒灭菌蒸馏水）。
[0075] 实施例4 :与实施例2基本相同，不同之处在于：
[0076] 步骤c中：将步骤b制备的B. sorokiniana孢子悬浮液加入吐温-20摇勾，吐 温-20的加入量占Bipolaris sorokiniana孢子悬浮液体积的0. 02%，摇勾后用喷壶将其 均匀喷洒在小麦穗部及旗叶（对照CK喷洒灭菌蒸馏水）。
【主权项】
1. 一种联合鉴定小麦对小麦根腐平脐懦孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与叶枯病 抗性的方法，其特征在于，所述联合鉴定方法包括以下步骤： a、 小麦根腐平脐懦孢Bipolaris sorokiniana的保存：将实验室分离的小麦根腐平脐 懦孢Bipolaris sorokiniana单孢菌株置于马铃薯葡萄糖琼脂PDA试管斜面培养基上，于 4 °C冰箱保存备用； b、 小麦根腐平脐懦孢Bipolaris sorokiniana的孢子悬浮液的制备：将步骤a中4°C冰 箱保存的小麦根腐平脐懦孢Bipolaris sorokiniana切成0. 3cm2的块状，接种于马铃薯葡 萄糖琼脂PDA培养基上，在25°C条件下暗培养，培养后用载玻片从培养好的菌落上将孢子 刮下，采用蒸馏水冲洗、纱布过滤，得到孢子悬浮液，用血球计数板检测孢子悬浮液的浓度， 调整至孢子浓度为3X IO5个/mL，配置得到的孢子悬浮液放在溶液瓶中于4°C冰箱保存备 用； c、 喷洒接菌、套袋保湿：小麦抽穗后，采用硫酸纸袋将小麦穗部及旗叶套袋；在小麦开 花后第6天，将步骤b制备的Bipolaris sorokiniana孢子悬浮液摇勾，然后均勾喷洒在小 麦穗部及旗叶，喷洒后采用塑料袋将小麦穗部及旗叶罩住保湿，保湿7天后换套硫酸纸袋； d、 鉴定结果记录：接菌后第15~18天记录叶片病斑面积占总叶片面积的百分比即为 病斑面积百分率，作为小麦叶枯病抗性的评价指标；小麦收获后晾晒干，手工脱粒，统计黑 胚籽粒占籽粒总数的百分比即为黑胚率，作为小麦黑胚病抗性的评价指标； e、 抗病性评价：根据步骤d记录所得病斑面积百分率和黑胚率来同时评价小麦对小麦 根腐平脐懦孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与叶枯病的抗性。2. 根据权利要求1所述的联合鉴定小麦对小麦根腐平脐懦孢Bipolaris sorokiniana 黑胚病与叶枯病抗性的方法，其特征在于，马铃薯葡萄糖琼脂PDA的配制方法： 首先准备好原料马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g和自来水lOOOmL，自然pH ;将 马铃薯洗净去皮切成小块，水沸后放入煮10~15分钟，然后用四层纱布过滤、除掉土豆 块，加入准备的葡萄糖和琼脂粉，继续加热搅拌混匀，冷却后再补足水分至1000 mL ;分装 至15 X 150mm试管与250mL三角瓶中，121 °C灭菌20分钟后取出；试管摆斜面，冷却后用于 Bipolaris sorokiniana的保存；三角瓶中的培养基倒入9cm培养皿中，冷却后用于培养 Bipolaris sorokiniana〇3. 根据权利要求1所述的联合鉴定小麦对小麦根腐平脐懦孢Bipolaris sorokiniana 黑胚病与叶枯病抗性的方法，其特征在于：步骤b中Bipolaris sorokiniana在25°C条 件下暗培养9~12天，培养后菌丝基本布满培养皿，颜色深黑，产生大量孢子时取出培养 皿，用灭菌载玻片将孢子轻轻刮下，用蒸馏水冲洗培养皿2~3次，并用四层纱布过滤得到 B. sorokiniana孢子悬浮液。4. 根据权利要求1所述的联合鉴定小麦对小麦根腐平脐懦孢Bipolaris sorokiniana 黑胚病与叶枯病抗性的方法，其特征在于：步骤c中将步骤b制备的Bipolaris sorokiniana孢子悬浮液中加入吐温-20摇勾，吐温-20的加入量占Bipolaris sorokiniana孢子悬浮液体积的0. 02%，然后均勾喷洒在小麦穗部及旗叶。5. 根据权利要求1所述的联合鉴定小麦对小麦根腐平脐懦孢Bipolaris sorokiniana 黑胚病与叶枯病抗性的方法，其特征在于：步骤e中所述根据步骤d记录所得病斑面积百分 率和黑胚率来同时评价小麦对小麦根腐平脐懦孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与叶枯病 的抗性，其具体鉴定方法为： 采用6级分类法评价小麦品种对叶枯病抗性：0级无病斑，属于高抗，计为HR ; 1级的病 斑面积为0. 1~1. 9%，属于抗，计为R ;2级的病斑面积为2. O~9. 9%，属于中抗，计为MR ; 3级的病斑面积为10. 0~49. 9%，属于中感，计为MS ;4级的病斑面积> 50. 0%属于感，计 为S ;5级全叶干死，属于高感，计为HS ; 评价黑胚病抗性的方法：无病粒，属于免疫，计为M ;黑胚率为0. 1~1. 9%，属于高抗， 计为HR ;黑胚率为2. 0~4. 9 %，属于抗，计为R ;黑胚率为5. 0~14. 9 %，属于轻感，计为 hS ;黑胚率为5. 0~30. 0%，属于感，计为S ;黑胚率> 50%，属于高感，计为HS。
【专利摘要】本发明公开了一种联合鉴定小麦对B.sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性的方法。首先将4℃保存的B.sorokiniana单孢菌株切成块状，接种于PDA培养基上暗培养，培养后将孢子刮下，冲洗、纱布过滤，得到孢子悬浮液，调整孢子浓度；小麦抽穗后，将穗部及旗叶套袋；开花后第6天，将所得B.sorokiniana孢子悬浮液摇匀，喷洒在穗部及旗叶，套袋、保湿；接菌后记录病斑面积百分率和黑胚率，根据记录结果来同时评价小麦对B.sorokiniana黑胚病与叶枯病的抗性。本发明鉴定方法与大田自然发病率鉴定相比，提高了鉴定结果的准确性与可靠性，与两种病害分开鉴定相比，大大提高了鉴定的效率。
【IPC分类】C12Q1/04
【公开号】CN105132517
【申请号】CN201510539645
【发明人】李巧云, 倪永静, 姜玉梅, 牛吉山, 于东艳, 朱欣欣
【申请人】河南农业大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年8月28日